Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf für die gerichtete Entwicklung viraler Proteasen in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung eines oberflächendisplaybasierten Selektionssystems. Es beschreibt das Design der DNA-Insert-Bibliothek und Substratkassetten, Elektroporation, die für eine hohe Transformationseffizienz optimiert ist, fluoreszenzaktivierte zellbasierte Auswahl für Proteasespaltung sowie die Sequenzierung angereicherter Varianten.
Gerichtete Evolution ahmt den natürlichen Evolutionsprozess in einer schnellen, kontrollierten Laborumgebung nach, um Proteine mit wünschenswerten Funktionen oder Eigenschaften zu entwickeln. Das Screening eines großen Pools mutanten-proteinkodierender Gene ermöglicht die funktionelle Auswahl gewünschter Varianten für Anwendungen in Biotechnologie, Medizin und synthetischer Biologie. Mit diesem Protokoll führen wir eine gerichtete Evolution in Saccharomyces cerevisiae durch, um Proteasevarianten mit hoher Spezifität für eine nicht-native Substratsequenz zu entwickeln. Wir zeigen diese Proteasevarianten auf der Hefezelloberfläche, um die Auswahl der gewünschten Varianten mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) über mehrere Anreicherungsrunden zu erleichtern. Vier Schlüsselelemente der Substratkassette werden gemeinsam mit der Proteasebibliothek exprimiert: ein Fusionsprotein, das aus (i) der Hefeadhäsionsrezeptor-Untereinheit Aga2, (ii) Selektions- und (iii) Gegenselektionssubstratsequenzen, (iv) Epitop-Tag-Sequenzen und einer optionalen endoplasmatischen Retikulum (ER) Rückrufsignalsequenz besteht. Hefezellen, in denen nur die Selektionssubstratsequenz gespalten ist, werden mittels mehrfarbiger FACS über fluoreszierende (phycoerythrin/fluorescein isothiocyanat-markierte) Antiepitopen-Antikörper isoliert. Hier geben wir Details zum optimierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung einer Protease-Evolutionskampagne, einschließlich Design der DNA-Insert-Bibliothek und Substratkassettendesigns, Hefezellelektroporation mit hoher Transformationseffizienz (bis zu 109Transformanten pro Mikrogramm DNA), FACS-basierter Selektion, Anreicherung und Sequenzierung evolvierter Varianten. Wir demonstrieren unser Directed Evolution-Protokoll, indem wir die Nuklearinklusion A-Protease (TEVp) des Tabak-Etch-Virus von der Spaltung ihrer natürlichen Substratsequenz ENLYFQ↓S bis zur Spaltung einer neuen Sequenz, ENLYFE↓S, entwickeln.
Cysteinproteasen der Familie Potyviridae, insbesondere die nuklearen Inklusionsproteasen A (NIa), stellen eine weitgehend ungenutzte Quelle sequenzspezifischer Endopeptidasen dar. Mit mehr als 3.800 charakterisierten Familienmitgliedern spalten NIa-Proteasen eine eigenständige Substratsequenz von sieben Aminosäuren. Die Potoveral-Familie bietet eine vielfältige Auswahl an Proteasen für die Entwicklung programmierbarer Proteinkontrollsysteme, den Aufbau orthogonaler proteasenbasierter genetischer Schaltkreise und die Entwicklung sequenzspezifischer biotechnologischer Werkzeuge 1,2
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Alle Experimente mit rekombinanter S. cerevisiae wurden gemäß den Richtlinien und Verfahren des Institutional Biosafety and Chemical Safety Committee der University of Texas at Dallas durchgeführt. Rekombinante Hefestämme wurden gemäß etablierten institutionellen mikrobiologischen Praktiken unter Biosicherheits-Level-1-Level-1 (BSL-1)-Eindämmung behandelt. Elektroporation, Kultur und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurden gemäß genehmigten institutionellen Biosicherheitsverfahren durchgeführt. Hefekulturen und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden gemäß institutionellen Richtlinien dekontaminiert und als biol....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ein effizienter Bibliotheksaufbau ist entscheidend, um eine ausreichende Abdeckung des mutationalen Raums sicherzustellen. Um den Verlust seltener funktionaler Varianten zu vermeiden, sollte die Anzahl der Transformanten mindestens 10× bis 100 × der theoretischen Bibliotheksgröße erreichen. Da die Transformationseffizienz in S. cerevisiae von der Zellkonzentration beeinflusst wird und in frühen bis mittleren logaritimischen Zellen16 am höchsten ist, haben.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Gerichtete Evolution ist eine Hochdurchsatzmethode, die iterative Zyklen der Diversifizierung und Selektion nutzt, um Proteine mit verbesserter oder neuartiger biochemischer Funktionzu identifizieren 17. In diesem Protokoll beschreiben wir einen optimierten Workflow zur Weiterentwicklung der Protease-Substrat-Erkennung mittels eines Zelloberflächen-Anzeigesystems in S. cerevisiae. Das Oberflächenanzeigesystem ordnet die Proteaseaktivität einem nachweisbar.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Die Rohdaten, die dieses Protokoll unterstützen, einschließlich Nanopore-Sequenzierungsdateien (FASTQ), Flowzytometriedateien (FCS) sowie Quelldaten, die zur Erstellung der Abbildungen und Tabellen verwendet wurden, sowie die Plasmide pDD1523 und pDD1524, wurden in Zenodo hinterlegt und sind öffentlich verfügbar unter 10.5281/zenodo.20746804
Wir danken allen Mitgliedern des Dingal-Labors für ihre Ratschläge, Fachkenntnisse und Diskussionen. Wir danken auch dem UTD Flow Cytometry Core für die Infrastruktur und Unterstützung. Das M.B.L. wird vom Eugene McDermott Graduate Fellowship der UTD unterstützt. Diese Forschung wurde durch einen UTD Startup Fund und National Institutes of Health-NIGMS-Stipendien für das Labor von P.C.D.P.D. (R35GM150967) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| 10 mM dNTP-Mix | NEB | N0447S | PCR-Reaktionen (Tabellen 1, 3) |
| 10X PBS, pH 7,4 | Fisher | BP3994 | Färbepufferbasis (Schritte 3.2–3.3) |
| 5X Q5-Reaktionspuffer | NEB | B9027S | Wird separat verkauft; auch in Q5-Polymerase enthalten |
| Agar, Bacto | BD Difco | 281230-500g | SDCAA-Agarplatten (Tabelle 5); 15 g/L |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | Gelelektrophorese |
| Anti-FLAG PE-Antikörper | BioLegend | 637309 | FACS-Färbung; PE-konjugiertes anti-FLAG |
| Anti-HA-Tag-Antikörper [FITC] | GenScript | A01621 | FACS-Färbung; FITC-konjugiertes anti-HA |
| Bacto Casaminosäuren | BD Difco | 223120 | SDCAA+, SGCAA+, SCAA-Medien (Tabelle 5); 5 g/L |
| Bacto Pepton / Trypton | RPI | T60060-10000.0 | LB/SOB-Medienzubereitung; 20 g/L in YPD (Tabelle 5) |
| BSA, bovines Serumalbumin, Fraktion V | Sigma-Aldrich | 126575-10GM | 0,5% in PBS; Färbepuffer (Schritte 3.2–3.3) |
| BsmBI-v2 (200 U) | NEB | R0739S | Golden Gate-Assembly des Substratkassetten (Tabelle 8) |
| Calciumchloridlösung (1 M) | Sigma-Aldrich | 21115-100mL | Elektroporationspuffer: 1 mM Endkonzentration (Tabelle 5) |
| ColiRollers® Plattenbeads | Sigma-Aldrich | 71013-3 | Sterilisiere durch Einlegen in Reagenzflaschen und Autoklavieren bei 121ºC, 15 psi, für 15 Min. |
| D-Galaktose | Thermo Fisher | A12813.30 | 250 g; 20% w/v-Vorrat für SGCAA+-Induktion (Tabelle 5) |
| D-Sorbitol | Thermo Fisher | 1327300.10 | Elektroporationspuffer (1 M) und Auswuchsmedium (Tabelle 5) |
| Dextrose (D-Glukose), wasserfrei | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | YPD, SDCAA+, 20% w/v Dextrose-Vorrat (Tabelle 5) |
| Difco Hefennierstoffbasis ohne Aminosäuren | Sigma | Y0626-250G | 6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabelle 5) |
| Difco YPD-Bouillon (vorgemischt) | BD | 242820-500g | Vorgefertigte YPD-Alternative; 500 g |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Konditierungspuffer: 10 mM Endkonzentration; 250 μL aliquotieren, bei -20°C lagern |
| E.Z.N.A. CyclePure PCR-Reinigungskit | Omega Bio-tek | D6492-02 | PCR-Produktreinigung |
| E.Z.N.A. Gel-Extraktionskit | Omega Bio-tek | D2500-01 | Gelreinigung nach PCR und Restriktionsverdau (Schritte 1.1.8, 1.3.2) |
| E.Z.N.A. Plasmid-DNA-Mini-Kit I | Omega Bio-tek | D6942-02 | Plasmidreinigung (Schritt 4.2) |
| Glycerol (≥99%) | Fisher | BP229-4 | 50% v/v-Vorrat für Glycerinvorräte (Schritt 4.1.1) |
| Kanamycinsulfat | Fisher | BP906-5 | SDCAA+ und SGCAA+: 50 μg/mL Endkonzentration; ersetzt Sigma K0879-5G |
| KLD-Enzymmix | NEB | M0554S | Kinase-Ligase-DpnI; zielgerichtete Mutagenese |
| KLD-Reaktionspuffer | NEB | B0554A | Verwendet mit KLD-Enzymmix |
| LB-Bouillon (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | E. coli-Flüssigkultur |
| Lithiumacetatdihydrat (LiOAc·2H2O) | Thermo Fisher | A17921.30 | Konditierungspuffer: 0,1 M Endkonzentration; vor DTT hinzufügen (Tabelle 5) |
| Luria-Agar (Luria-Bertani-Agar) | RPI | L24020-2000.0 | E. coli-Bebrütung; ersetzt Sigma LB-Agar Lennox L2897-1KG |
| OmniPur Casaminosäuren | Sigma | 2240-500GM | Alternative Casaminosäurenquelle |
| pDD1523 | Zenodo | 10.5281/zenodo. 20746804 | pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP |
| pDD1524 | Zenodo | 10.5281/zenodo. 20746804 | pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100X | Corning | 30-002-CI | SDCAA+, SGCAA+: 1X Endkonzentration |
| PstI-HF (5000 U) | NEB | R3140S | Vektorlinearisierung (Tabelle 10); HF-Version verwenden |
| Q5 HF DNA-Polymerase | NEB | M0492S | Hochtreue Polymerase; Alternative zu Q5 Hot Start |
| Q5 High GC Enhancer | NEB | B9028A | Für PCR-Reaktionen mit hohem GC-Gehalt |
| Q5 Hot Start DNA-Polymerase | NEB | M0491L | PCR-Assembly und -Amplifikation (Tabellen 1, 3) |
| rCutSmart-Puffer (10X) | NEB | B6004S | Liegt PstI-HF und SphI-HF bei (Tabelle 10) |
| SalI-HF | NEB | R3138L | Zusätzliches Restriktionsenzym |
| SOC-Medium | NEB | B902 |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Dieser Artikel wurde veröffentlicht
Video demnächst verfügbar