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Methodenartikel

Optimierter Workflow zur Anzeige von Hefeoberflächen für die gerichtete Entwicklung von Proteasen

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DOI:

10.3791/72559

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4. August 2026

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1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf für die gerichtete Entwicklung viraler Proteasen in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung eines oberflächendisplaybasierten Selektionssystems. Es beschreibt das Design der DNA-Insert-Bibliothek und Substratkassetten, Elektroporation, die für eine hohe Transformationseffizienz optimiert ist, fluoreszenzaktivierte zellbasierte Auswahl für Proteasespaltung sowie die Sequenzierung angereicherter Varianten.

Zusammenfassung

Gerichtete Evolution ahmt den natürlichen Evolutionsprozess in einer schnellen, kontrollierten Laborumgebung nach, um Proteine mit wünschenswerten Funktionen oder Eigenschaften zu entwickeln. Das Screening eines großen Pools mutanten-proteinkodierender Gene ermöglicht die funktionelle Auswahl gewünschter Varianten für Anwendungen in Biotechnologie, Medizin und synthetischer Biologie. Mit diesem Protokoll führen wir eine gerichtete Evolution in Saccharomyces cerevisiae durch, um Proteasevarianten mit hoher Spezifität für eine nicht-native Substratsequenz zu entwickeln. Wir zeigen diese Proteasevarianten auf der Hefezelloberfläche, um die Auswahl der gewünschten Varianten mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) über mehrere Anreicherungsrunden zu erleichtern. Vier Schlüsselelemente der Substratkassette werden gemeinsam mit der Proteasebibliothek exprimiert: ein Fusionsprotein, das aus (i) der Hefeadhäsionsrezeptor-Untereinheit Aga2, (ii) Selektions- und (iii) Gegenselektionssubstratsequenzen, (iv) Epitop-Tag-Sequenzen und einer optionalen endoplasmatischen Retikulum (ER) Rückrufsignalsequenz besteht. Hefezellen, in denen nur die Selektionssubstratsequenz gespalten ist, werden mittels mehrfarbiger FACS über fluoreszierende (phycoerythrin/fluorescein isothiocyanat-markierte) Antiepitopen-Antikörper isoliert. Hier geben wir Details zum optimierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung einer Protease-Evolutionskampagne, einschließlich Design der DNA-Insert-Bibliothek und Substratkassettendesigns, Hefezellelektroporation mit hoher Transformationseffizienz (bis zu 109Transformanten pro Mikrogramm DNA), FACS-basierter Selektion, Anreicherung und Sequenzierung evolvierter Varianten. Wir demonstrieren unser Directed Evolution-Protokoll, indem wir die Nuklearinklusion A-Protease (TEVp) des Tabak-Etch-Virus von der Spaltung ihrer natürlichen Substratsequenz ENLYFQ↓S bis zur Spaltung einer neuen Sequenz, ENLYFE↓S, entwickeln.

Einleitung

Cysteinproteasen der Familie Potyviridae, insbesondere die nuklearen Inklusionsproteasen A (NIa), stellen eine weitgehend ungenutzte Quelle sequenzspezifischer Endopeptidasen dar. Mit mehr als 3.800 charakterisierten Familienmitgliedern spalten NIa-Proteasen eine eigenständige Substratsequenz von sieben Aminosäuren. Die Potoveral-Familie bietet eine vielfältige Auswahl an Proteasen für die Entwicklung programmierbarer Proteinkontrollsysteme, den Aufbau orthogonaler proteasenbasierter genetischer Schaltkreise und die Entwicklung sequenzspezifischer biotechnologischer Werkzeuge 1,2. Trotz dieser natürlichen Vielfalt wurden nur zwei NIa-Proteasen, TEVp und Tobacco Vin Mottling Virus Protease (TVMVp), umfassend charakterisiert und für den breiten Labor- und biotechnologischen Einsatzentwickelt 3,4. Dieses begrenzte Protease-Toolkit begrenzt den Designraum für Mehrkomponentenschaltungen, die orthogonale Proteaseaktivitätenerfordern 5, und motiviert somit Bemühungen, Nia-Proteasen durch eine gerichtete Evolution 6,7 weiter zu erweitern und zu charakterisieren.

Die Hefeoberflächenanzeige hat sich als eine der leistungsstärksten Plattformen für gerichtete Evolution erwiesen und ermöglicht Hochdurchsatz-Proteinbibliotheksscreening mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)6,7. Zum Beispiel koppelt das Hefe-Endoplasma-Retikulum-Sequestrationsscreening-System (YESS) die Proteaseaktivität über den sekretorischen Weg von S. cerevisiae 6,7 an die Oberflächenpräsentation. Das YESS-System wurde eingesetzt, um neuartige Protease-Substrat-Spezifitäten zu entwickeln und hat sich als nützlich für mehrrundige Kampagnen zur gerichteten Evolution erwiesen. In diesem System werden Protease-Varianten mit einem Fusionsprotein koexprimiert, das eine Spaltsubstratkassette mit Epitopenmarkern enthält, und der Aga1p-Oberflächenanker wird im EBY100-Hefestamm exprimiert. Differenzielle Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern unterscheidet sich von nicht gespaltenen Substratkassetten, die auf der Zelloberfläche angezeigt sind. Dieser aktivitätsabhängige Darstellungsmechanismus ist direkt kompatibel mit iterativer FACS-basierter Auswahl für Bibliotheken von 10,7 oder mehr Varianten 6,7.

Eine grundlegende Voraussetzung für gerichtete Evolution ist die Fähigkeit, Variantenbibliotheken in ausreichendem Maßstab einzuführen, um eine angemessene Abdeckung des angestrebten Sequenzraums zu erreichen. Für Standortsättigungs-Mutagenesebibliotheken, die mehrere Aminosäurepositionen umfassen, werden Transformationserträge von 108 bis 109 einzigartigen Transformanten benötigt, um sicherzustellen, dass die in die Bibliothek eingeführte Vielfalt in der sortierten Population gut vertreten ist. Es existieren mehrere Methoden, um exogene DNA in S. cerevisiae einzuführen, jede mit unterschiedlichen Durchflussgrenzen. Die herkömmliche chemische Transformationsmethode verwendet Lithiumacetat/einzelsträngige Träger-DNA/Polyethylenglykol (LiAc/ssDNA/PEG) aufgrund ihrer Einfachheit und Zugänglichkeit. Allerdings erreicht sie typischerweise nur Transformationseffizienzen von 104–106 koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Mikrogramm DNA, was hinter der für große Bibliothekskampagnen erforderlichen Sequenzvariation liegt8. Im Gegensatz dazu verwendet die Elektroporationsmethode ein Hochspannungsfeld, um die Zellmembran vorübergehend zu permeabilisieren und die DNA-Aufnahme zu erleichtern. Die Elektroporation erzielt stets die höchsten Transformationseffizienzen unter den verfügbaren Transformationsmethoden, wobei optimierte Protokolle Erträge von 108–109 CFU9 angeben. Es wurde beobachtet, dass die Elektroporationseffizienz in S. cerevisiae kritisch empfindlich auf Zellwachstumsphase, DNA-Masse und Pufferzusammensetzung reagiert, was ein Rahmenwerk bietet, das seither weitgehend für bibliothövralische gerichtete Evolution9 angepasst wurde.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet den S. cerevisiae-Stamm EBY100, einen weit verbreiteten Wirtsstamm zur Anzeige von Hefeoberflächen. EBY100 wurde von Boder und Wittrup entwickelt, indem eine AGA1-Expressionskassette unter der Kontrolle des galaktose-induzierbaren GAL1-Promotors in das chromosomale AGA1-Lokus des proteasendefizienten Elternstamms BJ546510 integriert wurde. Der Stamm ist kommerziell im ATCC erhältlich (Katalognummer MYA-4941; Depositor K.D. Wittrup), der den Genotyp MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−) trägt. Daher werden sowohl Aga1p als auch die Aga2p-Substrat-Kassettenfusion aus demselben galaktoseinduzierbaren Promotor exprimiert, wodurch sichergestellt wird, dass die beiden Untereinheiten ko-induziert und zum disulfidgebundenen Aga1p–Aga2p-Komplex zusammengesetzt werden, der die gezeigte Fusion an der Zellwand verankert.

Trotz der weit verbreiteten Verwendung von EBY100 in Hefedisplay-Anwendungen wurde kein veröffentlichtes Protokoll systematisch für die Elektroporation dieses Stammes in bibliotheksmaßstäbem Ertrag optimiert. EBY100-spezifische Parameter, wie die optimale Wachstumsphase bei der Ernte, die Mittelzusammensetzung während der Subkultur und die quantitative Beziehung zwischen der initialen optischen Dichte bei 600 nm (OD600) und der Transformationseffizienz, müssen weiterhin rigoros charakterisiert und optimiert werden. Hier berichten wir, dass die Transformationseffizienz in EBY100 monoton mit dem OD600 der Kultur bei der Ernte zunimmt, wobei Zellen in der späten Logaritma-Phase deutlich höhere Transformationsraten erzielen als die in der frühen Logaritma-Phase. Wir bewerteten kritische Protokollparameter, darunter die anfänglichen OD600-Werte bei der Impfung, die Verwendung von 2 × Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-Medium für Subkulturen, Elektroporationspufferformulierungen und Auswuchsbedingungen nach der Elektroporation. Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen optimierten Schritt-für-Schritt-Workflow (Abbildung 1A–C, Abbildung 2, Abbildung 3A–D, Abbildung 4A–E) zur Vorbereitung elektrokompetenter EBY100-Zellen und zur Durchführung hocheffizienter DNA-Bibliothekselektroporation, wobei Transformationsraten konstant über 10,9 liegen CFU. Um dieses Protokoll zu validieren, führten wir eine umfassende Directed Evolution-Kampagne durch, um TEVp mit veränderter Spaltspesifität über vier Runden FACS-basierter Auswahl und Anreicherung hinweg zu entwickeln. Die Sequenzierung angereicherter Protease-Varianten bestätigte eine erhebliche Diversifizierung bei gezielten Resten innerhalb der substratbindenden Tasche der Protease und zeigt, dass das Protokoll eine ausreichende Bibliotheksabdeckung des Sequenzraums bietet, um produktive Evolutionskampagnen zu unterstützen. Dieses Protokoll wird für Forscher, die EBY100 für die auf Hefeoberflächendisplay basierende gerichtete Evolution und FACS-kompatible, hochdurchsetzte Screening von Proteasen, Antikörpern9, Kinasen11 und Rezeptoren12 sowie anderen Proteinen verwenden, von großem Nutzen sein.

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Protokoll

Alle Experimente mit rekombinanter S. cerevisiae wurden gemäß den Richtlinien und Verfahren des Institutional Biosafety and Chemical Safety Committee der University of Texas at Dallas durchgeführt. Rekombinante Hefestämme wurden gemäß etablierten institutionellen mikrobiologischen Praktiken unter Biosicherheits-Level-1-Level-1 (BSL-1)-Eindämmung behandelt. Elektroporation, Kultur und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurden gemäß genehmigten institutionellen Biosicherheitsverfahren durchgeführt. Hefekulturen und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden gemäß institutionellen Richtlinien dekontaminiert und als biologisch gefährlicher Abfall entsorgt.

1. Vektor- und Insert-Vorbereitung

  1. Erzeugung potöveraler Proteasebibliotheken durch Standortsättigungsmutagenese
    1. Entwurf mit Sequenzdesign-Software, die 30- bis 50-mer, Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotiden überlappt, um eine mutierte Bibliothek von Proteasen zu erzeugen. Ersetzen Sie das Wildtyp-Codon im entsprechenden Oligonukleotid durch ein NNS-entartetes Codon, wobei N A, T, G oder C repräsentiert und S G oder C für Positionen, die für die Mutagenese vorgesehen sind.
    2. Entwerfen Sie die 3′-Überlappung zwischen jedem Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidpaar mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 55–60 °C. Entwerfen Sie die ersten und letzten Oligonukleotide so, dass sie eine Überlappung von 50 NT mit dem Hefeoberflächen-Displayvektor jenseits der Restriktionsstellen enthalten.
    3. Stellen Sie sicher, dass mindestens ein Ende des Inserts genau ein Ende des linearisierten Vektors überlappt, um homologe Rekombination13 zu ermöglichen. Vermeiden Sie Lücken zwischen benachbarten Oligonukleotiden14.
    4. Oligos auf 100 μM mit deionisiertem H2O wiedersuspendieren. In einem sterilen 1,5-mL-Rohr werden 0,5 μL jedes Oligos zu einem Endvolumen von 200 μL kombiniert (Endkonzentration von 250 nM pro Oligo).
    5. Richten Sie eine PCR-Reaktion mit den in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten ein, um die Proteasebibliothek unter Verwendung der Thermocycling-Bedingungen aus Tabelle 2 zusammenzustellen.
    6. Richten Sie eine zweite PCR-Reaktion mit den äußersten vorwärts- und rückwärts-Oligos auf (Tabelle 3) ein, wobei das erste zusammengesetzte PCR-Produkt als Vorlage dient. Verstärken Sie das Produkt wie in Tabelle 4 gezeigt.
    7. Führe das zweite PCR-Produkt auf einem 1%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,5 μg/mL) bei 240 V für 30 Minuten durch. Entfernen Sie das Band, das der erwarteten DNA-Länge entspricht.
      HINWEIS: VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein Mutagen und sollte mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) behandelt werden, darunter Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Entsorgen Ethidiumbromidhaltige Gele, Puffer und Verbrauchsgüter als gefährliche chemische Abfälle gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien.
    8. Reinigen Sie mit einem Gel-Extraktionsset. Elut in 50 μL deionisiertes H2O.
    9. Misse die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. Lagere die DNA bei −20 °C.
      HINWEIS: Jede 50-μL-Reaktion derzweiten PCR ergibt etwa 0,5–1,0 μg Gesamt-DNA. Da jede Elektroporation 12 μg der Proteasebibliothek (d. h. Insert) benötigt, skalieren Sie die Reaktionen entsprechend.
  2. Kassettenmontage des Substrats
    1. Bereite LB-Agarplatten und LB-Chloramphenicol-Flüssigmedien vor. Siehe Rezepte in Tabelle 5.
    2. Entwerfen Sie einen Satz überlappender 30-Mer-Oligonukleotide in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung für die Montage der Substratkassette. Entwerfen Sie die 5′-Enden jedes Reverse-Oligonukleotids und das vordere Oligonukleotid des nächsten Fragments so, dass sie mit 4 Nukleotiden übereinstimmen.
    3. Suspendiere lyophilisierte Oligos auf 100 μM mit deionisiertem H2O.
    4. Reagenzien wie in Tabelle 6 mischen.
    5. Verwenden Sie das Zyklusprogramm in Tabelle 7 , um den Oligo-Mix zu annealisieren und phosphorylieren.
    6. Verdünnte geglühte Oligos vierfach in deionisiertem H2O, um eine Endkonzentration von 1,25 μm zu erreichen.
    7. Kombinieren Sie das geglühte Oligo-Mix mit dem Vektor (z. B. pDD1523) und folgen Tabelle 8.
    8. Führen Sie die Golden Gate-Montage nach dem Radprogramm in Tabelle 9 durch.
      HINWEIS: Zum Beispiel besitzt das pDD1523-Plasmid eine Typ-IIS-Restriktionsstelle (BsmBI) stromabwärts des GAL1/10-Promotors. Eine erfolgreiche Montage ermöglicht die Galaktose-Induktion der Substratkassette7.
    9. Transformiere das resultierende Plasmid in E. coli.
    10. Plattenzellen auf LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum. Inkubieren Sie 16–18 Stunden bei 37 °C.
    11. Wähle isolierte Kolonien aus und impfe sie in 5 ml LB-Medien. Über Nacht (16–18 H) bei 37 °C mit Schütteln (220 U/min) inkubieren.
    12. Extrahiere Plasmide aus Übernachtkulturen mit einem Plasmid-Miniprep-Kit.
    13. Messen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektrophotometer und senden Sie dann eine Sequenzierung an.
  3. Linearisierung des Hefedisplayvektors
    1. Linearisieren Sie das Hefedisplayplasmid, z. B. vergären Sie pDD1524 mit SphI- und PstI-Restriktionsenzymen, um den Hefedisplayvektor mit der Substratkassette für die Elektroporation vorzubereiten. Mischen Sie die in Tabelle 10 aufgeführten Reagenzien und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde.
    2. Lasse das Restriktionsverdauungsprodukt 30 Minuten lang auf einem 1%igen Agarosegel bei 240 V laufen. Entfernen Sie das Band, das der erwarteten DNA-Länge entspricht, und reinigen Sie es mit einem Gelextraktionskit.
      HINWEIS: Jede 50 μL Restriktionsverdauung ergibt etwa 0,5–1,0 μg Gesamt-DNA. Da jede Elektroporation 4 μg linearisierten Vektor benötigt, skalieren Sie die Verdauungsreaktionen entsprechend.

2. Elektroporation

Hinweis: Befolgen Sie institutionelle Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit biologischen Materialien und Reagenzien, tragen Sie geeignete PSA und entsorgen Sie biologische sowie chemische Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien.

  1. Vorbereitung von Puffern, Platten und Medien (2 Tage vor der Elektroporation)
    1. Bereite Wachstumsmedien vor (1 × YPD; 2 × YPD; Synthetische Dextrose-Casaminosäuren, SDCAA+; und synthetische Galaktose-Casaminosäuren, SGCAA+), Platten (YPD und SDCAA), Elektroporationspuffer und steriles Wasser gemäß den Rezepten in Tabelle 5. Lagern Sie bei 4 °C.
  2. Vorbereitung einer gestreiften Platte von EBY100.
    1. Streue EBY100-Hefe auf YPD-Agar aus einem Glycerolfond. Wachsen Sie bei 30 °C für 2 Tage.
    2. Lagern Sie den Teller nach dem Wachstum bei 4 °C.
      HINWEIS: Eine gestreifte Platte bleibt bis zu einem Monat benutzbar; Markiere das Streak-Datum auf dem Teller.
  3. Herstellung der EBY100-Vorkultur (1 Tag vor der Elektroporation)
    1. Bereiten Sie 125 mL 1 × YPD in einer 500 mL Erlenmeyer-Flasche vor.
    2. Bereiten Sie 25 ml 1 × YPD in einem 50-mL konischen Rohr vor. Mit einer Mikropipettenspitze entnehmen Sie EBY100-Zellen von der Platte, die zwei Tage lang gewachsen ist. Anschließend werden die Hefezellen von der Pipettenspitze in das konische Rohr mit 1 × YPD übertragen.
      HINWEIS: Der Zellstreifen sollte einen Abstrich von etwa 1–2 mm Länge bilden.
    3. Entfernen Sie die Mikropipettenspitze und lassen Sie das konische Rohr vortexen, um eine ausreichende Mischung sicherzustellen.
    4. Bereiten Sie eine 150-mL-Vorkultur vor, indem Sie 25 mL von 1 × YPD mit den Hefezellen in den 500-mL-Kolben mit 125 mL 1 × YPD übergeben. Wirbel zum Mixen.
    5. Mit einem Spektrophotometer wird der OD600 gemessen, indem zwei Mikrocuvetten mit einer Weglänge von 1 cm vorbereitet werden: eine mit 1 mL 1 × YPD als Rohstoffkontrolle und eine weitere mit 1 mL der Vorkultur
    6. Über Nacht (16–20 H) werden 150 ml Vorkultur bei 30 °C mit orbitalem Schütteln bei 270 U/min angebaut.
  4. Vorbereitung der Subkultur bei gewünschtem Anfangs-OD600 (am Tag der Elektroporation)
    1. Bereiten Sie den Konditionierungspuffer und das Auswuchsmedium vor, wie in Tabelle 5 beschrieben.
    2. Messen Sie den OD600 der nächtlichen Vorkultur (erwarteter OD₆₀₀ beträgt 17–22). Um im linearen Bereich des Spektrophotometers zu liegen, misst man eine Verdünnung der Vorkultur im Wert von 1:20.
    3. Berechnen Sie das Volumen der Vorkultur, das benötigt wird, um eine 100-mL-Subkultur zu impfen. Eine anfängliche Subkultur OD600 von 3,0–4,0 wird empfohlen.
    4. Verdünnen Sie die Kultur auf den gewünschten Anfangs-OD600 in 100 ml 2 × YPD in einer 500 mL Erlenmeyer-Flasche.
    5. Inkubieren Sie die 100-mL-Subkultur bei 30 °C mit Orbitalschütterung bei 270 U/min für 4 Stunden.
  5. Vorbereitung des Mediums während der 4-stündigen Inkubation
    1. Halten Sie einen eiskalten Elektroporationspuffer und steriles Wasser bereit (ab Schritt 2.1.1).
    2. Bereiten Sie einen Konditionierungspuffer (100 mL) vor, gemäß dem Rezept in Tabelle 5. Verwenden Sie pro Transformation 20 ml Konditionierungspuffer; Skaliere entsprechend auf. Lagern Sie bei Raumtemperatur (20–23 °C).
      HINWEIS: VORSICHT: Der Pflegepuffer enthält Dithiothreitol (DTT) und Lithiumacetat (LiAc), chemische Reizstoffe, die Haut- und Augenreizungen verursachen können. Tragen Sie geeignete PSA, einschließlich Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen, und behandeln Sie diese Reagenzien gemäß den institutionellen Chemikalienschutzvorschriften. Entsorgen ungenutzte Lösungen und verbrauchte Puffer als chemische Abfälle gemäß institutionellen Richtlinien.
    3. Auswuchsmedium (50 ml) vorbereiten: 25 ml 2 × YPD und 25 ml 1 m Sorbitol mischen. Verwenden Sie pro Transformation 8 ml Auswuchsmedium. Lagern Sie bei Raumtemperatur (20–23 °C).
  6. Herstellung elektrokompetenter Hefezellen nach 4 Stunden Inkubation.
    1. 100 mL Subkultur in zwei 50 mL konische Röhren aufteilen. Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten sammeln und dann das Medium dekantieren. Lassen Sie die Zellen auf Eis, bis Schritt 2.6.4 abgeschlossen ist.
    2. Jede Zellkugel wird vorsichtig mit 25 ml eiskaltem sterilem Wasser wieder suspendiert. Zentrifugiere bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten, dann dekantiere das Medium.
    3. Wiederhole Schritt 2.6.2.
    4. Jede Zellkugel wird vorsichtig mit 25 ml eiskaltem Elektroporationspuffer wieder suspendiert. Zentrifugieren Sie bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten, dann dekantieren Sie das Medium.
    5. Entfernen Sie die Zellen aus dem Eis und suspendieren Sie jede Zellkugel vorsichtig mit 10 ml Raumtemperatur-Conditionerpuffer (20–23 °C) wieder. Anschließend werden Sie in eine einzelne 125-mL Erlenmeyer-Flasche gesammelt und 30 Minuten lang bei 30 °C mit orbitalem Schütteln bei 270 U/min inkubiert.
    6. Gib die Zellen in ein 50-ml-Rohr. Zentrifugiere bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten. Dekantiere die Medien.
    7. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig mit 50 ml eiskaltem Elektroporationspuffer wieder suspendieren. Zentrifugieren Sie bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten, dann übergeben Sie das Medium.
    8. Suspendieren Sie das Zellpellet auf ein Endvolumen von 1 mL wieder, indem Sie etwa 100–200 μL Elektroporationspuffer hinzufügen. Lass die Zellen bis zur Elektroporation auf Eis.
      HINWEIS: Elektrokompetente Zellen können eingefroren (d. h. in einem –80 °C Gefrierschrank platziert werden) und später ohne nennenswerten Verlust der Elektroporationseffizienz verwendet werden.
  7. Elektroporation, Auswachsen und Beschichtung
    1. Vorkühl-Elektroporationscuvetten mit einer Spaltgröße von 0,2 cm auf Eis.
    2. Übertragen Sie 380 μL des resuspendierten Pellets auf ein steriles 1,5-mL-Rohr. Mischen Sie mit 4 μg Plasmid-DNA oder 4 μg linearisiertem Plasmidvektor und 12 μg Insert. Sanft durch Pipettern vermischen.
      HINWEIS: Um die Anzahl der elektroporierten Zellen zu maximieren, sollten Vektor- und Insert-DNA-Konzentrationen idealerweise 700–800 ng/μL betragen. Wenn die Konzentrationen niedriger sind, verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator.
    3. Federung wird in die vorgekühlte Elektroporationscuvette(n) übertragen. Lass sie 5 Minuten auf dem Eis.
    4. Wischen Sie nach 5 Minuten die Seiten der Cuvette mit einem fusselfreien Labortuch ab, um Restfeuchtigkeit zu entfernen, die während der Elektroporation zu Lichtbögen führen kann. Vermeiden Sie Blasen oder Zellen oberhalb der Metallplatten in der Cuvette, da diese ebenfalls zu Lichtbögen führen können. Um die kalte Temperatur der Cuvette aufrechtzuerhalten, sollten Sie die Plattenelektroden nicht berühren.
    5. Bereiten Sie 8 ml Auswuchsmedium in einem 50-mL konischen Rohr vor.
    6. Elektropolieren Sie die Zellen mit folgenden Einstellungen: Eine Spannung von 2,5 kV, eine Kapazität von 25 μF und ein Widerstand von 200 Ω9. Der akzeptable Zeitkonstantenbereich beträgt 2,8–4,5 ms.
      HINWEIS: VORSICHT: Die Elektroporation beinhaltet Hochspannungsimpulse. Stellen Sie sicher, dass die Cuvetten richtig sitzen und folgen Sie den Betriebsanweisungen des Herstellers. Entsorgen gebrauchte Elektroporationscuvetten als biologisch gefährliche Abfälle gemäß institutionellen Richtlinien.
    7. Füllen Sie die Cuvette sofort mit etwa 200 μL Auswuchsmedium aus dem konischen Rohr und übertragen Sie elektroporierte Zellen in das 50 mL große konische Rohr. Fügen Sie weitere 200–350 μL Auswuchsmedium hinzu, bis keine sichtbare Flüssigkeit mehr in der Cuvette verbleibt.
    8. Inkubieren Sie das 50 mL konische Rohr mit elektroporierten Zellen in 8 mL Auswuchsmedium bei 30 °C ohne Schütteln für 1 H. Wenden Sie das Rohr alle 15 Minuten um, um zu mischen.
    9. Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 × g, 25 °C für 3 Minuten sammeln. Dann dekantieren Sie die Medien.
    10. Stellen Sie die Zellen in geeigneten Hefedropout-Medien wieder auf, um die Selektion für transformierte Zellen aufrechtzuerhalten. Bei Plasmiden, die den TRP1-Selektionsmarker enthalten, werden Zellen in 250 mL SDCAA+ (das kein Tryptophan enthält) neu suspendiert, um selektiv Hefe zu gewinnen, die das Plasmid zurückgehalten hat.
    11. Inkubieren Sie über Nacht (16–20 H) bei 30 °C mit Orbital-Schütteln bei 270 U/min.

3. Induktion, Färbung und Flowzytometrische Sortierung von Hefezellen

  1. Induktion der Proteasebibliothek und Substratkassette (1 Tag vor der Sortierung)
    1. Messung von OD600 wie in Schritt 2.4.2 nach dem nächtlichen Wachstum der Transformanten in Dropout-Medien.
    2. Aliquot 12 ml Hefe-Transformanten und Zentrifuge bei 3.200 × g für 5 Minuten.
    3. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in SGCAA+-Induktionsmedium auf einen OD600 von 0,5. Berechnen Sie das erforderliche Aufhängungsvolumen mit der Verdünnungsgleichung C1V1 = C2V2.
    4. In eine 125-ml-Erlenmeyer-Flasche übertragen und über Nacht 18–24 Stunden bei 30 °C mit Orbital-Schütteln bei 270 U/min wachsen lassen.
  2. Fluoreszierende Antikörperfärbung (am Tag der Sortierung)
    1. Messen Sie den OD600 der Zellen nach der Induktion. Verwenden Sie zwei Cuvetten: eine mit 1 ml SGCAA+ und eine andere mit 950 μL SGCAA+, gemischt mit 50 μL Zellen. Multiplizieren Sie den gemessenen OD600-Wert mit 20, um den tatsächlichen OD600 der Post-Induktionszellen zu erhalten.
    2. Normalisieren Sie jede Probe auf 3 × 107 Zellen zur Antikörperfärbung und FACS-Sortierung. Verwenden Sie C1V1 = C2V2 , um das Volumen der Zellen zu berechnen, die vom Induktionskolben übertragen werden sollen.
      HINWEIS: Für die Vier-Standort-NNS-Sättigungsmutagenese beträgt die theoretische Bibliotheksgröße 106 Varianten . Um die Bibliothek ausreichend zu sampeln, screenen Sie mindestens 10-mal die Bibliotheksgröße oder 10 bis7 Zellen. Beispiel: Wenn gewünscht C1V1 = 3 × 107 Zellen und C2 = nach der Induktion OD600 von 6 (d. h. 6 × 107 Zellen/mL) gewünscht sind, dann aliquot 500 μL induzierter Zellen (d.h. V2 = 3 × 107 Zellen / 6 × 107 Zellen/mL = 500 μL).
    3. Übertragen Sie das berechnete Zellvolumen in ein 1,5-ml-Rohr und zentrifugieren Sie bei 5.000 × g für 5 Minuten.
    4. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie es in 500 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA).
    5. Zentrifugiere bei 5.000 × g für 5 Minuten und wiederhole Schritt 3.2.4.
    6. Zentrifugiere bei 5.000 × g für 5 Minuten und schließe in der Zwischenzeit Schritt 3.2.7 ab.
    7. Bereiten Sie eine Antikörper-Färbemischung in einem 1,5-ml-Rohr vor, das Anti-HA-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (0,5 μg/107 Zellen), Anti-FLAG-Phycoerythrin (PE) (0,05 μg/107 Zellen) und PBS + 0,5 % BSA (100 μL/107 Zellen) enthält. Lass das Rohr auf Eis.
    8. Entferne das Überlagermittel und suspendiere es mit der Fleckmischung erneut. Verwenden Sie 300 μL der Farbmischung pro 3 × 107 Zellen . Nicht vortexen lassen; Nur umkehren oder flicken.
    9. Lassen Sie die Zellen nach der Resuspension im Dunkeln eine Stunde lang auf Eis.
  3. Nach-Verfärbungswaschen
    1. Zentrifugengefärbte Zellen bei 5.000 × g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Überdachungsmittel und suspendieren Sie das Pellet in PBS mit 0,5 % BSA mit 0,5 mL pro 1 × 107 Zellen ( z. B. 500 μL für 1 × 107 Zellen oder 1,5 mL für 3 × 107Zellen ).
    2. Zentrifugiere bei 5.000 × g, 5 Minuten. Supernatant entfernen, in 750 μL PBS + 0,5 % BSA neu suspendieren.
    3. Übertragen Sie weitere 750 μL PBS + 0,5 % BSA auf ein 10 mL Sammelrohr.
  4. FACS
    1. Führen Sie den notwendigen Start und die Vorbereitung des Zytometers für ein neues Experiment durch.
    2. Erstelle drei Punktdiagramme. Beim ersten Punktdiagramm wählen Sie den Namen der X-Achse aus, um den Kanal für den vorderen Streubereich (FSC-A) anzuzeigen, und den Y-Achsen-Namen, um den Seiten-Streuflächenkanal (SSC-A) anzuzeigen.
      HINWEIS: Dies erleichtert die Auswahl lebender Zellen.
    3. Behalte den X-Achsen-Namen, um den FSC-A-Kanal anzuzeigen, während der Y-Achsen-Kanal auf der zweiten Punktdiagramm-Präsentation der Vorwärts-Streuhöhe (FSC-H) geändert wird.
      HINWEIS: Dies erleichtert die Auswahl der Singlets.
    4. Wählen Sie den Namen der X-Achse aus, um den PE-Kanal anzuzeigen, und den Namen der Y-Achse, um den FITC-Kanal im dritten Punktdiagramm anzuzeigen.
    5. Führe eine negative Kontrolle am Zytometer mit den 530/30 nm (FITC) und 585/42 nm (PE) Kanälen durch. Sortieren Sie mit einer 70-μm-Düse bei 70 psi Manteldruck. Proben werden mit einer Geschwindigkeit von 4000–5000 Ereignissen pro Sekunde erfasst.
    6. Zeichnen Sie ein Polygongatter um die Hauptpopulation intakter Hefezellen, um Ablagerungen und kleine Partikel mit niedrigen FSC-A- und SSC-A-Signalen auf dem ersten Punktdiagramm (FSC-A versus SSC-A) auszuschließen.
    7. Gate-Singlets auf einem FSC-H versus FSC-A-Plot innerhalb dieses Gates, indem die lineare Population ausgewählt wird, die eine proportionale Beziehung zwischen FSC-H und FSC-A aufweist. Ereignisse werden ausgeschlossen, die von der linearen Verteilung abweichen und Doublets und Zellaggregaten entsprechen.
      HINWEIS: Das dritte Punktdiagramm für PE versus FITC zeigt einen diagonalen Cluster von Punkten für die negative Kontrolle (d. h. Hefezellen, die die intakte Substratkassette exprimieren).
    8. Führe Proben aus und sortiere Hefezellen basierend auf den gewünschten PE/FITC-Werten in ein Sammelröhrchen. Analysieren Sie eine Gesamtzahl von Zellen, die mindestens dem 10-fachen der theoretischen Bibliotheksgröße entsprechen, um eine angemessene Darstellung aller Varianten sicherzustellen (z. B. analysieren Sie ~1 × 107Zellen für eine Bibliothek mit einer theoretischen Diversität von ~1 × 106Varianten ).
    9. Positioniere das Sortiergatter unterhalb der PE/FITC-Diagonale der negativen Kontrollpopulation.
      HINWEIS: Strengere Gates verbessern die Anreicherung der gewünschten Varianten, verringern jedoch die Zellrückgewinnung.
  5. Nach FACS
    1. Zentrifugen-Sammelrohr(e) mit 3.200 × g für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant, lassen Sie 1 ml übrig, und lassen Sie es in 5 ml PBS nachziehen.
      HINWEIS: Lassen Sie 1 ml Supernatant übrig, da das Zellpellet am Boden nach der Zentrifugation nicht mehr sichtbar ist.
    2. Zentrifugiere die Zellen erneut bei 3.200 × g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Supernatant, lassen Sie 1 ml übrig. Wieder aufhängen mit 4 ml SDCAA+.
    3. In einer 250-ml-Erlenmeyer-Flasche fügen Sie 15 ml SDCAA+ hinzu. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen aus Schritt 3.5.2 in diese Flasche.
    4. Über Nacht 18–24 Stunden bei 30 °C mit Orbitalschütteln bei 270 U/min.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1, 3.2, 3.3 und 3.4 für jede Runde der gerichteten Evolution.

4. Plasmidrückgewinnung und Sequenzierung einzelner Klone

  1. Einzelne Kolonien anbauen
    1. Man stellt einen Glycerolfond her, indem man nach Schritt 3.5.4 500 μL der Flüssigkeitskultur und 500 μL steriles 50 % Glycerol mischt, was eine 25 % Glycerol-Lagerlösung ergibt. Vortex, um die Zellen gründlich zu mischen.
    2. Über Nacht im –80 °C Gefrierschrank aufbewahren. Für die Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff übergeben.
    3. Kratzen Sie den Glycerolstock mit einer sterilen 1000-μL-Spitze ab und mischen Sie sie zu 100 μL SDCAA+. Plattieren Sie diese Mischung auf eine SDCAA-Platte und inkubieren Sie sie kopfüber bei 30 °C.
    4. Wähle die Kolonien nach 3 Tagen aus und ziehe sie über Nacht in 1,5 ml SDCAA+ in 14-mL-Röhren.
  2. Führe Hefe-Miniprep durch, um Plasmide zu extrahieren
    1. Die Übernachtkultur durch Zentrifugation bei 16.000 g × g für 1 Minute aufgeben und in 200 μL Lösung 1 aus einem Hefeplasmid-Reinigungskit erneut suspendieren.
    2. Fügen Sie 5 μL lytische Enzymlösung (5 U/μL) hinzu.
    3. Inkubieren Sie 4 Stunden lang in einem 37 °C Inkubator auf einem End-to-End-Mixer.
    4. Führen Sie einen Gefrier-Tau-Zyklus durch, indem Sie bei -80 °C für 20 Minuten einfrieren und 10 Minuten bei 42 °C in einem Wasserbad auftauen.
    5. Fügen Sie 200 μL Lösung 2 aus einem Hefeplasmid-Reinigungsset hinzu, mischen Sie 2–3 Mal durch Invertieren und lassen Sie es 5 Minuten einwirken.
    6. Gib 400 μL Lösung 3 aus einem Hefeplasmid-Reinigungskit hinzu und mische durch Invertieren 2–3 Mal. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 5 Minuten.
    7. Plasmid-DNA wird mit einem Reinigungskit mit einer Säule mit hoher DNA-Bindungskapazität gereinigt.
      HINWEIS: Aufgrund der großen Menge an gescherener genomischer Hefe-DNA aus den lysierten Zellen muss eine Silika-basierte Säule mit einer höheren DNA-Bindungskapazität (35 μg) anstelle einer niedrigeren Hefeplasmid-DNA-Reinigungssäule (5 μg)15 verwendet werden.
    8. Missen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. Die DNA-Erträge betragen 10–30 ng/μL.
  3. Wandeln Sie gereinigte Plasmide in chemisch kompetente E.-coli-Zellen um
    1. Bereite SOC-Medien nach dem Rezept in Tabelle 5 und LB-Chloramphenikol-Teller vor. Heizen Sie außerdem ein Wasserbad auf 42 °C vor.
    2. Erwärme für jedes Plasmid eine LB-Chloramphenikol-Platte bei 37 °C für 20 Minuten.
    3. Nehmen Sie ein Rohr mit chemisch kompetenten Zellen aus dem –80 °C Gefrierfach und tauen Sie auf Eis auf.
    4. Aliquot 30 μL kompetenter Zellen pro Plasmid in ein 1,5 mL Rohr auf Eis.
    5. Pipette 3 μL Plasmid in kompetente Zellen. Rühren und 5 Minuten auf dem Eis stehen.
    6. Führen Sie einen Hitzeschock durch, indem Sie die Zellen kurzzeitig im Wasserbad bei 42 °C für 40 Sekunden inkubieren.
    7. Inkubiere 2 Minuten auf Eis.
    8. Gib 300 μL SOC-Medium zu den Zellen und inkubiere 15 Minuten bei 37 °C bei 220 U/min.
    9. Platte 50–100 μL umgewandelte kompetente Zellen auf vorgewärmte Platten.
    10. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C kopfüber für 18 Stunden.
  4. Kolonienpflücken
    1. Fügen Sie 5 ml flüssiges LB-Chloramphenikol-Medium in 14 ml Rundboden-Kulturröhrchen hinzu.
    2. Wähle eine Kolonie mit einer sterilen 1000-μL-Spitze aus und lasse sie in ein Kulturrohr fallen.
    3. Setzen Sie die Röhren in einen Shaker (220 U/min, 30°–45° Winkel, um die Belüftung zu maximieren) bei 37 °C für 18 Stunden.
  5. Plasmidextraktion aus bakterieller Flüssigkeitskultur
    1. Zentrifugiere die Flüssigkeitskulturen bei 3.200 × g für 4 Minuten. Kippe das Supernatant aus.
    2. Extrahiere Plasmide aus Übernachtkulturen mit einem Plasmid-Reinigungsset.
    3. Messen Sie die Konzentration gereinigter Plasmide mit einem Spektrophotometer.
  6. Reichen Sie Plasmide zur Sequenzierung ein
    HINWEIS: Nutzen Sie Dienste wie Whole-Plasmid-Nanopore-Sequenzierung oder alternativ Sanger-Sequenzierung mit einem Primer, der die mutagenisierte Region flankiert.

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Ergebnisse

Ein effizienter Bibliotheksaufbau ist entscheidend, um eine ausreichende Abdeckung des mutationalen Raums sicherzustellen. Um den Verlust seltener funktionaler Varianten zu vermeiden, sollte die Anzahl der Transformanten mindestens 10× bis 100 × der theoretischen Bibliotheksgröße erreichen. Da die Transformationseffizienz in S. cerevisiae von der Zellkonzentration beeinflusst wird und in frühen bis mittleren logaritimischen Zellen16 am höchsten ist, haben...

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Diskussion

Gerichtete Evolution ist eine Hochdurchsatzmethode, die iterative Zyklen der Diversifizierung und Selektion nutzt, um Proteine mit verbesserter oder neuartiger biochemischer Funktionzu identifizieren 17. In diesem Protokoll beschreiben wir einen optimierten Workflow zur Weiterentwicklung der Protease-Substrat-Erkennung mittels eines Zelloberflächen-Anzeigesystems in S. cerevisiae. Das Oberflächenanzeigesystem ordnet die Proteaseaktivität einem nachweisbar...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Die Rohdaten, die dieses Protokoll unterstützen, einschließlich Nanopore-Sequenzierungsdateien (FASTQ), Flowzytometriedateien (FCS) sowie Quelldaten, die zur Erstellung der Abbildungen und Tabellen verwendet wurden, sowie die Plasmide pDD1523 und pDD1524, wurden in Zenodo hinterlegt und sind öffentlich verfügbar unter 10.5281/zenodo.20746804

Danksagungen

Wir danken allen Mitgliedern des Dingal-Labors für ihre Ratschläge, Fachkenntnisse und Diskussionen. Wir danken auch dem UTD Flow Cytometry Core für die Infrastruktur und Unterstützung. Das M.B.L. wird vom Eugene McDermott Graduate Fellowship der UTD unterstützt. Diese Forschung wurde durch einen UTD Startup Fund und National Institutes of Health-NIGMS-Stipendien für das Labor von P.C.D.P.D. (R35GM150967) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
10 mM dNTP-MixNEBN0447SPCR-Reaktionen (Tabellen 1, 3)
10X PBS, pH 7,4FisherBP3994Färbepufferbasis (Schritte 3.2–3.3)
5X Q5-ReaktionspufferNEBB9027SWird separat verkauft; auch in Q5-Polymerase enthalten
Agar, BactoBD Difco281230-500gSDCAA-Agarplatten (Tabelle 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Gelelektrophorese
Anti-FLAG PE-AntikörperBioLegend637309FACS-Färbung; PE-konjugiertes anti-FLAG
Anti-HA-Tag-Antikörper [FITC]GenScriptA01621FACS-Färbung; FITC-konjugiertes anti-HA
Bacto CasaminosäurenBD Difco223120SDCAA+, SGCAA+, SCAA-Medien (Tabelle 5); 5 g/L
Bacto Pepton / TryptonRPIT60060-10000.0LB/SOB-Medienzubereitung; 20 g/L in YPD (Tabelle 5)
BSA, bovines Serumalbumin, Fraktion VSigma-Aldrich126575-10GM0,5% in PBS; Färbepuffer (Schritte 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SGolden Gate-Assembly des Substratkassetten (Tabelle 8)
Calciumchloridlösung (1 M)Sigma-Aldrich21115-100mLElektroporationspuffer: 1 mM Endkonzentration (Tabelle 5)
ColiRollers® PlattenbeadsSigma-Aldrich71013-3Sterilisiere durch Einlegen in Reagenzflaschen und Autoklavieren bei 121ºC, 15 psi, für 15 Min.
D-GalaktoseThermo FisherA12813.30250 g; 20% w/v-Vorrat für SGCAA+-Induktion (Tabelle 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Elektroporationspuffer (1 M) und Auswuchsmedium (Tabelle 5)
Dextrose (D-Glukose), wasserfreiSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v Dextrose-Vorrat (Tabelle 5)
Difco Hefennierstoffbasis ohne AminosäurenSigmaY0626-250G6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabelle 5)
Difco YPD-Bouillon (vorgemischt)BD242820-500gVorgefertigte YPD-Alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GKonditierungspuffer: 10 mM Endkonzentration; 250 μL aliquotieren, bei -20°C lagern
E.Z.N.A. CyclePure PCR-ReinigungskitOmega Bio-tekD6492-02PCR-Produktreinigung
E.Z.N.A. Gel-ExtraktionskitOmega Bio-tekD2500-01Gelreinigung nach PCR und Restriktionsverdau (Schritte 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid-DNA-Mini-Kit IOmega Bio-tekD6942-02Plasmidreinigung (Schritt 4.2)
Glycerol (≥99%)FisherBP229-450% v/v-Vorrat für Glycerinvorräte (Schritt 4.1.1)
Kanamycinsulfat FisherBP906-5SDCAA+ und SGCAA+: 50 μg/mL Endkonzentration; ersetzt Sigma K0879-5G
KLD-EnzymmixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI; zielgerichtete Mutagenese
KLD-ReaktionspufferNEBB0554AVerwendet mit KLD-Enzymmix
LB-Bouillon (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGE. coli-Flüssigkultur
Lithiumacetatdihydrat (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Konditierungspuffer: 0,1 M Endkonzentration; vor DTT hinzufügen (Tabelle 5)
Luria-Agar (Luria-Bertani-Agar)RPIL24020-2000.0E. coli-Bebrütung; ersetzt Sigma LB-Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur CasaminosäurenSigma2240-500GMAlternative Casaminosäurenquelle
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X Endkonzentration
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SVektorlinearisierung (Tabelle 10); HF-Version verwenden
Q5 HF DNA-PolymeraseNEBM0492SHochtreue Polymerase; Alternative zu Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028AFür PCR-Reaktionen mit hohem GC-Gehalt
Q5 Hot Start DNA-PolymeraseNEBM0491LPCR-Assembly und -Amplifikation (Tabellen 1, 3)
rCutSmart-Puffer (10X)NEBB6004SLiegt PstI-HF und SphI-HF bei (Tabelle 10)
SalI-HFNEBR3138LZusätzliches Restriktionsenzym
SOC-MediumNEBB902

Referenzen

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