Optimierter Workflow zur Anzeige von Hefeoberflächen für die gerichtete Entwicklung von Proteasen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf für die gerichtete Entwicklung viraler Proteasen in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung eines oberflächendisplaybasierten Selektionssystems. Es beschreibt das Design der DNA-Insert-Bibliothek und Substratkassetten, Elektroporation, die für eine hohe Transformationseffizienz optimiert ist, fluoreszenzaktivierte zellbasierte Auswahl für Proteasespaltung sowie die Sequenzierung angereicherter Varianten.

Zusammenfassung

Gerichtete Evolution ahmt den natürlichen Evolutionsprozess in einer schnellen, kontrollierten Laborumgebung nach, um Proteine mit wünschenswerten Funktionen oder Eigenschaften zu entwickeln. Das Screening eines großen Pools mutanten-proteinkodierender Gene ermöglicht die funktionelle Auswahl gewünschter Varianten für Anwendungen in Biotechnologie, Medizin und synthetischer Biologie. Mit diesem Protokoll führen wir eine gerichtete Evolution in Saccharomyces cerevisiae durch, um Proteasevarianten mit hoher Spezifität für eine nicht-native Substratsequenz zu entwickeln. Wir zeigen diese Proteasevarianten auf der Hefezelloberfläche, um die Auswahl der gewünschten Varianten mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) über mehrere Anreicherungsrunden zu erleichtern. Vier Schlüsselelemente der Substratkassette werden gemeinsam mit der Proteasebibliothek exprimiert: ein Fusionsprotein, das aus (i) der Hefeadhäsionsrezeptor-Untereinheit Aga2, (ii) Selektions- und (iii) Gegenselektionssubstratsequenzen, (iv) Epitop-Tag-Sequenzen und einer optionalen endoplasmatischen Retikulum (ER) Rückrufsignalsequenz besteht. Hefezellen, in denen nur die Selektionssubstratsequenz gespalten ist, werden mittels mehrfarbiger FACS über fluoreszierende (phycoerythrin/fluorescein isothiocyanat-markierte) Antiepitopen-Antikörper isoliert. Hier geben wir Details zum optimierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung einer Protease-Evolutionskampagne, einschließlich Design der DNA-Insert-Bibliothek und Substratkassettendesigns, Hefezellelektroporation mit hoher Transformationseffizienz (bis zu 109^{Transformanten} pro Mikrogramm DNA), FACS-basierter Selektion, Anreicherung und Sequenzierung evolvierter Varianten. Wir demonstrieren unser Directed Evolution-Protokoll, indem wir die Nuklearinklusion A-Protease (TEVp) des Tabak-Etch-Virus von der Spaltung ihrer natürlichen Substratsequenz ENLYFQ↓S bis zur Spaltung einer neuen Sequenz, ENLYFE↓S, entwickeln.

Einleitung

Cysteinproteasen der Familie Potyviridae, insbesondere die nuklearen Inklusionsproteasen A (NIa), stellen eine weitgehend ungenutzte Quelle sequenzspezifischer Endopeptidasen dar. Mit mehr als 3.800 charakterisierten Familienmitgliedern spalten NIa-Proteasen eine eigenständige Substratsequenz von sieben Aminosäuren. Die Potoveral-Familie bietet eine vielfältige Auswahl an Proteasen für die Entwicklung programmierbarer Proteinkontrollsysteme, den Aufbau orthogonaler proteasenbasierter genetischer Schaltkreise und die Entwicklung sequenzspezifischer biotechnologischer Werkzeuge ^1,2. Trotz dieser natürlichen Vielfalt wurden nur zwei NIa-Proteasen, TEVp und Tobacco Vin Mottling Virus Protease (TVMVp), umfassend charakterisiert und für den breiten Labor- und biotechnologischen Einsatz^{entwickelt 3,4}. Dieses begrenzte Protease-Toolkit begrenzt den Designraum für Mehrkomponentenschaltungen, die orthogonale Proteaseaktivitäten^{erfordern 5}, und motiviert somit Bemühungen, Nia-Proteasen durch eine gerichtete Evolution ^6,7 weiter zu erweitern und zu charakterisieren.

Die Hefeoberflächenanzeige hat sich als eine der leistungsstärksten Plattformen für gerichtete Evolution erwiesen und ermöglicht Hochdurchsatz-Proteinbibliotheksscreening mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)^6,7. Zum Beispiel koppelt das Hefe-Endoplasma-Retikulum-Sequestrationsscreening-System (YESS) die Proteaseaktivität über den sekretorischen Weg von S. cerevisiae ^6,7 an die Oberflächenpräsentation. Das YESS-System wurde eingesetzt, um neuartige Protease-Substrat-Spezifitäten zu entwickeln und hat sich als nützlich für mehrrundige Kampagnen zur gerichteten Evolution erwiesen. In diesem System werden Protease-Varianten mit einem Fusionsprotein koexprimiert, das eine Spaltsubstratkassette mit Epitopenmarkern enthält, und der Aga1p-Oberflächenanker wird im EBY100-Hefestamm exprimiert. Differenzielle Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern unterscheidet sich von nicht gespaltenen Substratkassetten, die auf der Zelloberfläche angezeigt sind. Dieser aktivitätsabhängige Darstellungsmechanismus ist direkt kompatibel mit iterativer FACS-basierter Auswahl für Bibliotheken von 10,⁷ oder mehr Varianten ^6,7.

Eine grundlegende Voraussetzung für gerichtete Evolution ist die Fähigkeit, Variantenbibliotheken in ausreichendem Maßstab einzuführen, um eine angemessene Abdeckung des angestrebten Sequenzraums zu erreichen. Für Standortsättigungs-Mutagenesebibliotheken, die mehrere Aminosäurepositionen umfassen, werden Transformationserträge von 10⁸ bis 10^{9 einzigartigen} Transformanten benötigt, um sicherzustellen, dass die in die Bibliothek eingeführte Vielfalt in der sortierten Population gut vertreten ist. Es existieren mehrere Methoden, um exogene DNA in S. cerevisiae einzuführen, jede mit unterschiedlichen Durchflussgrenzen. Die herkömmliche chemische Transformationsmethode verwendet Lithiumacetat/einzelsträngige Träger-DNA/Polyethylenglykol (LiAc/ssDNA/PEG) aufgrund ihrer Einfachheit und Zugänglichkeit. Allerdings erreicht sie typischerweise nur Transformationseffizienzen von 10⁴–10⁶ koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Mikrogramm DNA, was hinter der für große Bibliothekskampagnen erforderlichen Sequenzvariation liegt⁸. Im Gegensatz dazu verwendet die Elektroporationsmethode ein Hochspannungsfeld, um die Zellmembran vorübergehend zu permeabilisieren und die DNA-Aufnahme zu erleichtern. Die Elektroporation erzielt stets die höchsten Transformationseffizienzen unter den verfügbaren Transformationsmethoden, wobei optimierte Protokolle Erträge von 10⁸–10⁹ CFU⁹ angeben. Es wurde beobachtet, dass die Elektroporationseffizienz in S. cerevisiae kritisch empfindlich auf Zellwachstumsphase, DNA-Masse und Pufferzusammensetzung reagiert, was ein Rahmenwerk bietet, das seither weitgehend für bibliothövralische gerichtete Evolution⁹ angepasst wurde.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet den S. cerevisiae-Stamm EBY100, einen weit verbreiteten Wirtsstamm zur Anzeige von Hefeoberflächen. EBY100 wurde von Boder und Wittrup entwickelt, indem eine AGA1-Expressionskassette unter der Kontrolle des galaktose-induzierbaren GAL1-Promotors in das chromosomale AGA1-Lokus des proteasendefizienten Elternstamms BJ5465¹⁰ integriert wurde. Der Stamm ist kommerziell im ATCC erhältlich (Katalognummer MYA-4941; Depositor K.D. Wittrup), der den Genotyp MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−) trägt. Daher werden sowohl Aga1p als auch die Aga2p-Substrat-Kassettenfusion aus demselben galaktoseinduzierbaren Promotor exprimiert, wodurch sichergestellt wird, dass die beiden Untereinheiten ko-induziert und zum disulfidgebundenen Aga1p–Aga2p-Komplex zusammengesetzt werden, der die gezeigte Fusion an der Zellwand verankert.

Trotz der weit verbreiteten Verwendung von EBY100 in Hefedisplay-Anwendungen wurde kein veröffentlichtes Protokoll systematisch für die Elektroporation dieses Stammes in bibliotheksmaßstäbem Ertrag optimiert. EBY100-spezifische Parameter, wie die optimale Wachstumsphase bei der Ernte, die Mittelzusammensetzung während der Subkultur und die quantitative Beziehung zwischen der initialen optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) und der Transformationseffizienz, müssen weiterhin rigoros charakterisiert und optimiert werden. Hier berichten wir, dass die Transformationseffizienz in EBY100 monoton mit dem OD₆₀₀ der Kultur bei der Ernte zunimmt, wobei Zellen in der späten Logaritma-Phase deutlich höhere Transformationsraten erzielen als die in der frühen Logaritma-Phase. Wir bewerteten kritische Protokollparameter, darunter die anfänglichen OD_600-Werte bei der Impfung, die Verwendung von 2 × Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-Medium für Subkulturen, Elektroporationspufferformulierungen und Auswuchsbedingungen nach der Elektroporation. Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen optimierten Schritt-für-Schritt-Workflow (Abbildung 1A–C, Abbildung 2, Abbildung 3A–D, Abbildung 4A–E) zur Vorbereitung elektrokompetenter EBY100-Zellen und zur Durchführung hocheffizienter DNA-Bibliothekselektroporation, wobei Transformationsraten konstant über 10,9 liegen CFU. Um dieses Protokoll zu validieren, führten wir eine umfassende Directed Evolution-Kampagne durch, um TEVp mit veränderter Spaltspesifität über vier Runden FACS-basierter Auswahl und Anreicherung hinweg zu entwickeln. Die Sequenzierung angereicherter Protease-Varianten bestätigte eine erhebliche Diversifizierung bei gezielten Resten innerhalb der substratbindenden Tasche der Protease und zeigt, dass das Protokoll eine ausreichende Bibliotheksabdeckung des Sequenzraums bietet, um produktive Evolutionskampagnen zu unterstützen. Dieses Protokoll wird für Forscher, die EBY100 für die auf Hefeoberflächendisplay basierende gerichtete Evolution und FACS-kompatible, hochdurchsetzte Screening von Proteasen, Antikörpern⁹, Kinasen¹¹ und Rezeptoren¹² sowie anderen Proteinen verwenden, von großem Nutzen sein.

Protokoll

Alle Experimente mit rekombinanter S. cerevisiae wurden gemäß den Richtlinien und Verfahren des Institutional Biosafety and Chemical Safety Committee der University of Texas at Dallas durchgeführt. Rekombinante Hefestämme wurden gemäß etablierten institutionellen mikrobiologischen Praktiken unter Biosicherheits-Level-1-Level-1 (BSL-1)-Eindämmung behandelt. Elektroporation, Kultur und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurden gemäß genehmigten institutionellen Biosicherheitsverfahren durchgeführt. Hefekulturen und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden gemäß institutionellen Richtlinien dekontaminiert und als biologisch gefährlicher Abfall entsorgt.

1. Vektor- und Insert-Vorbereitung

1. Erzeugung potöveraler Proteasebibliotheken durch Standortsättigungsmutagenese
   1. Entwurf mit Sequenzdesign-Software, die 30- bis 50-mer, Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotiden überlappt, um eine mutierte Bibliothek von Proteasen zu erzeugen. Ersetzen Sie das Wildtyp-Codon im entsprechenden Oligonukleotid durch ein NNS-entartetes Codon, wobei N A, T, G oder C repräsentiert und S G oder C für Positionen, die für die Mutagenese vorgesehen sind.
   2. Entwerfen Sie die 3′-Überlappung zwischen jedem Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidpaar mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 55–60 °C. Entwerfen Sie die ersten und letzten Oligonukleotide so, dass sie eine Überlappung von 50 NT mit dem Hefeoberflächen-Displayvektor jenseits der Restriktionsstellen enthalten.
   3. Stellen Sie sicher, dass mindestens ein Ende des Inserts genau ein Ende des linearisierten Vektors überlappt, um homologe Rekombination¹³ zu ermöglichen. Vermeiden Sie Lücken zwischen benachbarten Oligonukleotiden¹⁴.
   4. Oligos auf 100 μM mit deionisiertem H2_{O wieder}suspendieren. In einem sterilen 1,5-mL-Rohr werden 0,5 μL jedes Oligos zu einem Endvolumen von 200 μL kombiniert (Endkonzentration von 250 nM pro Oligo).
   5. Richten Sie eine PCR-Reaktion mit den in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten ein, um die Proteasebibliothek unter Verwendung der Thermocycling-Bedingungen aus Tabelle 2 zusammenzustellen.
   6. Richten Sie eine zweite PCR-Reaktion mit den äußersten vorwärts- und rückwärts-Oligos auf (Tabelle 3) ein, wobei das erste zusammengesetzte PCR-Produkt als Vorlage dient. Verstärken Sie das Produkt wie in Tabelle 4 gezeigt.
   7. Führe das zweite PCR-Produkt auf einem 1%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,5 μg/mL) bei 240 V für 30 Minuten durch. Entfernen Sie das Band, das der erwarteten DNA-Länge entspricht.
      HINWEIS: VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein Mutagen und sollte mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) behandelt werden, darunter Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Entsorgen Ethidiumbromidhaltige Gele, Puffer und Verbrauchsgüter als gefährliche chemische Abfälle gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien.
   8. Reinigen Sie mit einem Gel-Extraktionsset. Elut in 50 μL deionisiertes H₂O.
   9. Misse die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. Lagere die DNA bei −20 °C.
      HINWEIS: Jede 50-μL-Reaktion der^{zweiten PCR} ergibt etwa 0,5–1,0 μg Gesamt-DNA. Da jede Elektroporation 12 μg der Proteasebibliothek (d. h. Insert) benötigt, skalieren Sie die Reaktionen entsprechend.
2. Kassettenmontage des Substrats
   1. Bereite LB-Agarplatten und LB-Chloramphenicol-Flüssigmedien vor. Siehe Rezepte in Tabelle 5.
   2. Entwerfen Sie einen Satz überlappender 30-Mer-Oligonukleotide in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung für die Montage der Substratkassette. Entwerfen Sie die 5′-Enden jedes Reverse-Oligonukleotids und das vordere Oligonukleotid des nächsten Fragments so, dass sie mit 4 Nukleotiden übereinstimmen.
   3. Suspendiere lyophilisierte Oligos auf 100 μM mit deionisiertem H₂O.
   4. Reagenzien wie in Tabelle 6 mischen.
   5. Verwenden Sie das Zyklusprogramm in Tabelle 7 , um den Oligo-Mix zu annealisieren und phosphorylieren.
   6. Verdünnte geglühte Oligos vierfach in deionisiertem H₂O, um eine Endkonzentration von 1,25 μm zu erreichen.
   7. Kombinieren Sie das geglühte Oligo-Mix mit dem Vektor (z. B. pDD1523) und folgen Tabelle 8.
   8. Führen Sie die Golden Gate-Montage nach dem Radprogramm in Tabelle 9 durch.
      HINWEIS: Zum Beispiel besitzt das pDD1523-Plasmid eine Typ-IIS-Restriktionsstelle (BsmBI) stromabwärts des GAL1/10-Promotors. Eine erfolgreiche Montage ermöglicht die Galaktose-Induktion der Substratkassette⁷.
   9. Transformiere das resultierende Plasmid in E. coli.
   10. Plattenzellen auf LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum. Inkubieren Sie 16–18 Stunden bei 37 °C.
   11. Wähle isolierte Kolonien aus und impfe sie in 5 ml LB-Medien. Über Nacht (16–18 H) bei 37 °C mit Schütteln (220 U/min) inkubieren.
   12. Extrahiere Plasmide aus Übernachtkulturen mit einem Plasmid-Miniprep-Kit.
   13. Messen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektrophotometer und senden Sie dann eine Sequenzierung an.
3. Linearisierung des Hefedisplayvektors
   1. Linearisieren Sie das Hefedisplayplasmid, z. B. vergären Sie pDD1524 mit SphI- und PstI-Restriktionsenzymen, um den Hefedisplayvektor mit der Substratkassette für die Elektroporation vorzubereiten. Mischen Sie die in Tabelle 10 aufgeführten Reagenzien und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde.
   2. Lasse das Restriktionsverdauungsprodukt 30 Minuten lang auf einem 1%igen Agarosegel bei 240 V laufen. Entfernen Sie das Band, das der erwarteten DNA-Länge entspricht, und reinigen Sie es mit einem Gelextraktionskit.
      HINWEIS: Jede 50 μL Restriktionsverdauung ergibt etwa 0,5–1,0 μg Gesamt-DNA. Da jede Elektroporation 4 μg linearisierten Vektor benötigt, skalieren Sie die Verdauungsreaktionen entsprechend.

2. Elektroporation

Hinweis: Befolgen Sie institutionelle Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit biologischen Materialien und Reagenzien, tragen Sie geeignete PSA und entsorgen Sie biologische sowie chemische Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien.

1. Vorbereitung von Puffern, Platten und Medien (2 Tage vor der Elektroporation)
   1. Bereite Wachstumsmedien vor (1 × YPD; 2 × YPD; Synthetische Dextrose-Casaminosäuren, SDCAA+; und synthetische Galaktose-Casaminosäuren, SGCAA+), Platten (YPD und SDCAA), Elektroporationspuffer und steriles Wasser gemäß den Rezepten in Tabelle 5. Lagern Sie bei 4 °C.
2. Vorbereitung einer gestreiften Platte von EBY100.
   1. Streue EBY100-Hefe auf YPD-Agar aus einem Glycerolfond. Wachsen Sie bei 30 °C für 2 Tage.
   2. Lagern Sie den Teller nach dem Wachstum bei 4 °C.
      HINWEIS: Eine gestreifte Platte bleibt bis zu einem Monat benutzbar; Markiere das Streak-Datum auf dem Teller.
3. Herstellung der EBY100-Vorkultur (1 Tag vor der Elektroporation)
   1. Bereiten Sie 125 mL 1 × YPD in einer 500 mL Erlenmeyer-Flasche vor.
   2. Bereiten Sie 25 ml 1 × YPD in einem 50-mL konischen Rohr vor. Mit einer Mikropipettenspitze entnehmen Sie EBY100-Zellen von der Platte, die zwei Tage lang gewachsen ist. Anschließend werden die Hefezellen von der Pipettenspitze in das konische Rohr mit 1 × YPD übertragen.
      HINWEIS: Der Zellstreifen sollte einen Abstrich von etwa 1–2 mm Länge bilden.
   3. Entfernen Sie die Mikropipettenspitze und lassen Sie das konische Rohr vortexen, um eine ausreichende Mischung sicherzustellen.
   4. Bereiten Sie eine 150-mL-Vorkultur vor, indem Sie 25 mL von 1 × YPD mit den Hefezellen in den 500-mL-Kolben mit 125 mL 1 × YPD übergeben. Wirbel zum Mixen.
   5. Mit einem Spektrophotometer wird der OD₆₀₀ gemessen, indem zwei Mikrocuvetten mit einer Weglänge von 1 cm vorbereitet werden: eine mit 1 mL 1 × YPD als Rohstoffkontrolle und eine weitere mit 1 mL der Vorkultur
   6. Über Nacht (16–20 H) werden 150 ml Vorkultur bei 30 °C mit orbitalem Schütteln bei 270 U/min angebaut.
4. Vorbereitung der Subkultur bei gewünschtem Anfangs-OD₆₀₀ (am Tag der Elektroporation)
   1. Bereiten Sie den Konditionierungspuffer und das Auswuchsmedium vor, wie in Tabelle 5 beschrieben.
   2. Messen Sie den OD₆₀₀ der nächtlichen Vorkultur (erwarteter OD₆₀₀ beträgt 17–22). Um im linearen Bereich des Spektrophotometers zu liegen, misst man eine Verdünnung der Vorkultur im Wert von 1:20.
   3. Berechnen Sie das Volumen der Vorkultur, das benötigt wird, um eine 100-mL-Subkultur zu impfen. Eine anfängliche Subkultur OD₆₀₀ von 3,0–4,0 wird empfohlen.
   4. Verdünnen Sie die Kultur auf den gewünschten Anfangs-OD₆₀₀ in 100 ml 2 × YPD in einer 500 mL Erlenmeyer-Flasche.
   5. Inkubieren Sie die 100-mL-Subkultur bei 30 °C mit Orbitalschütterung bei 270 U/min für 4 Stunden.
5. Vorbereitung des Mediums während der 4-stündigen Inkubation
   1. Halten Sie einen eiskalten Elektroporationspuffer und steriles Wasser bereit (ab Schritt 2.1.1).
   2. Bereiten Sie einen Konditionierungspuffer (100 mL) vor, gemäß dem Rezept in Tabelle 5. Verwenden Sie pro Transformation 20 ml Konditionierungspuffer; Skaliere entsprechend auf. Lagern Sie bei Raumtemperatur (20–23 °C).
      HINWEIS: VORSICHT: Der Pflegepuffer enthält Dithiothreitol (DTT) und Lithiumacetat (LiAc), chemische Reizstoffe, die Haut- und Augenreizungen verursachen können. Tragen Sie geeignete PSA, einschließlich Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen, und behandeln Sie diese Reagenzien gemäß den institutionellen Chemikalienschutzvorschriften. Entsorgen ungenutzte Lösungen und verbrauchte Puffer als chemische Abfälle gemäß institutionellen Richtlinien.
   3. Auswuchsmedium (50 ml) vorbereiten: 25 ml 2 × YPD und 25 ml 1 m Sorbitol mischen. Verwenden Sie pro Transformation 8 ml Auswuchsmedium. Lagern Sie bei Raumtemperatur (20–23 °C).
6. Herstellung elektrokompetenter Hefezellen nach 4 Stunden Inkubation.
   1. 100 mL Subkultur in zwei 50 mL konische Röhren aufteilen. Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten sammeln und dann das Medium dekantieren. Lassen Sie die Zellen auf Eis, bis Schritt 2.6.4 abgeschlossen ist.
   2. Jede Zellkugel wird vorsichtig mit 25 ml eiskaltem sterilem Wasser wieder suspendiert. Zentrifugiere bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten, dann dekantiere das Medium.
   3. Wiederhole Schritt 2.6.2.
   4. Jede Zellkugel wird vorsichtig mit 25 ml eiskaltem Elektroporationspuffer wieder suspendiert. Zentrifugieren Sie bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten, dann dekantieren Sie das Medium.
   5. Entfernen Sie die Zellen aus dem Eis und suspendieren Sie jede Zellkugel vorsichtig mit 10 ml Raumtemperatur-Conditionerpuffer (20–23 °C) wieder. Anschließend werden Sie in eine einzelne 125-mL Erlenmeyer-Flasche gesammelt und 30 Minuten lang bei 30 °C mit orbitalem Schütteln bei 270 U/min inkubiert.
   6. Gib die Zellen in ein 50-ml-Rohr. Zentrifugiere bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten. Dekantiere die Medien.
   7. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig mit 50 ml eiskaltem Elektroporationspuffer wieder suspendieren. Zentrifugieren Sie bei 4 °C und 1.500 × g für 3 Minuten, dann übergeben Sie das Medium.
   8. Suspendieren Sie das Zellpellet auf ein Endvolumen von 1 mL wieder, indem Sie etwa 100–200 μL Elektroporationspuffer hinzufügen. Lass die Zellen bis zur Elektroporation auf Eis.
      HINWEIS: Elektrokompetente Zellen können eingefroren (d. h. in einem –80 °C Gefrierschrank platziert werden) und später ohne nennenswerten Verlust der Elektroporationseffizienz verwendet werden.
7. Elektroporation, Auswachsen und Beschichtung
   1. Vorkühl-Elektroporationscuvetten mit einer Spaltgröße von 0,2 cm auf Eis.
   2. Übertragen Sie 380 μL des resuspendierten Pellets auf ein steriles 1,5-mL-Rohr. Mischen Sie mit 4 μg Plasmid-DNA oder 4 μg linearisiertem Plasmidvektor und 12 μg Insert. Sanft durch Pipettern vermischen.
      HINWEIS: Um die Anzahl der elektroporierten Zellen zu maximieren, sollten Vektor- und Insert-DNA-Konzentrationen idealerweise 700–800 ng/μL betragen. Wenn die Konzentrationen niedriger sind, verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator.
   3. Federung wird in die vorgekühlte Elektroporationscuvette(n) übertragen. Lass sie 5 Minuten auf dem Eis.
   4. Wischen Sie nach 5 Minuten die Seiten der Cuvette mit einem fusselfreien Labortuch ab, um Restfeuchtigkeit zu entfernen, die während der Elektroporation zu Lichtbögen führen kann. Vermeiden Sie Blasen oder Zellen oberhalb der Metallplatten in der Cuvette, da diese ebenfalls zu Lichtbögen führen können. Um die kalte Temperatur der Cuvette aufrechtzuerhalten, sollten Sie die Plattenelektroden nicht berühren.
   5. Bereiten Sie 8 ml Auswuchsmedium in einem 50-mL konischen Rohr vor.
   6. Elektropolieren Sie die Zellen mit folgenden Einstellungen: Eine Spannung von 2,5 kV, eine Kapazität von 25 μF und ein Widerstand von 200 Ω⁹. Der akzeptable Zeitkonstantenbereich beträgt 2,8–4,5 ms.
      HINWEIS: VORSICHT: Die Elektroporation beinhaltet Hochspannungsimpulse. Stellen Sie sicher, dass die Cuvetten richtig sitzen und folgen Sie den Betriebsanweisungen des Herstellers. Entsorgen gebrauchte Elektroporationscuvetten als biologisch gefährliche Abfälle gemäß institutionellen Richtlinien.
   7. Füllen Sie die Cuvette sofort mit etwa 200 μL Auswuchsmedium aus dem konischen Rohr und übertragen Sie elektroporierte Zellen in das 50 mL große konische Rohr. Fügen Sie weitere 200–350 μL Auswuchsmedium hinzu, bis keine sichtbare Flüssigkeit mehr in der Cuvette verbleibt.
   8. Inkubieren Sie das 50 mL konische Rohr mit elektroporierten Zellen in 8 mL Auswuchsmedium bei 30 °C ohne Schütteln für 1 H. Wenden Sie das Rohr alle 15 Minuten um, um zu mischen.
   9. Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 × g, 25 °C für 3 Minuten sammeln. Dann dekantieren Sie die Medien.
   10. Stellen Sie die Zellen in geeigneten Hefedropout-Medien wieder auf, um die Selektion für transformierte Zellen aufrechtzuerhalten. Bei Plasmiden, die den TRP1-Selektionsmarker enthalten, werden Zellen in 250 mL SDCAA+ (das kein Tryptophan enthält) neu suspendiert, um selektiv Hefe zu gewinnen, die das Plasmid zurückgehalten hat.
   11. Inkubieren Sie über Nacht (16–20 H) bei 30 °C mit Orbital-Schütteln bei 270 U/min.

3. Induktion, Färbung und Flowzytometrische Sortierung von Hefezellen

1. Induktion der Proteasebibliothek und Substratkassette (1 Tag vor der Sortierung)
   1. Messung von OD₆₀₀ wie in Schritt 2.4.2 nach dem nächtlichen Wachstum der Transformanten in Dropout-Medien.
   2. Aliquot 12 ml Hefe-Transformanten und Zentrifuge bei 3.200 × g für 5 Minuten.
   3. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in SGCAA+-Induktionsmedium auf einen OD₆₀₀ von 0,5. Berechnen Sie das erforderliche Aufhängungsvolumen mit der Verdünnungsgleichung C₁V₁ = C₂V₂.
   4. In eine 125-ml-Erlenmeyer-Flasche übertragen und über Nacht 18–24 Stunden bei 30 °C mit Orbital-Schütteln bei 270 U/min wachsen lassen.
2. Fluoreszierende Antikörperfärbung (am Tag der Sortierung)
   1. Messen Sie den OD₆₀₀ der Zellen nach der Induktion. Verwenden Sie zwei Cuvetten: eine mit 1 ml SGCAA+ und eine andere mit 950 μL SGCAA+, gemischt mit 50 μL Zellen. Multiplizieren Sie den gemessenen OD_600-Wert mit 20, um den tatsächlichen OD₆₀₀ der Post-Induktionszellen zu erhalten.
   2. Normalisieren Sie jede Probe auf 3 × 10^{7 Zellen zur} Antikörperfärbung und FACS-Sortierung. Verwenden Sie C₁V₁ = C₂V₂ , um das Volumen der Zellen zu berechnen, die vom Induktionskolben übertragen werden sollen.
      HINWEIS: Für die Vier-Standort-NNS-Sättigungsmutagenese beträgt die theoretische Bibliotheksgröße 10^{6 Varianten} . Um die Bibliothek ausreichend zu sampeln, screenen Sie mindestens 10-mal die Bibliotheksgröße oder 10 bis⁷ Zellen. Beispiel: Wenn gewünscht C₁V₁ = 3 × 10⁷ Zellen und C₂ = nach der Induktion OD₆₀₀ von 6 (d. h. 6 × 10⁷ Zellen/mL) gewünscht sind, dann aliquot 500 μL induzierter Zellen (d.h. V₂ = 3 × 10⁷ Zellen / 6 × 10⁷ Zellen/mL = 500 μL).
   3. Übertragen Sie das berechnete Zellvolumen in ein 1,5-ml-Rohr und zentrifugieren Sie bei 5.000 × g für 5 Minuten.
   4. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie es in 500 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA).
   5. Zentrifugiere bei 5.000 × g für 5 Minuten und wiederhole Schritt 3.2.4.
   6. Zentrifugiere bei 5.000 × g für 5 Minuten und schließe in der Zwischenzeit Schritt 3.2.7 ab.
   7. Bereiten Sie eine Antikörper-Färbemischung in einem 1,5-ml-Rohr vor, das Anti-HA-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (0,5 μg/10⁷ Zellen), Anti-FLAG-Phycoerythrin (PE) (0,05 μg/10⁷ Zellen) und PBS + 0,5 % BSA (100 μL/10⁷ Zellen) enthält. Lass das Rohr auf Eis.
   8. Entferne das Überlagermittel und suspendiere es mit der Fleckmischung erneut. Verwenden Sie 300 μL der Farbmischung pro 3 × 10^{7 Zellen} . Nicht vortexen lassen; Nur umkehren oder flicken.
   9. Lassen Sie die Zellen nach der Resuspension im Dunkeln eine Stunde lang auf Eis.
3. Nach-Verfärbungswaschen
   1. Zentrifugengefärbte Zellen bei 5.000 × g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Überdachungsmittel und suspendieren Sie das Pellet in PBS mit 0,5 % BSA mit 0,5 mL pro 1 × 10^{7 Zellen (} z. B. 500 μL für 1 × 10⁷ Zellen oder 1,5 mL für 3 × 107^Zellen ).
   2. Zentrifugiere bei 5.000 × g, 5 Minuten. Supernatant entfernen, in 750 μL PBS + 0,5 % BSA neu suspendieren.
   3. Übertragen Sie weitere 750 μL PBS + 0,5 % BSA auf ein 10 mL Sammelrohr.
4. FACS
   1. Führen Sie den notwendigen Start und die Vorbereitung des Zytometers für ein neues Experiment durch.
   2. Erstelle drei Punktdiagramme. Beim ersten Punktdiagramm wählen Sie den Namen der X-Achse aus, um den Kanal für den vorderen Streubereich (FSC-A) anzuzeigen, und den Y-Achsen-Namen, um den Seiten-Streuflächenkanal (SSC-A) anzuzeigen.
      HINWEIS: Dies erleichtert die Auswahl lebender Zellen.
   3. Behalte den X-Achsen-Namen, um den FSC-A-Kanal anzuzeigen, während der Y-Achsen-Kanal auf der zweiten Punktdiagramm-Präsentation der Vorwärts-Streuhöhe (FSC-H) geändert wird.
      HINWEIS: Dies erleichtert die Auswahl der Singlets.
   4. Wählen Sie den Namen der X-Achse aus, um den PE-Kanal anzuzeigen, und den Namen der Y-Achse, um den FITC-Kanal im dritten Punktdiagramm anzuzeigen.
   5. Führe eine negative Kontrolle am Zytometer mit den 530/30 nm (FITC) und 585/42 nm (PE) Kanälen durch. Sortieren Sie mit einer 70-μm-Düse bei 70 psi Manteldruck. Proben werden mit einer Geschwindigkeit von 4000–5000 Ereignissen pro Sekunde erfasst.
   6. Zeichnen Sie ein Polygongatter um die Hauptpopulation intakter Hefezellen, um Ablagerungen und kleine Partikel mit niedrigen FSC-A- und SSC-A-Signalen auf dem ersten Punktdiagramm (FSC-A versus SSC-A) auszuschließen.
   7. Gate-Singlets auf einem FSC-H versus FSC-A-Plot innerhalb dieses Gates, indem die lineare Population ausgewählt wird, die eine proportionale Beziehung zwischen FSC-H und FSC-A aufweist. Ereignisse werden ausgeschlossen, die von der linearen Verteilung abweichen und Doublets und Zellaggregaten entsprechen.
      HINWEIS: Das dritte Punktdiagramm für PE versus FITC zeigt einen diagonalen Cluster von Punkten für die negative Kontrolle (d. h. Hefezellen, die die intakte Substratkassette exprimieren).
   8. Führe Proben aus und sortiere Hefezellen basierend auf den gewünschten PE/FITC-Werten in ein Sammelröhrchen. Analysieren Sie eine Gesamtzahl von Zellen, die mindestens dem 10-fachen der theoretischen Bibliotheksgröße entsprechen, um eine angemessene Darstellung aller Varianten sicherzustellen (z. B. analysieren Sie ~1 × 107^{Zellen für} eine Bibliothek mit einer theoretischen Diversität von ~1 × 106^Varianten ).
   9. Positioniere das Sortiergatter unterhalb der PE/FITC-Diagonale der negativen Kontrollpopulation.
      HINWEIS: Strengere Gates verbessern die Anreicherung der gewünschten Varianten, verringern jedoch die Zellrückgewinnung.
5. Nach FACS
   1. Zentrifugen-Sammelrohr(e) mit 3.200 × g für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant, lassen Sie 1 ml übrig, und lassen Sie es in 5 ml PBS nachziehen.
      HINWEIS: Lassen Sie 1 ml Supernatant übrig, da das Zellpellet am Boden nach der Zentrifugation nicht mehr sichtbar ist.
   2. Zentrifugiere die Zellen erneut bei 3.200 × g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Supernatant, lassen Sie 1 ml übrig. Wieder aufhängen mit 4 ml SDCAA+.
   3. In einer 250-ml-Erlenmeyer-Flasche fügen Sie 15 ml SDCAA+ hinzu. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen aus Schritt 3.5.2 in diese Flasche.
   4. Über Nacht 18–24 Stunden bei 30 °C mit Orbitalschütteln bei 270 U/min.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1, 3.2, 3.3 und 3.4 für jede Runde der gerichteten Evolution.

4. Plasmidrückgewinnung und Sequenzierung einzelner Klone

1. Einzelne Kolonien anbauen
   1. Man stellt einen Glycerolfond her, indem man nach Schritt 3.5.4 500 μL der Flüssigkeitskultur und 500 μL steriles 50 % Glycerol mischt, was eine 25 % Glycerol-Lagerlösung ergibt. Vortex, um die Zellen gründlich zu mischen.
   2. Über Nacht im –80 °C Gefrierschrank aufbewahren. Für die Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff übergeben.
   3. Kratzen Sie den Glycerolstock mit einer sterilen 1000-μL-Spitze ab und mischen Sie sie zu 100 μL SDCAA+. Plattieren Sie diese Mischung auf eine SDCAA-Platte und inkubieren Sie sie kopfüber bei 30 °C.
   4. Wähle die Kolonien nach 3 Tagen aus und ziehe sie über Nacht in 1,5 ml SDCAA+ in 14-mL-Röhren.
2. Führe Hefe-Miniprep durch, um Plasmide zu extrahieren
   1. Die Übernachtkultur durch Zentrifugation bei 16.000 g × g für 1 Minute aufgeben und in 200 μL Lösung 1 aus einem Hefeplasmid-Reinigungskit erneut suspendieren.
   2. Fügen Sie 5 μL lytische Enzymlösung (5 U/μL) hinzu.
   3. Inkubieren Sie 4 Stunden lang in einem 37 °C Inkubator auf einem End-to-End-Mixer.
   4. Führen Sie einen Gefrier-Tau-Zyklus durch, indem Sie bei -80 °C für 20 Minuten einfrieren und 10 Minuten bei 42 °C in einem Wasserbad auftauen.
   5. Fügen Sie 200 μL Lösung 2 aus einem Hefeplasmid-Reinigungsset hinzu, mischen Sie 2–3 Mal durch Invertieren und lassen Sie es 5 Minuten einwirken.
   6. Gib 400 μL Lösung 3 aus einem Hefeplasmid-Reinigungskit hinzu und mische durch Invertieren 2–3 Mal. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 5 Minuten.
   7. Plasmid-DNA wird mit einem Reinigungskit mit einer Säule mit hoher DNA-Bindungskapazität gereinigt.
      HINWEIS: Aufgrund der großen Menge an gescherener genomischer Hefe-DNA aus den lysierten Zellen muss eine Silika-basierte Säule mit einer höheren DNA-Bindungskapazität (35 μg) anstelle einer niedrigeren Hefeplasmid-DNA-Reinigungssäule (5 μg)¹⁵ verwendet werden.
   8. Missen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. Die DNA-Erträge betragen 10–30 ng/μL.
3. Wandeln Sie gereinigte Plasmide in chemisch kompetente E.-coli-Zellen um
   1. Bereite SOC-Medien nach dem Rezept in Tabelle 5 und LB-Chloramphenikol-Teller vor. Heizen Sie außerdem ein Wasserbad auf 42 °C vor.
   2. Erwärme für jedes Plasmid eine LB-Chloramphenikol-Platte bei 37 °C für 20 Minuten.
   3. Nehmen Sie ein Rohr mit chemisch kompetenten Zellen aus dem –80 °C Gefrierfach und tauen Sie auf Eis auf.
   4. Aliquot 30 μL kompetenter Zellen pro Plasmid in ein 1,5 mL Rohr auf Eis.
   5. Pipette 3 μL Plasmid in kompetente Zellen. Rühren und 5 Minuten auf dem Eis stehen.
   6. Führen Sie einen Hitzeschock durch, indem Sie die Zellen kurzzeitig im Wasserbad bei 42 °C für 40 Sekunden inkubieren.
   7. Inkubiere 2 Minuten auf Eis.
   8. Gib 300 μL SOC-Medium zu den Zellen und inkubiere 15 Minuten bei 37 °C bei 220 U/min.
   9. Platte 50–100 μL umgewandelte kompetente Zellen auf vorgewärmte Platten.
   10. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C kopfüber für 18 Stunden.
4. Kolonienpflücken
   1. Fügen Sie 5 ml flüssiges LB-Chloramphenikol-Medium in 14 ml Rundboden-Kulturröhrchen hinzu.
   2. Wähle eine Kolonie mit einer sterilen 1000-μL-Spitze aus und lasse sie in ein Kulturrohr fallen.
   3. Setzen Sie die Röhren in einen Shaker (220 U/min, 30°–45° Winkel, um die Belüftung zu maximieren) bei 37 °C für 18 Stunden.
5. Plasmidextraktion aus bakterieller Flüssigkeitskultur
   1. Zentrifugiere die Flüssigkeitskulturen bei 3.200 × g für 4 Minuten. Kippe das Supernatant aus.
   2. Extrahiere Plasmide aus Übernachtkulturen mit einem Plasmid-Reinigungsset.
   3. Messen Sie die Konzentration gereinigter Plasmide mit einem Spektrophotometer.
6. Reichen Sie Plasmide zur Sequenzierung ein
   HINWEIS: Nutzen Sie Dienste wie Whole-Plasmid-Nanopore-Sequenzierung oder alternativ Sanger-Sequenzierung mit einem Primer, der die mutagenisierte Region flankiert.

Ergebnisse

Ein effizienter Bibliotheksaufbau ist entscheidend, um eine ausreichende Abdeckung des mutationalen Raums sicherzustellen. Um den Verlust seltener funktionaler Varianten zu vermeiden, sollte die Anzahl der Transformanten mindestens 10× bis 100 × der theoretischen Bibliotheksgröße erreichen. Da die Transformationseffizienz in S. cerevisiae von der Zellkonzentration beeinflusst wird und in frühen bis mittleren logaritimischen Zellen¹⁶ am höchsten ist, haben wir die anfängliche Zelldichte vor der Elektroporation optimiert. Hefekulturen wurden mit anfänglichen_{OD-600-Werten} von 1,0–4,0 subkultiviert und 4 Stunden lang inkubiert (n = 2–4 unabhängige biologische Experimente), danach wurden die endgültigen_OD-600-Werte auf die Wachstumskurve von S. cerevisiae abgebildet, um zu bestätigen, dass die Zellen in der mittleren Logaritma-Wachstumsphase verblieben (Abbildung 5A, ergänzende Abbildung 1).

Die Elektroporation dieser Kulturen mit 4-μg-Plasmid-DNA (n = 2 unabhängige biologische Experimente) zeigte, dass die Transformationseffizienz zwischen den anfänglichen_{OD-600-Bedingungen} signifikant unterschied (Einweg-ANOVA, p = 8,92 × 10⁻⁷). Im Vergleich zu Kulturen, die bei OD₆₀₀ = 1,0 begonnen wurden, führten alle höheren Anfangszelldichten zu signifikant höheren Transformationseffizienzen (Dunnetts Mehrfachvergleichstest; OD₆₀₀ = 1,5, bereinigt p = 0,0020; OD₆₀₀ ≥ 2,0, bereinigt p < 0,0001), mit der höchsten Transformationseffizienz bei einem initialen OD₆₀₀ von 4,0. Um die natürliche Fähigkeit von Hefezellen zur homologen Rekombination zu nutzen, haben wir außerdem 4 μg des linearisierten Plasmidvektors und 12 μg des Inserts (d. h. Proteasebibliothek) in Hefezellen elektroporiert (n = 2 unabhängige biologische Experimente). Die Transformationseffizienz unterschied sich signifikant zwischen den getesteten initialen_{OD-600-Bedingungen} (Einweg-ANOVA, p = 0,0023). Im Vergleich zu Kulturen, die bei OD₆₀₀ = 1,0 begonnen wurden, waren die Transformationseffizienzen bei OD₆₀₀ = 3,0 (bereinigt p = 0,0018), 3,5 (angepasst p = 0,0062) und 4,0 (angepasst p = 0,0024) (Dunnetts Mehrfachvergleichstest) signifikant höher. Wir beobachteten die höchste Transformationseffizienz bei einer moderaten anfänglichen Subkulturdichte (OD₆₀₀ = 3,0), was auf ein optimales Gleichgewicht zwischen Zellkompetenz und Rekombinationseffizienz unter diesen Bedingungen hinweist (Abbildung 5B). Im Vergleich zur reinen Plasmidtransformation ergab die Ko-Elektroporation eines linearisierten Vektors und eines Proteasebibliotheks-Einsatzes (n = 2 unabhängige biologische Replikate) signifikant höhere Transformationseffizienzen über die getesteten Anfangsbedingungen von OD₆₀₀ (zweiwege-ANOVA bei log10-transformierten Transformationseffizienzen, p = 9,40 × 10⁻¹²). Im Durchschnitt führte die Ko-Elektroporation zu einer durchschnittlichen 121-fachen Steigerung der Transformationseffizienz (95 % KI, 63–233-fach) im Vergleich zur reinen Plasmidtransformation (Abbildung 5B).

Während eines FACS-Laufs von Hefezellen, die die mutierte Proteasebibliothek und die Substratauswahlkassette enthalten (Abbildung 6A), zeigen die Zellen entweder eine abgeschnittene Kassette oder eine Protease, die weiterhin das Gegenselektionssubstrat spaltet (Q1), exprimiert nicht-funktionale Proteasevarianten (Q2) oder exprimiert Proteasevarianten, die nur das Selektionssubstrat erfolgreich spalten (Q3). Hefezellen, die nicht-funktionale Varianten exprimieren, traten als dominante Population entlang der Diagonale in PE- versus FITC-Diagrammen auf, was die Ko-Retention beider Signale widerspiegelt (Abbildung 6A, Q2). Im Gegensatz dazu bildeten funktionale Varianten, die das Selektionssubstrat spalteten und das native (Gegenselektions-)Substrat verschonten, eine eigenständige abseits diagonale Population, die durch hohe PE- und mittlere bis niedrige FITC-Signalintensität gekennzeichnet ist (Abbildung 6A, Q3). Die Anwendung einer strengen Gating-Strategie zur Isolierung dieser abseits diagonalen Population führte zu einer fortschreitenden Anreicherung funktionaler Varianten über aufeinanderfolgende Runden der^{Sortierung 10}. Diese Anreicherung wird visuell als ein zunehmend definierter Zellcluster beobachtet, der vom diagonalen Cluster getrennt ist (Abbildung 6B, von links nach rechts). Wenn keine abweichende abseits diagonale Population beobachtet wird, kann dies auf eine geringe Bibliotheksqualität, unzureichende Expression oder suboptimale Färbungsbedingungen hinweisen. Als Negativkontrolle zeigt Abbildung 6C,D elektroporierte, induzierte, ungefärbte Hefezellen sowie die entsprechenden FITC- und PE-Fluoreszenzhistogramme.

Innerhalb der angereicherten Off-Diagonal-Population können Subpopulationen basierend auf der FITC-Intensität weiter aufgelöst werden. Zellen, die ein mittleres FITC-Signal aufweisen, können separat von solchen mit niedrigem FITC-Signal sortiert werden. Die Sequenzierung dieser unterschiedlichen Populationen zeigte einzigartige Mutationsprofile (Tabelle 11), was darauf hinweist, dass unterschiedliche Spaltwirkungen mit unterschiedlichen Proteasevarianten verbunden sind.

Abbildung 1: Vektor- und Einsatzvorbereitung. (A) Erzeugung potoveraler Proteasebibliotheken durch standortsättigende Mutagenese. (B) Montage und Integration der Substratkassette in den Hefeanzeigevektor (pDD1523). (C) Linearisierung des Hefedisplayvektors (pDD1524) durch Restriktionsverdauung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Elektroporation der Substratkassette und der PCR-verstärkten mutierten Proteasebibliothek in kompetente EBY100-Zellen. (Gestrichelte Schachtel) In vivo Zirkularisierung des Plasmids, das sowohl Protease als auch Substratkassette enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Induktion, Färbung und durchflusszytometrische Sortierung von Hefezellen. (A) Induktion der Proteasebibliothek und Substratkassette. (B) Fluoreszierende Antikörperfärbung: Färbung mit Anti-HA-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Anti-FLAG-Phycoerythrin-(PE)-Antikörpern. (C) Gefärbte Zellen werden mittels Fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. (D) Bergung von FACS-sortierten Zellen in Selektionsmedien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Plasmidrückgewinnung und Sequenzierung sortierter Hefezellen. (A) Plattierung sortierter Hefezellen. (B) Plasmidextraktion aus einzelnen Hefekolonien. (C) E.-coli-Transformation extrahierter Plasmide. (D) Plasmidextraktion aus einzelnen E.-coli-Kolonien. (E) Nanoporensequenzierung extrahierter Plasmide. Flaschen- und Röhrensymbole, adaptiert von DBCLS bzw. Helicase 11, über Bioicons (https://bioicons.com) und unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC BY 4.0). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Hefewachstumskurveren in verschiedenen Wachstumsmedien und der Einfluss der anfänglichen optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) der Subkultur auf die Effizienz der Hefeelektroporation. (A) Wachstumskurven von Hefe in 1 × Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD), 2 × YPD, Synthetischer Dextrose-Casaminosäure-Agar ohne Antibiotika (SDCAA-) und Synthetischer Dextrose-Casaminosäure-Agar mit Antibiotika (SDCAA+). (B) Transformationseffizienz von Hefe, die mit einem 4-μg-Plasmidvektor bei verschiedenen Subkultur-initialen OD₆₀₀ elektroporiert wurde, sowie die Transformationseffizienz mit linearisiertem Vektor (4 μg) und Proteasebibliotheks-Insert (12 μg) bei denselben Anfangs-OD600-Werten. Daten in (A) werden als OD₆₀₀ ± SD aus zwei unabhängigen biologischen Experimenten präsentiert (n = 2). Daten in (B) werden als mittlere Anzahl der Transformanten pro Elektroporation auf einer logarithmischen y-Achse dargestellt, wobei einzelne biologische Replikate als Kreise (n = 2) dargestellt werden. Die statistische Signifik für die Plasmid- und Vektor-plus-Insert-Elektroporations-Optimierungsexperimente wurde mittels Einweg-ANOVA auf log10-transformierten Elektroporationseffizienzen bestimmt, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest mit OD₆₀₀ = 1,0 als Kontrolle. NS, nicht signifikant; p < 0,01 (**); p < 0,0001 (****). Die statistische Signifikanz der Differenz zwischen reiner Plasmid- und Vektor-plus-Einfüge-Transformationseffizienz wurde mittels zweiseitiger ANOVA auf log10-transformierten Transformationseffizienzen bestimmt. p < 0,0001 (****). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-basierte Anreicherung von Hefeklonen. (A) Schematische Darstellung der Gating-Strategie. Die Zellen wurden in drei Regionen unterteilt: Q1, Phycoerythrin-(PE)-niedrige Zellen; Q2, PE-hoch/Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-hohe Zellen; und Q3, PE-hohe Zellen mit niedriger bis intermediärer FITC-Fluoreszenz. Zellen in Q3 wurden zur Anreicherung gesammelt. (B) Repräsentative FACS-Diagramme einer unabhängigen evolutionären Kampagne zeigen aufeinanderfolgende Sortierrunden mit zunehmender FITC-Gart-Strenge. Zellen mit mittlerem und niedrigem FITC wurden separat zur Sequenzierung gesammelt. Prozentsätze geben den Anteil lebender, einzelner Hefezellen innerhalb der geschlossenen Population an. (C) Repräsentatives FACS-Diagramm, das elektroporierte, ungefärbte Hefezellen als Negativkontrolle zeigt. (D) Histogramme der FITC-A (links) und PE-A (rechts) Fluoreszenzintensitäten, die den in (C) gezeigten Daten entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Reaktionsmischung für die PCR-Amplifikation der Proteasebibliothek in der ersten Runde. Zusammensetzung der PCR-Reaktion, die für die Erstrundenamplifikation der Proteasebibliothek verwendet wird, einschließlich der Endkonzentrationen und Mengen jedes Reagenzens in einer 50-μL-Reaktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Zyklische Bedingungen für die PCR-Amplifikation der Proteasebibliothek in der ersten Runde. Das thermische Zyklusprogramm wurde für die PCR-Amplifikation der Proteasebibliothek in erster Runde verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Reaktionsmischung für die PCR-Amplifikation der Proteasebibliothek in der zweiten Runde. Zusammensetzung der PCR-Reaktion, die für die zweite Runde Amplifikation der Proteasebibliothek verwendet wird, einschließlich der Endkonzentrationen und Mengen jedes Reagens in einer 50-μL-Reaktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Zyklische Bedingungen für die PCR-Amplifikation der Proteasebibliothek in der zweiten Runde. Das thermische Zyklusprogramm wurde für die PCR-Verstärkung der Proteasebibliothek in der zweiten Runde verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Medien und Reagenzien für Hefeelektroporation und -wachstum. Tabuläre Beschreibung der Masse, die von jeder chemischen Komponente benötigt wird, um spezifische Mengen von 1 × und 2 × Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD), Elektroporationspuffer, Konditionierungspuffer, Auswuchsmedium, synthetische Dextrose-Casaminosäuren mit Antibiotika (SDCAA+), synthetische Galaktose-Casaminosäuren mit Antibiotika (SGCAA+), Lysogeny-Brühe-(LB)-Medien, LB-Chloramphenikol-Medien, Super Optimal Broth (SOB)-Medien und Super Optimal Broth mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) zu formulieren. Anleitungen zur Herstellung von Lagerlösungen, wie 2 M Sorbitol, 1 M Dithiothreitol (DTT) und 2 M Lithiumacetat (LiAc), sind enthalten. Zusätzliche Anweisungen zur Herstellung von SDCAA-, LB- und YPD-Agarplatten werden bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: Reaktionsmischung für das Annealing und die Phosphorylierung von Oligos. Zusammensetzung der Reaktionsmischung, die für das gleichzeitige Annealing und die Phosphorylierung von Oligonukleotiden für die Montage von Substratkassetten verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Zyklische Bedingungen für Glühen und Phosphorylierung von Oligos. Temperaturprogramm verwendet für Oligonukleotid-Annealing und Phosphorylierung für die Montage von Substratkassetten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 8: Reaktionsmischung für die Golden Gate-Montage von Substratkassette und Vektorplasmid. Zusammensetzung der Golden-Gate-Assemblierungsreaktion, die verwendet wird, um die Substratkassette in das Vektorplasmid zu ligieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 9: Zyklische Bedingungen für die Golden Gate-Assemblage von Substratkassette und Vektorplasmid. Thermisches Zyklusprogramm für die Golden Gate-Montage. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 10: Reaktionsmischung zur Linearisierung des Vektorplasmids. Zusammensetzung der Restriktionsverdauungsreaktion, die zur Linearisierung des Vektorplasmids vor der Bibliothekskonstruktion verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 11: Nanoporensequenzierungsergebnisse von TEVp-Varianten, die ENLYFES spalten. Plasmide wurden nach der vierten und letzten FACS-Sitzung aus Hefezellen extrahiert. Mutationen in jedem Klon werden relativ zur Wildtyp-Sequenz gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Beziehung zwischen der anfänglichen und endgültigen EBY100-Kulturdichte während der Subkultur. EBY100-Kulturen wurden mit unterschiedlichen anfänglichen_{OD-600-Werten} subkultiviert, und der endgültige OD₆₀₀ wurde nach der Inkubation unter identischen Wachstumsbedingungen (30 °C, 220 U/min) gemessen. Die Endkulturdichte stieg linear mit steigendem anfänglichen OD₆₀₀ an (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). Datenpunkte stellen Mittelwerte ± SD von (n = 2–4) unabhängigen biologischen Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Rationales Design der TEVp-Mutagenese-Bibliothek. Karikatur-Darstellung von TEVp (PDB-ID: 1LVB) mit den vier Residuen (Gold) <5 Å entfernt vom P1-Rest (lila), die für die Standortsättigungsmutagenese angestrebt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Gerichtete Evolution ist eine Hochdurchsatzmethode, die iterative Zyklen der Diversifizierung und Selektion nutzt, um Proteine mit verbesserter oder neuartiger biochemischer Funktion^{zu identifizieren 17}. In diesem Protokoll beschreiben wir einen optimierten Workflow zur Weiterentwicklung der Protease-Substrat-Erkennung mittels eines Zelloberflächen-Anzeigesystems in S. cerevisiae. Das Oberflächenanzeigesystem ordnet die Proteaseaktivität einem nachweisbaren fluoreszenzbasierten Phänotyp zu, was eine FACS-basierte Anreicherung der gewünschten Klone ermöglicht. Wir liefern detaillierte Schritte für die Montage von Proteasebibliotheken und Substratkassetten, hocheffiziente Elektroporation, FACS-Gating und Sortierung sowie die endgültige Sequenzierung der Proteasevarianten.

Einer der wichtigsten Schritte in der gerichteten Evolution ist die Sicherstellung ausreichender Bibliotheksvielfalt und der Abdeckung potenzieller Mutationen¹⁷. Unsere Experimente zur Elektroporationseffizienz zeigen, dass eine anfängliche Subkultur OD₆₀₀ von 3,0 die höchste Transformationseffizienz erzielt und damit^10,9 CFU übersteigt. Diese Größe, die durch optimierte Hefeelektroporation erreicht wird, übertrifft die herkömmlichen chemischen Transformationsmethoden deutlich und ermöglicht eine ausreichende Abdeckung großer kombinatorischer Bibliotheken ^8,9. Genaue FACS-Gating und Sortierung sind unerlässlich, um Zellen mit den gewünschten Spalteigenschaften von solchen mit unspezifischer Spaltung zu unterscheiden. Während mehrerer Runden FACS-basierter Auswahl wird die Gating-Strategie immer strenger, um gezielt für gewünschte Proteasevarianten zu bereichern. Wenn das Gating zu breit ist, können unerwünschte Zellen zusammen mit den gewünschten Varianten sortiert werden. Strenges Gating (z. B. immer niedrigere Schwellenwerte für das FITC-Signal über Runden hinweg) ermöglicht es der Zellpopulation, für Proteasevarianten mit höherer Spezifität und Aktivität in Richtung der neuen Zielsubstratsequenz¹⁰ angereichert zu werden. Im Einklang mit früheren Kampagnen ^7,18 führten wir eine NNS-Codon-Mutagenese von vier Resten in der Substratbindungstasche von TEVp durch, die mit dem Substrat-P1-Rest Q (T146, D148, H167, S170) interagieren (ergänzende Abbildung 2). Die in Abbildung 6B gezeigten FACS-Diagramme stellen ein einzelnes repräsentatives Sortierexperiment dar, das die Gating-Strategie und den Enrichment-Workflow darstellt. Interessanterweise ergaben unsere Kampagnenergebnisse TEVp-Varianten mit einem anderen Set von Aminosäuremutationen (Tabelle 11). Diese Ergebnisse unterstützen ein zentrales Merkmal der Protease-Evolution: Mehrere evolutionäre Wege können zum gleichen Ziel führen.

Anpassungen und Fehlersuchstrategien können bei der Durchführung der Experimente erforderlich sein. Beispielsweise sorgt das Arbeiten auf Eis, wenn es erforderlich ist, und das sorgfältige Wiederaufhängen der Zellpellets bei jedem Schritt, um sicherzustellen, dass die Zellen vor der Elektroporation lebendig und gesund sind. Hefezellen sind während der Elektroporationsschritte bis zum Auswachsen-Wiederherstellungsschritt empfindlich. Zusätzlich kann eine Modifikation der FACS-Scheidenflüssigkeit erforderlich sein, um eine Hefezellflockung zu verhindern. Scheidenflüssigkeit wird häufig in FACS-Maschinen verwendet und kann Konservierungsstoffe enthalten, die das Wachstum von Bakterien und Pilzen hemmen. Daher kann die Scheidenflüssigkeit durch reines PBS ersetzt werden, um Zelltod während der Sortierung zu verhindern.

Das Hefeoberflächenanzeigesystem erfordert korrekt gefaltete Proteine, um den sekretorischen Weg erfolgreich zu durchlaufen. Einige Proteasevarianten können durch Fehlfaltung an Aktivität verlieren, was bei der FACS-Selektion durch unspezifische Spaltung oder Hintergrundfluoreszenz zu falsch positiven Ergebnissen führt. Gut charakterisierte Quellen von Fehlalarmen sind für plasmidbasierte Kampagnen wie diese erwähnenswert. Da die Spaltung als Verlust des C-terminalen Epitop-Tags ausgelesen wird, ergibt jede Mutation, die dieses Tag stört, denselben niedrig-FITC-Phänotyp wie ein echtes Spaltungsereignis; solche Tag-Mutationen entstehen während der großflächigen homologen Rekombination und können sich über aufeinanderfolgende Sortierrunden hinweg bereichern. Die chromosomale Integration der konstanten Substratkassette hat kürzlich gezeigt, dass sie^{dieses Problem} mindert. Das Protokoll basiert auf der Verwendung einer Insert-Bibliothek, während der Vektor (der die Substratkassette enthält) konstant bleibt. Daher ist dieses Protokoll nicht geeignet für diejenigen, die sowohl Protease- als auch Substratbibliotheken weiterentwickeln möchten.

Die YESS-Plattform hat einen allgemeinen Weg zur Neuprogrammierung der Protease-Substrat-Spezifität¹⁸ eingeschlagen. Zu den jüngsten Verbesserungen gehören: die Einführung titrierbarer Enzym-/Substratkontrolle in YESS2.0⁷, die Kopplung an Next-Generation-Sequenzierung, die Ermöglichung hochauflösender Spezifitätsprofilierung²⁰ sowie die chromosomale Integration der Reporter zur Reduzierung von Expressionsrauschen und Fehlalarmen¹⁹. Andere orthogonale Strategien, wie phagenunterstützte kontinuierliche Evolution, wurden ebenfalls bei der Entwicklung der Proteasespesifität für therapeutische Ziele^{angewandt 21}. Diese Werkzeuge fanden Anwendungen über die TEV-Protease-Technik hinaus, etwa durch hochauflösende Profilierung der SARS-CoV-2-Hauptprotease zur Steuerung des Inhibitordesigns²². Ein entscheidender Faktor jeder solchen Kampagne ist die Erzeugung genügend Transformanten, um große kombinatorische Bibliotheken (>10⁹) abzudecken, die im EBY100 S. cerevisiae-Stamm nicht systematisch optimiert wurden. Durch die Definition der Wachstumsphasen- und Elektroporationsbedingungen, die die EBY100-Transformation über 10–⁹ CFU antreiben, beseitigt dieses Protokoll diesen Engpass und ermöglicht eine umfassende, FACS-basierte Screening von Millionen von Varianten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software