3D-gedruckte Plattform mit Opfertinte für die hochauflösende Bildgebung der Endothelzellfunktion in gewundenen Gefäßen und Aneurysmen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt, wie man Blutgefäße in vitro mit gewundenen oder aneurysmatischen Abschnitten unter Verwendung eines Extrusionsdruckers oder einer manuellen Applikation pasteurisierter opferbereiter Tinte entwirft und zusammenbaut, sowie wie man die hämodynamische Strömung und die Reaktionen der endothelialen Zellen untersucht.

Zusammenfassung

Gefäßverknotungen und Aneurysmen stellen erhebliche Gesundheitsrisiken in einer Vielzahl menschlicher Gewebe und Blutgefäßtypen dar. Diese Veränderungen der Gefäßform verursachen Anomalien in der Strömungsdynamik des Blutes, die die endotheliale Funktion erheblich beeinträchtigen. Tiermodelle dieser vaskulären Erkrankungszustände haben in einigen Fällen Aufschluss gegeben, sind jedoch sowohl kostspielig in der Einrichtung als auch auf die Physiologie der jeweiligen Tierart beschränkt. Als Reaktion darauf haben in vitro 3D Organ-auf-einem-Chip (OOC)-Modelle sich als leistungsfähiges Instrumentarium zur Beurteilung der vaskulären Funktion und endothelialen Reaktionen in menschlichen Zellen etabliert. Obwohl jedes dieser OOC-Modelle seine Stärken besitzt, wird ein zugängliches System benötigt zur Untersuchung der Gefäßpermeabilität, einem entscheidenden Indikator für die vaskuläre Funktion in gekrümmten Gefäßen und Aneurysmen unter physiologischen Scherraten und Druckverhältnissen. Die hier vorgestellte Methodik ermöglicht die Untersuchung der Reaktionen menschlicher endothelialer Zellen auf Strömungsanomalien in einem kostengünstigen Modellsystem mit gekrümmten Gefäßen, das einen einfachen Bioprinter verwendet und Gefäße erzeugt, die mit physiologischen Flüssigkeitsströmungsraten, Permeabilitätsstudien, hochauflösender Lichtmikroskopie sowie extrazellulärer Matrixunterstützung mit physiologischer Steifigkeit kompatibel sind.

Einleitung

Die Morphologie von Blutgefäßen ist ein wichtiger Indikator für die vaskuläre Funktion, da Gefäßtortuosität und Aneurysmen Schlüsselmerkmale verschiedener Erkrankungen und Gesundheitsrisiken darstellen. Vaskuläre Tortuosität kann angeboren sein, wie bei Syndromen wie Marfan¹, Turner² und Loeys-Dietz³, oder sich im Laufe des Lebens als Merkmal mehrerer Erkrankungen entwickeln, darunter Hypertonie, Diabetes, Krebs und möglicherweise Atherosklerose^4,5,6. Aneurysmen arterieller Gewebe, einschließlich der Arteria carotis⁷, Koronararterien⁸, Arteria femoralis⁹, Aorta¹⁰ und zerebralen Arterien¹¹, sind mit Morbidität und Gesundheitsrisiken aufgrund spontaner Dissektion oder Ruptur assoziiert. Neben der Verursachung von Strömungsstörungen und damit verbundener endothelialer Entzündung können vaskuläre Tortuosität und Aneurysmen auf zugrundeliegende Gewebestörungen und Entzündungen hinweisen. Beispielsweise ist das arterielle Tortuositätssyndrom bei Neugeborenen und Kindern klinisch vorhersagend für kindliche Schlaganfälle¹², persistierende pulmonale Hypertonie und Aortendissektion^4,13. Bei Erwachsenen manifestiert sich eine retinale Vaskulitis mit verschlungenen retinalen Gefäßen, die weniger ausgeprägt werden, wenn die zugrundeliegende Entzündung abklingt¹⁴. Wie Tortuosität erfasst wird und in abnorme Signale umgesetzt wird, die den Krankheitsverlauf vorantreiben, bleibt ein aktiver Forschungsbereich. Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, gelten als primäre Sensoren in diesem Prozess. Gestörte oder langsame Strömung, hervorgerufen durch vaskuläre Tortuosität oder Aneurysmen, verändert die Scherspannung und führt zu endothelialen Veränderungen in der entzündlichen Signalübertragung¹⁵ und der Barrierefunktion¹⁶. Endothelzellen sind hochgradig empfindlich gegenüber Flüssigkeitsströmung durch Mechanismen, die primäre Zilien¹⁷, mechanosensitive Adhäsionsproteine^18,19 und Ionenkanäle^20,21 beinhalten, welche Signalwege aktivieren, die Durchlässigkeit, Entzündung und endotheliale Umprogrammierung auslösen können^22,23,24. Methoden zur Untersuchung der endothelialen Reaktionen auf verschlungene vaskuläre Geometrie sind daher wichtig für die Entwicklung vaskulärer Therapien.

Endotheliale Funktionen bei vaskulären Erkrankungen wurden mithilfe von in-vivo-Tiermodellen, Organ-auf-einem-Chip-(OOC-)Systemen und Bioprinting-Ansätzen modelliert. Mausmodelle ermöglichen die Kontrolle der Expression bekannter Krankheitsgene und berücksichtigen die Komplexität der Gewebearchitektur und Physiologie, einschließlich der Beteiligung muraler und immunologischer Zellen. Mausmodelle der Atherosklerose²⁵, des Marfan-Syndroms²⁶ und verschiedener Aneurysmen^27,28,29 liefern Einblicke in Pathologien, die mit vaskulärer Dysfunktion assoziiert sind. Trotz dieser Vorteile sind die direkte Beobachtung, experimentelle Manipulation und Quantifizierung endothelialer Zellen schwer zu erreichen, abgesehen von Gesamtmethoden wie der RNA-Sequenzierung. Zudem ergeben sich bei Tierversuchen ethische und kostentechnische Aspekte und Einschränkungen aufgrund artenspezifischer Physiologie.

Zahlreiche in vitro-OOC-Ansätze wurden entwickelt, um menschliche endotheliale Reaktionen auf laminare und gestörte Strömung^30,31,32 sowohl in 2D^33,34 als auch in 3D^35,36,37-Systemen zu untersuchen. Die umfangreiche OOC-Literatur³⁸ wurde weitgehend von der biomedizinischen Technik vorangetrieben, wobei die Konstruktionsmerkmale spezifische biomedizinische Fragestellungen adressieren. Viele vaskuläre OOC-Modelle verwenden Träger aus Polydimethylsiloxan (PDMS), um die Gefäßarchitektur zu steuern³⁸. Diese Modelle ermöglichen eine hochauflösende Kontrolle komplexer Geometrien und erlauben die Modellierung von Organ-Gefäß-Interaktionen, einschließlich solcher, die Leber³⁹, Gehirn⁴⁰ und Lunge⁴¹ betreffen. Dennoch bestehen weiterhin Einschränkungen. Die geringe Permeabilität von PDMS und ähnlichen Polymeren gegenüber Makromolekülen kann Untersuchungen der vaskulären Barrierefunktion einschränken. Außerdem weist das meiste gehärtete PDMS eine Steifigkeit von etwa 0,8–10 MPa⁴² auf, obwohl alternative Formulierungen physiologischere Bereiche von 8–200 kPa erreichen können⁴³. Schätzungen der Steifigkeit der vaskulären Basalmembran reichen je nach Gefäßtyp und Messmethode von etwa 350 Pa⁴⁴ bis etwa 70 kPa⁴⁵, wobei die meisten gesunden vaskulären Basalmembranen im Bereich von 2–3 kPa liegen⁴⁶. Da vaskuläre Erkrankungen wie Atherosklerose und Hypertonie teilweise mit einer erhöhten Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) assoziiert sind^{47,48,49,50,51} und Endothelzellen auf die ECM-Steifigkeit reagieren, ist die Kontrolle der Steifigkeit innerhalb physiologischer Bereiche in in vitro-Modellen wichtig. Neuere OOC-Ansätze verwenden physiologische Substrate, die komplexe Geometrien ermöglichen^52,53, mehrere Zelltypen integrieren, um Organfunktionen nachzubilden^{39,54,55,56,57}, oder immun-vaskuläre Interaktionen modellieren⁵⁸, patientenspezifische vaskuläre Strukturen abbilden^59,60 und die präklinische Arzneimittelentwicklung unterstützen^61,62. In vielen mikrovaskulären Modellen, die Interaktionen mit anderen Zelltypen beinhalten, bilden Endothelzellen spontan Gefäße mit relativ unkontrollierten Geometrien⁶³. Umgekehrt erfordern OOC-Systeme, die definierte Gefäßgeometrien unter kontrollierter Strömung ermöglichen, oft einen erheblichen technischen Aufwand, spezielle Materialien und Expertise^53,64. Daher werden robuste, für Nicht-Experten zugängliche Methoden benötigt, um Untersuchungen des vaskulären Zellverhaltens unter physiologisch relevanten Bedingungen zu erleichtern.

Bioprinting-Plattformen, die mit physiologischen ECM-Hydrogelen kompatibel sind, bieten vielseitige Möglichkeiten in vitro Modelle zur Untersuchung der endothelialen Funktion über verschiedene vaskuläre Geometrien hinweg⁶⁵. Diese Ansätze verwenden entweder eine gezielte Ablagerung von endothelzellenhaltigen Gelelen in Form eines Blutgefäßes⁶⁶ oder opfertinten, um offene, röhrenförmige Lumina in der ECM zu erzeugen, die anschließend aufgelöst werden können, wodurch ein Lumen entsteht, das mit endothelialen Zellen besiedelt werden kann⁵⁴Biologisch verträgliche ECM-Substrate, einschließlich Gelatine, Kollagen und Fibrin, können so eingestellt werden, dass sie Steifigkeiten aufweisen, die denen der vaskulären Basalmembran (1–3 kPa) entsprechen.⁶⁷) und ermöglichen vaskuläre Permeabilitätsassays, die denen ähnlich sind, die verwendet werden in vivo. Obwohl diese Ansätze nicht die gleiche Form- und Größenauflösung wie die PDMS-Herstellung erreichen, können gekrümmte, verzweigte und stenotische Gefäße erzeugt werden^52,66,68Solche Plattformen eignen sich daher gut zur Modellierung vaskulärer Geometrien, einschließlich gekrümmter und aneurysmatischer Gefäße.

Die hier vorgestellte Methode nutzt einen 3D-Druckansatz, der auf pneumatischer Extrusion, dreidimensionaler mikronskaliger Positionierung, Temperaturkontrolle der Druckplattform und des druckkopfgebundenen Tintenbehälters sowie einer zuvor für Nieren-gefäßer Interaktionen auf einem Chip entwickelten opfern Tinte basiert^67,69. Die opfernde Tinte wird in der gewünschten vaskulären Geometrie gedruckt und sofort in die ECM eingebettet. Eine anschließende Temperaturänderung entfernt die Tinte und hinterlässt ein offenes ECM-Lumen, das mit humanen endothelialen Zellen besiedelt wird. Die Grund-ECM besteht aus Gelatine und Fibrin und ermöglicht eine schnelle Gelierung sowie thrombinvermittelte Fibrinpolymerisation, während sie eine mechanische Steifigkeit bietet, die für viele vaskuläre Basalmembranen geeignet ist. Zusätzliche ECM-Bestandteile wie Laminin oder Fibronectin können hinzugefügt werden, um die Zusammensetzung der vaskulären Basalmembran besser nachzuahmen^70,71,72 und die endotheliale Adhäsion zu fördern. Das System wird in wiederverwendbaren Rose-Kammern⁷³ montiert, die Metallträger, Dichtungen aus Silikonkautschuk und hochauflösende Mikroskopdeckgläser enthalten und eine Verbindung mit einer Fluidpumpe über Luer-Lock-Nadeln ermöglichen. Alternativ können die oberen und unteren Platten mittels 3D-Druck aus Polylactid oder kohlenstofffaserverstärktem Material hergestellt werden. Das montierte System hält den Drücken stand, die durch physiologische Strömungsgeschwindigkeiten erzeugt werden. Ein Pasteurisierungsverfahren verbessert zudem die Sterilität der opfernden Tinte, ohne deren physikalische Eigenschaften zu verändern. Außerdem erlaubt ein Nadelschablonen- und Bio-Tinten-Ansatz die Herstellung gerader Gefäße mit einem Aneurysma, ohne einen Bioprinter zu benötigen. Die resultierenden endothelialisierten, verzweigten oder aneurysmatischen Gefäße können unter physiologischer Strömung mithilfe der hochauflösenden Lichtmikroskopie etwa eine Woche lang untersucht werden, wodurch akute endotheliale Reaktionen auf veränderte vaskuläre Geometrie erforscht werden können.

Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems ist die Kompatibilität mit der Lichtmikroskopie. In vitro mit diesem Protokoll erzeugte Gefäße eignen sich für verschiedene bildgebende Verfahren und sind besonders gut für die Spinning-Disk- oder Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie mit Fluoreszenz geeignet. Bei der Auswahl der Bildgebungsbedingungen müssen räumliche und zeitliche Auflösung, Empfindlichkeit sowie die Arbeitsdistanz des Objektivs berücksichtigt werden. Für die meisten mit diesem System erzeugten Gefäße muss das Objektiv über eine ausreichende Arbeitsdistanz verfügen, um etwa 100–300 µm von der Deckglasoberfläche entfernt den mittleren Bereich des Gefäßes abbilden zu können. Objektive mit hoher numerischer Apertur werden für die hochauflösende Bildgebung endothelialer Strukturen, einschließlich Organellen und Zelladhäsionen, sowie für Live-Aufnahmen mit hoher zeitlicher Auflösung, beispielsweise das Verfolgen von Markierungspartikeln unter Flussbedingungen, benötigt. Einige Assays, bei denen eine weniger effiziente Lichtquantenaufnahme ausreicht, wie fluoreszenzbasierte Messungen der endothelialen Barrierefunktion, können mit Objektiven niedrigerer numerischer Apertur, beispielsweise 10–20× Luftobjektiven, durchgeführt werden.

Das Protokoll beschreibt die Erzeugung gewundener und aneurysmatischer Gefäße, die aus humanen endothelialen Zellen bestehen, in einem in vitro-System, das physiologischen Flüssigkeitsfluss und Mikroskopie mit hoher Auflösung ermöglicht. Der Arbeitsablauf umfasst die Gefäßkonstruktion, die Herstellung der Kammer, die Vorbereitung und den 3D-Druck der opfern Tinte, die Vorbereitung der ECM und das Entfernen der Tinte, die Besiedlung der endothelialen Zellen und deren Kultivierung unter Flussbedingungen, die Beurteilung von Gefäßleckagen, die Abbildung des Flusses sowie die immunfluoreszenzchemische Färbung (Abbildung 1).

Protokoll

1. Gestalten Sie das Gefäß

1. Wählen Sie ein Gefäßsegment aus, das in die mikroskopkompatible Kammer passt. Bei einer Rose-Kammer sollte der Abstand zwischen Einlass- und Auslassreservoir nicht mehr als 1,6 cm betragen.
2. Importieren Sie das kontrastverstärkte CT-Angiographiebild (Abbildung 2A), ein MRT-Angiographiebild oder ein fluoroskopisches Angiographiebild in ImageJ/FIJI oder ein anderes Bildanalyseprogramm.
3. Verwenden Sie das Punkt-Messwerkzeug, um die XY-Koordinaten entlang der axialen Mitte des Gefäßes festzulegen. Exportieren Sie die Koordinaten in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung 2B).
   HINWEIS: STL-Dateien, die aus CT-Angiographien abgeleitet wurden, können direkt in die meisten Druckersoftwareprogramme importiert werden; polygonbasiertes Drucken kann jedoch mehrere Durchläufe erfordern und zu geflochtenen Gefäßen führen (ergänzende Abbildung 1). Verwenden Sie für einen Einzeldurchlauf-Druck direkten G-Code. Aus diesem Grund wird die Koordinatenabbildung und -gestaltung im G-Code bevorzugt. Siehe Beispiel-G-Code in den ergänzenden Dateien.
4. Bearbeiten Sie die XY-Koordinaten in der Tabelle, um die Mitte des Gefäßes im grafischen Ursprung zu positionieren. Importieren Sie gegebenenfalls die Grenze der Kammer, um sicherzustellen, dass der endgültige Druck in die Kammer passt.
5. Verwenden Sie die XY-Koordinaten des Gefäßes, um das Gefäß in der ersten Druckschicht zu entwerfen (Abbildung 2C). Legen Sie die Höhe der ersten Schicht, einschließlich des Gefäßes und der angrenzenden Ein- und Auslassreservoirs, auf 200 µm fest.
6. Erstellen Sie Ein- und Auslassreservoirs, die ein bequemes Einführen von Nadeln ermöglichen. Verwenden Sie gegebenenfalls diamantförmige Reservoirs, um die Strömung effizient in Richtung Gefäßeinlass zu lenken und Turbulenzen am Einlass zu minimieren (Abbildung 2).
7. Fügen Sie die Reservoirs in die erste Druckschicht ein, damit sie mit dem Gefäß verbunden bleiben. Fügen Sie 5–9 Schichten über der Basisschicht hinzu, um ein ausreichendes Volumen für die Platzierung der Ein- und Auslassnadeln bereitzustellen. Bei der G-Code-Gestaltung sind folgende Details wichtig:
   1. Stellen Sie den Druckkopf und den Druckbett, falls eine Temperaturregelung verfügbar ist, mithilfe der Druckersoftware oder entsprechender G-Code-Befehle am Anfang der Druckdatei auf 37 °C ein.
   2. Geben Sie im G-Code den Druckkopf oder Extruder an, wenn mehrere Druckköpfe verfügbar sind. Konfigurieren Sie den G-Code für absolute Koordinaten und Extrusionswege.
   3. Passen Sie die Schichthöhe basierend auf Nadeldurchmesser und -form, Tintenflussdruck und Druckkopfgeschwindigkeit an. Verwenden Sie für die hier beschriebenen Beispiele eine Schichthöhe von 200 µm für jede Reservoirschicht oberhalb der ersten Schicht.
   4. Verwenden Sie für die Reservoirs einen Gegendruck von 14–17 psi und eine Druckkopfgeschwindigkeit von 6 mm/s (G-Code: F360). Erhöhen Sie die Druckkopfgeschwindigkeit für das Gefäß auf 15 mm/s (G-Code: F900).
8. Testen Sie jedes neue Gefäßdesign vor dem endgültigen Druck auf einem Objektträger ohne Kammer.

2. Bereiten Sie die opferbare Tinte vor

1. Geben Sie 2,1 g Polyethylenoxid (PEO) in 60 mL kaltes steriles Wasser, um eine 3,5 %ige (w/v) Lösung in einem sterilen, verschlossenen Behälter mit einem sterilen Rührstab herzustellen. Rühren Sie mindestens 48 Stunden bei 4 °C und überprüfen Sie regelmäßig, ob das gesamte Pulver gelöst ist.
   ANMERKUNG: Lagern Sie die PEO-Lösung bis zu einem Monat lang in einem luftdichten Behälter bei 4 °C.
2. Geben Sie 17,5 g Pluronic F-127 in 50 mL kaltes steriles Wasser, um eine 35 %ige Lösung in einem sterilen, verschlossenen Behälter mit einem sterilen Rührstab herzustellen. Rühren Sie mindestens 48 Stunden bei 4 °C und überprüfen Sie regelmäßig, ob das Pulver vollständig eingearbeitet ist.
3. Mischen Sie 11,4 mL kalte 3,5 %ige PEO-Lösung mit 28,6 mL kalter 35 %iger Pluronic F-127-Lösung in einem sterilen 50-mL-Konischkolben. Rühren Sie mindestens 24 Stunden bei 4 °C auf einem Rotationsmischer.
4. Stellen Sie den Kolben über Nacht bei 4 °C aufrecht, damit die Blasen aus der Lösung aufsteigen können.
5. Stellen Sie den Kolben mit der Tinte in ein Wasserbad und inkubieren Sie ihn 3 Stunden bei 63 °C. Lassen Sie den Verschluss während des Erhitzens leicht geöffnet, damit sich ausdehnende Luft entweichen kann.
6. Nehmen Sie den Kolben aus dem Wasserbad und lassen Sie ihn langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Verschließen Sie den Deckel, nachdem die Lösung abgekühlt ist.
7. Stellen Sie die pasteurisierte Tinte für 2 Stunden auf Eis und schütteln Sie sie gelegentlich vorsichtig, ohne Blasen einzuschließen.
8. Entfernen Sie den Spritzenkolben, verschließen Sie die Nadelöffnung und füllen Sie die Spritze zu 60–70 % ihrer Kapazität. Setzen Sie den Kolben ein, drehen Sie die Spritze um, entfernen Sie die Kappe der Nadelöffnung und drücken Sie die eingeschlossene Luft vollständig heraus.
   ANMERKUNG: Lagern Sie gefüllte Spritzen bis zu einem Monat bei Raumtemperatur.

3. Fertigen Sie die Rose-Kammer an und bereiten Sie die Rohrleitung vor

1. Stellen Sie die oberen und unteren Klemmplatten aus Aluminium her oder drucken Sie die Platten mittels der beigefügten CAD/STL-Dateien im 3D-Druckverfahren (Abbildung 2). Schließen Sie einen ausreichend großen abgeschrägten unteren Anschluss für den Zugang eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur ein sowie einen Stützrand für Schrauben, die die Deckgläser sicher gegen die Dichtung pressen.
   ANMERKUNG: Aluminium sorgt bei Mikroskopie mit beheiztem Objekttisch für eine bessere Wärmeübertragung. 3D-gedruckte Teile aus PLA oder kohlenstofffaserverstärktem Material eignen sich für Prototypen, können jedoch eine schlechtere Wärmeübertragung aufweisen und bei wiederholter Erhitzung verziehen.
2. Schneiden Sie das Silikonblatt passend zu den 38 mm × 51 mm großen Klemmplatten zu. Erstellen Sie das zentrale Beobachtungsfenster mithilfe eines 18-mm-Lochstanzers.
3. Bohren Sie Löcher, die zum gewählten Schraubendurchmesser passen. Spülen Sie die fertige Dichtung gründlich mit Wasser, um restliche Silikonpartikel zu entfernen.
4. Sterilisieren Sie die metallenen Klemmplatten, Schrauben, Muttern und Silikondichtungen in einer geschlossenen Aluminiumfolientasche mittels eines 20-minütigen Trockenzyklus im Autoklaven.
5. Tauchen Sie die 3D-gedruckten Platten 1 Minute lang in 70 %igen Ethanol ein. Trocknen Sie die Platten im sterilen Bereich.
6. Bereiten Sie 10–30 cm lange Schläuche mit Luer-Lock-Anschlüssen und integrierten Schlauchklemmen, geeigneten Schlauchmaterialien für eine peristaltische Pumpe, einen Dreiweghahn, einen Pulsdämpfer und ein Zweikammer-Medienreservoir vor (Abbildung 3).
7. Sterilisieren Sie hitzebeständige Schläuche und Reservoirteile durch Autoklavieren. Sterilisieren Sie Komponenten, die nicht autoklaviert werden können, durch Behandlung mit Ethanol.

4. Bereiten Sie die Reagenzien für die extrazelluläre Matrix vor

1. Geben Sie 12,5 mL warmes PBS bei 37 °C zu 1 g humanem Plasmafibrinogen, um eine Stammlösung mit 80 mg/mL herzustellen. Inkubieren Sie bei 37 °C und schwenken Sie gelegentlich vorsichtig, ohne zu wirbeln.
2. Lassen Sie das Fibrinogen 1–2 h lang auflösen, wodurch eine trübe Lösung entsteht. Portionieren Sie die Lösung in sterile Röhrchen und lagern Sie sie bis zu 3 Monate bei −20 °C.
3. Geben Sie 22,5 g Gelatine in 135 mL sterilem PBS in eine sterile Flasche mit einem magnetischen Rührstab. Rühren Sie 16 h bei 70 °C, und schütteln Sie die Flasche periodisch, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen.
4. Stellen Sie den pH-Wert der Gelatinelösung mit 1 M NaOH auf 7,5 ein. Filtrieren Sie die heiße Lösung unter Vakuum, portionieren Sie sie und lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei 4 °C.
   ANMERKUNG: Lassen Sie die Gelatine vor der Filtration mindestens 16 h lang quellen. Halten Sie die Lösung und die Filtrationsapparatur während der Vakuumfiltration bei 37 °C, um Verstopfungen des Filters zu minimieren.
5. Lösen Sie humanes Plasma-Thrombin in sterilem PBS auf eine Konzentration von 1.000 U/mL. Mischen Sie vorsichtig, portionieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bis zu 1 Jahr bei −20 °C.
6. Lösen Sie 300 mg Transglutaminase in 5 mL PBS auf und inkubieren Sie 1 h bei 37 °C mit gelegentlichem Mischen. Filtrieren Sie die Lösung steril in ein frisches Röhrchen und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur auf.
   ANMERKUNG: Bereiten Sie die Transglutaminaselösung täglich frisch zu. Lagern Sie das pulverförmige Transglutaminase trocken bei 4 °C.
7. Lösen Sie Calciumchlorid in Wasser, um eine 1 M Lösung herzustellen. Filtrieren Sie die Lösung steril und lagern Sie sie bis zu 1 Jahr bei Raumtemperatur.

5. Vorbereiten und Aktivieren der Deckgläser

1. Legen Sie saubere Deckgläser in Ethanol und führen Sie sie anschließend vorsichtig durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um den Ethanol zu verdampfen.
   ACHTUNG: Ethanol ist entzündlich. Halten Sie größere Mengen Ethanol von der offenen Flamme fern und führen Sie die Flammensterilisation unter Beachtung der geltenden laborüblichen Brandschutzmaßnahmen durch.
2. Stellen Sie die Deckgläser in einen Edelstahlhalter, ohne das Glas zu beschädigen oder zu verkratzen.
3. Legen Sie die Deckgläser für 30–60 min bei Raumtemperatur in eine 0,5%ige Lösung von (3-Aminopropyl)trimethoxysilan, die in Wasser verdünnt wurde. Führen Sie während der Inkubation eine sanfte Schüttelbewegung durch.
   ACHTUNG: Handhaben Sie (3-Aminopropyl)trimethoxysilan unter Verwendung geeigneter chemischer Schutzausrüstung und technischer Kontrollmaßnahmen.
4. Spülen Sie die Deckgläser sechsmal mit frischem Wasser bei sanfter Schüttelbewegung aus. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser beim Umsetzen des Halteres nicht verrutschen.
5. Nehmen Sie den Halter aus dem Wasser, tupfen Sie überschüssige Feuchtigkeit ab und trocknen Sie die Deckgläser 30 min bei 50 °C.
6. Lassen Sie die Deckgläser auf Raumtemperatur abkühlen, während Sie eine 0,5%ige Glutaraldehydlösung in PBS vorbereiten.
   ACHTUNG: Glutaraldehyd ist toxisch und reizend. Bereiten Sie die Lösung in einem geeigneten Abzug unter Tragen der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung vor und handhaben Sie sie entsprechend vorsichtig.
7. Inkubieren Sie die Deckgläser 60 min in 0,5%igem Glutaraldehyd unter sanfter Schüttelbewegung, um die Bildung von Blasen zu minimieren und eine gleichmäßige Aktivierung zu gewährleisten.
8. Spülen Sie die Deckgläser dreimal mit steriler Wasserlösung aus und lassen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
   HINWEIS: Aktivierte Deckgläser können bis zu 2 Monate unter Vakuum in einem Trockenschrank gelagert werden.

6. Beschichten Sie die Deckgläser mit der Basisschicht der extrazellulären Matrix

1. Erwärmen Sie 1× PBS, die Gelatine-Stammlösung und die Fibrinogen-Stammlösung 30–60 min auf 37 °C.
2. Auskleiden Sie eine sterile 15-cm-Petri-Schale mit sauberer Parafilm-Folie, besprühen Sie die Oberfläche mit 70 %igem Ethanol, lassen Sie das Überschuss ablaufen und trocknen Sie die Oberfläche luftdurchlässig im Biosicherheitswerkbank.
3. Geben Sie nacheinander 1,68 mL warmes PBS, 2,5 mL Gelatine-Stammlösung, 12,5 µL 1 M CaCl₂, 625 µL Fibrinogen-Stammlösung und 167 µL Transglutaminase-Lösung in ein kegelförmiges 15-mL-Röhrchen.
4. Stellen Sie das ECM-Gemisch 30 min in ein Wasserbad bei 37 °C.
5. Bereiten Sie pro Deckglas ein 1,7-mL-Röhrchen mit jeweils 5 µL Thrombin-Stammlösung vor.
6. Geben Sie 400 µL der ECM-Zubereitung in das Thrombin-Röhrchen und mischen Sie durch einmaliges Pipettieren, wobei die Bildung von Blasen minimiert werden sollte.
7. Geben Sie unmittelbar 200 µL der Mischung auf die sterile Parafilm-Oberfläche und platzieren Sie mit einer Pinzette ein aktiviertes Deckglas auf den Tropfen. Drücken Sie vorsichtig, um eine vollständige Bedeckung zu erzielen.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt innerhalb von etwa 20 s nach dem Mischen des ECM-Gemischs mit Thrombin durch.
8. Bedecken Sie die Petri-Schale und inkubieren Sie die beschichteten Deckgläser 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 2 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator.
9. Lösen Sie jedes Deckglas vorsichtig von der Parafilm-Folie, indem Sie die Folie vom Deckglas weg biegen.
10. Platzieren Sie die frisch beschichteten Deckgläser mit der Gel-Seite nach oben in eine saubere Petri-Schale im befeuchteten Inkubator und verwenden Sie sie innerhalb eines Tages.
11. Alternativ inkubieren Sie die beschichteten Deckgläser über Nacht in einem nicht befeuchteten Inkubator und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Tagen.

7. Bioprinten Sie die opferbare Tinte und kapseln Sie sie in die ECM ein

1. Führen Sie Testdrucke durch, bevor Sie das Gefäß drucken, um sicherzustellen, dass die Tinte und Druckparameter die gewünschten Gefäßabmessungen erzeugen. Laden Sie die Druckdatei in die Druckersoftware.
   ANMERKUNG: Eine konische Dosierdüse mit 32 G und die Tinte aus 25 % Pluronic F127/1 % PEO erzeugt unter den hier beschriebenen Bedingungen zuverlässig Gefäßdurchmesser von etwa 150 µm. Optimieren Sie die Druckkopfgeschwindigkeit und den Gegendruck mithilfe einfacher Liniendrucke auf Glas.
2. Bauen Sie die untere Klemmplatte, die mit ECM beschichtete untere Deckglas, die Silikondichtung, die obere Klemmplatte ohne oberes Deckglas und die beiden Schrauben zusammen. Stellen Sie die Montage in einer abgedeckten 100-mm-Petri-Schale und lagern Sie sie bis zur Verwendung am selben Tag bei 37 °C.
3. Befestigen Sie die Drucknadel am Tintenspritzen und installieren Sie den Spritzen in den pneumatischen Extrusionsdrucker. Heizen Sie die Druckplattform, den Druckkopf und eine benachbarte Heizplatte auf 37 °C vor.
4. Bereiten Sie die ECM-Matrix wie in Abschnitt 6 beschrieben vor und halten Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad. Bereiten Sie 1,5 mL Matrix pro Rose-Kammer in Chargen von 5 mL vor.
5. Geben Sie je Kammer 5 µL Thrombin-Standardlösung in ein steriles 1,7- oder 2-mL-Röhrchen. Halten Sie zusätzliche aktivierte, unbeschichtete Deckgläser im Sicherheitswerkbank bereit.
6. Platzieren Sie die Kammer mit dem ECM-beschichteten Deckglas auf der Druckplattform und zentrieren Sie sie am XY-Nullpunkt. Senken Sie die Nadel ab, bis sie im Zentrum des Kammernfensters die ECM- oder Glasoberfläche berührt, und definieren Sie diese Position als XYZ-Nullpunkt.
7. Heben Sie die Nadel an und geben Sie maximalen Druck, um sie vollständig mit Tinte zu füllen und sichtbare Blasen vollständig zu entfernen. Wischen Sie die Nadelspitze mit einem sterilen Laborpapier ab.
8. Drucken Sie die Geometrie des Gefäßes und des Reservoirs mithilfe der hochgeladenen G-Code-Datei. Heben Sie die Nadel unmittelbar nach dem Druckvorgang an und entfernen Sie die Kammer.
9. Überprüfen Sie das gedruckte Gefäß auf Blasen und Unterbrechungen. Verwerfen und erneut drucken Sie jede Struktur, die einen dieser Fehler aufweist.
10. Stellen Sie die Kammer auf die 37 °C warme Heizplatte, entfernen Sie die Schrauben und die obere Klemmplatte und mischen Sie 1 mL der vorbereiteten ECM-Matrix mit dem Thrombin-Aliquot durch einmaliges Pipettieren.
11. Überführen Sie die aktivierte ECM-Mischung blasenfrei in die Gefäßkammer und platzieren Sie unmittelbar danach ein aktivierte Deckglas mit der beschichteten Seite nach unten auf die ECM. Setzen Sie die obere Klemmplatte wieder ein und ziehen Sie die Schrauben fest, bis sie sitzen, ohne sie überzudrehen.
12. Stellen Sie die fertiggestellte Kammer in eine abgedeckte 100-mm-Petri-Schale und inkubieren Sie sie 2 h bei 37 °C.

8. Erzeugen Sie ein Aneurysma mithilfe einer Drahtschablone

1. Führen Sie 21-Gauge-Nadeln durch die gegenüberliegenden Seiten der Silikondichtung ein und richten Sie sie aus.
2. Sonifizieren Sie einen 0,0190 Zoll durchmessenden medizinischen Draht aus rostfreiem Stahl (Typ 304) in PBS mit 1 % BSA in einem 15-mL-Konizfläschchen. Entfernen Sie den Draht und lassen Sie ihn in einer sterilen Petrischale innerhalb eines Sicherheitswerks trocken werden.
3. Führen Sie den mit BSA beschichteten Draht durch beide Nadeln in der Dichtung (Abbildung 2). Biegen Sie ein herausstehendes Ende leicht an, um die spätere Drehung zu erleichtern.
4. Autoklavieren Sie die Dichtung, Nadel, Draht und die Klemmplattenanordnung gemeinsam in einer Aluminiumfolienhülle.
5. Platzieren Sie die Nadel-/Dichtungsanordnung über eine aktivierte, ECM-beschichtete Deckglasabdeckung.
6. Befestigen Sie eine 21-G-Nadel an einer Spritze, die pasteurisierte Pluronic/PEO-Tinte enthält.
7. Geben Sie einen kleinen Tropfen opfernder Tinte auf die Seite des Drahtes in der Mitte der Kammer. Tragen Sie jeweils einen kleinen Tropfen Tinte an jeder Nadel-Draht-Verbindung auf, um eine Abdichtung zu erzeugen.
8. Bereiten Sie die ECM-Mischung vor und bauen Sie die Kammer wie in den Abschnitten 7.10–7.12 beschrieben zusammen.
9. Nachdem die ECM verfestigt ist, drehen Sie vorsichtig das gebogene Ende des Drahtes, um ihn von der ECM und der opfernden Tinte zu lösen. Ziehen Sie den Draht langsam aus dem Gerät heraus.
10. Füllen Sie die Einlassnadel mit PBS unter Verwendung einer 200-µL-Pipette und lassen Sie das PBS durch das Lumen ablaufen. Wiederholen Sie den Vorgang einmal und fahren Sie mit Abschnitt 9 fort.

9. Spülen Sie die Opfer-Tinte aus der Gefäßkammer

1. Schließen Sie Schläuche an ein Reservoir mit kaltem (4 °C) PBS, das mit Antibiotika ergänzt ist, an, integrieren Sie ein Dreifach-Hahnventil und schließen Sie den Schlauch mit einem männlichen Luer-Lock-Anschluss und einer sterilen 23-G-Nadel ab.
2. Füllen Sie den Zufuhrschlauch mithilfe der Hahn-Spritze mit kaltem PBS, bis PBS aus der Nadelspitze austritt. Klemmen Sie den Schlauch ab.
3. Füllen Sie eine zweite Schlauchlänge mit PBS und schließen Sie sie mit einer 23-G-Nadel ab. Klemmen Sie den Schlauch ab und entfernen Sie die Füllspritze.
4. Führen Sie die Zufuhrnadel durch die Dichtung in das Einlassreservoir und die Abflussnadel in das Auslassreservoir ein. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung mithilfe eines invertierten Mikroskops oder eines Stereomikroskops.
5. Bringen Sie die Vorrichtung bei 4 °C an und positionieren Sie das Zufuhrreservoir 30 cm über dem Einlass. Positionieren Sie den Auslass 5–10 cm unterhalb der Gefäßauslassnadel über einem Abfallbehälter.
6. Lösen Sie die Klemmen und spülen Sie mindestens 250 mL kaltes PBS durch die Kammer. Prüfen Sie das System während des Spülens auf Lecks und Blasen.

10. Beschichten und Vorbehandeln des Gefäßlumens mit zusätzlichen ECM-Komponenten

1. Verdünnen Sie Fibronectin auf 20 µg/mL, Laminin auf 10 µg/mL oder die Basalmembranmatrix auf eine 1:30-Verdünnung in 3 mL PBS.
2. Geben Sie frisch hergestellte Transglutaminase zu dem verdünnten ECM-Reagenz hinzu.
3. Lassen Sie den Schlauchabschnitt direkt proximal zum Gefäß mit Einlass und Auslass verbunden.
4. Injizieren Sie langsam die ECM/Transglutaminase-Lösung mithilfe einer 1-mL-Spritze durch das Gefäß. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamten 3 mL das Gefäß durchlaufen haben.
5. Verschließen Sie die Anschlüsse mit Klemmen, verschließen Sie Einlass und Auslass mit sterilen Luer-Kappen und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde bis über Nacht.
6. Spülen Sie das Gefäß mit 100 mL vollständigem endothelialem Medium, das Penicillin/Streptomycin enthält. Verschließen Sie die Schlauchanschlüsse mit Klemmen und verschließen Sie die Auslässe mit Kappen.
   HINWEIS: Lagern Sie das mit Medium gefüllte Gefäß bis zu 1 Woche bei 4 °C. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Lumen verbleiben.

11. Zellularisieren Sie das Gefäß

1. Inkubieren Sie die Kammer mit der ECM-Gefäßvorlage bei 37 °C für 2 h. Erwärmen Sie das vollständige endotheliale Medium, das Penicillin/Streptomycin enthält, auf 37 °C.
2. Vernaschen Sie endotheliale Zellen aus einer 10-cm-Kulturschale oder einem T75-Fläschchen und neutralisieren Sie das Trypsin mit vollständigem Medium. Überführen Sie die Suspension in ein kegelförmiges 15-mL-Röhrchen und entnehmen Sie eine Probe zur Zellzählung.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 × g für 5 min. Resuspendieren Sie das Pellet, um 150 µL Zellsuspension mit einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/mL herzustellen.
4. Verbinden Sie die Auslassleitung mit einem sterilen Abfallbehälter und halten Sie die Schlauchklemme geschlossen.
5. Trennen Sie die Zuleitung und entfernen Sie restliches Medium aus der Zulaufnadel. Halten Sie das Gefäß vertikal und pipettieren Sie die Zellsuspension in die Nadelhülse.
6. Öffnen Sie die Auslassklemme, damit die Zellsuspension in das Gefäß eindringen kann. Schließen Sie die Klemme erneut, sobald die gesamte Suspension in das Lumen eingetreten ist.
7. Geben Sie warmes, vollständiges Medium in die Zulaufnadelhülse und verschließen Sie sie mit einer sterilen Luerkappe. Trennen und verschließen Sie den Auslass.
8. Inkubieren Sie die Kammer in aufrechter Position bei 37 °C für 3 h.
9. Wiederholen Sie die Abschnitte 11.5–11.8 und inkubieren Sie die Kammer bei 37 °C für 3 h in umgekehrter Position.
10. Spülen Sie das Gefäß vorsichtig mit 1 mL vollständigem Medium aus und inkubieren Sie es bei 37 °C für 3 h.
11. Überprüfen Sie die endotheliale Anheftung mittels Mikroskopie, spülen Sie vorsichtig verbliebene nicht angeheftete Zellen mit frischem Medium ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 12–24 h.

12. Kultivieren Sie das Gefäß unter Flussbedingungen

1. Erwärmen Sie 200 mL komplettes Medium 1 Stunde lang und entgasen Sie es unter Vakuum mithilfe einer sterilen Filtereinheit. Erwärmen Sie das Medium erneut in einem befeuchteten CO₂-Inkubator.
2. Verbinden Sie im sterilen Biosicherheitswerkbank den Auslass des Medienreservoirs und den Dreiweghahn, die Pumpenschläuche, den Pulsdämpfer, den optionalen Blasenfänger, die Zulaufschläuche, die Gefäßkammer, die Ablaufschläuche und die Rückführungsschläuche nacheinander mit dem Medienreservoir (Abbildung 3).
3. Befüllen Sie den gesamten Fließkreislauf mit Medium und vergewissern Sie sich, dass keine Blasen oder Luftblasen zurückbleiben.
   HINWEIS: Füllen Sie die Verbinder und Nadelstutzen vor der erneuten Verbindung mit Flüssigkeit. Luftblasen, die in ein zellbesiedeltes Gefäß eindringen, können einen Verlust endothelialer Zellen verursachen, da plötzliche Scherkräfte auftreten.
4. Stellen Sie die Baugruppe in einen 37 °C warmen Inkubator und initiieren Sie eine Strömungsgeschwindigkeit von 1 dyn/cm² im Gefäß. Halten Sie diese Strömung 12 Stunden lang aufrecht.
5. Erhöhen Sie die Strömung, um 12–16 dyn/cm² zu erzeugen, und halten Sie diese 18–24 Stunden lang aufrecht, bevor Sie nachgeschaltete Assays durchführen. Um die für Ihr Gefäß erforderliche Strömungsgeschwindigkeit zu berechnen, ermitteln Sie die gedruckte Gefäßlänge und den mittleren Durchmesser. Verwenden Sie bei einem Online-Rechner die ermittelten Parameter und geben Sie einen kreisförmigen Querschnitt, Medium mit 10 % Serum und vernachlässigbaren Schlauchwiderstand ein (der Schlauchdurchmesser ist viel größer als der des gedruckten Gefäßes).
   HINWEIS: Verwenden Sie das Gefäß so bald wie möglich nach der Strömungsanpassung. Eine Kultivierung über 1 Woche hinaus kann zu Lücken zwischen endothelialen Zellen führen, möglicherweise verbunden mit Zellverlust oder ECM-Modifikation durch endotheliale Proteasen.

13. Durchführung des vaskulären Leck-Assays

1. Fügen Sie Alexa-647-markiertes BSA oder 10 kDa Alexa-647-Dextran zu 35 mL komplettem Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 mg/mL zu erreichen. Erwärmen Sie die Lösung auf 37 °C.
2. Präinkubieren Sie das Gefäß mit dem Teststoff, beispielsweise 250 ng/mL TNFα, für 1–2 h und fügen Sie denselben Wirkstoff auch in das Assay-Medium ein.
3. Richten Sie ein 37 °C warmes Wasserbad ein und platzieren Sie die Pumpe in der Nähe des Mikroskops. Schalten Sie das Mikroskop, die Aufnahmesoftware und das Objektträger-Heizsystem ein und lassen Sie den Objektträger 30 min lang auf 37 °C temperieren, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen.
4. Stoppen Sie den Fluss im Inkubator, trennen Sie das Kulturmedium-Reservoir ab und bringen Sie die Kammer sowie die zugehörigen Schläuche auf den vorgewärmten Mikroskop-Objektträger.
5. Verbinden Sie die Pumpe mit etwa 20 cm Schlauch, der mit einer Glas-Mikropipette, die mit nicht markiertem Medium gefüllt ist, ausgestattet ist. Führen Sie den Schlauch der Mikropipette in das fluoreszierende Reportermedium ein und platzieren Sie das Auslassrohr in einem Sammelgefäß.
6. Stellen Sie die Pumpe so ein, dass sie eine Flussrate von 0,2 mL/min liefert, und starten Sie den Fluss erst, wenn die Bildaufnahme bereit ist.
7. Fokussieren Sie mithilfe der Phasenkontrast-Aufnahme auf die Gefäßmittellinie und wechseln Sie dann zum 647-Fluoreszenzkanal. Starten Sie den Fluss mit der in Abschnitt 13.6 festgelegten Rate und nehmen Sie alle 1–5 min Bilder auf, abhängig von der erwarteten Reaktionszeit.
8. Erstellen Sie Kymographen aus den aufgenommenen Bildern und passen Sie eine lineare Steigung an die schwellenwertbasierten Intensitätswerte an. Geben Sie die Leckage als die Distanz in µm an, die der Reporter pro Minute von der äußeren Gefäßoberfläche aus zurücklegt.

14. Strömung von Flüssigkeiten kartieren

1. Vortexen Sie die 10 µm fluoreszierenden Kügelchen 1 Minute lang und behandeln Sie sie anschließend 1 Minute im Ultraschallbad. Verdünnen Sie die Kügelchen auf 1,8 × 10⁵ Kügelchen/mL in 10 mL komplettem Medium.
2. Richten Sie das Durchflusssystem auf dem Mikroskopobjektträger wie in Abschnitt 13 für den Gefäßleck-Assay beschrieben ein. Schließen Sie ein Ablaufbehältnis an und stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 mL/min ein.
3. Fokussieren Sie die zentrale Ebene des Gefäßes mit einem Objektiv mit geeignetem Arbeitsabstand. Nehmen Sie Bilder mit der maximal praktikablen Frequenz auf, die durch Belichtungszeit, Detektor-Empfindlichkeit, Exzitationsintensität und Lichtausbeute begrenzt ist.
4. Analysieren Sie die zeitaufgelöste Bildsequenz mithilfe einer Particle-Image-Velocimetry-Software.

15. Fixieren und immunfärben Sie das endothelialisierte Gefäß

1. Stellen Sie 40 mL einer 4 %igen Paraformaldehydlösung in PBS her, die 10 mM CaCl₂ und 10 mM MgCl₂ enthält.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist toxisch. Bereiten Sie Lösungen, die Paraformaldehyd enthalten, in einem geeigneten Abzug unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung zu.
2. Stoppen Sie den Durchfluss, klemmen Sie das Einlassrohr ab, trennen Sie es von der Pumpe und verbinden Sie es mit dem Abnahmerohr, das für den vaskulären Leck-Assay verwendet wird. Führen Sie das Abnahmerohr in das Fixansmittel ein und lassen Sie 35 mL durch das Gefäß per Schwerkraft fließen.
3. Klemmen Sie das Rohr ab und inkubieren Sie das Gefäß 30 Minuten bei Raumtemperatur im Fixansmittel.
4. Spülen Sie das Gefäß per Schwerkraft mit 25 mL Permeabilisierungspuffer, der 0,4 % Triton, 20 mM PIPES (pH 6,1), 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA und 5,5 mM Glukose enthält. Klemmen Sie das Rohr ab und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Spülen Sie das Gefäß mit Blockierpuffer, der 1 % BSA, 0,05 % Tween 20, 20 mM Tris (pH 7,4), 140 mM NaCl und 5 mM KCl enthält. Inkubieren Sie 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
6. Verdünnen Sie den ausgewählten primären Antikörper im Verhältnis 1:50–1:500 in 100–500 µL Blockierpuffer. Entfernen Sie das Einlassrohr und geben Sie die Antikörperlösung mithilfe des in Abschnitt 11 beschriebenen Verfahrens zur Zellseeding ein.
7. Inkubieren Sie das Gefäß über Nacht bei 4 °C.
8. Verbinden Sie das Einlassrohr erneut und spülen Sie das Gefäß mit 20 mL PBS durch.
9. Verdünnen Sie die geeigneten sekundären Antikörper im Verhältnis 1:200–1:1.000 im Blockierpuffer und geben Sie bei Bedarf fluoreszierendes Phalloidin im Verhältnis 1:250 hinzu. Führen Sie die Lösung gemäß dem in Abschnitt 15.6 beschriebenen Verfahren ein und inkubieren Sie 2 Stunden bei Raumtemperatur.
10. Spülen Sie das Gefäß mit 40 mL PBS durch, schließen Sie die Schlauchklemmen und verschließen Sie die Schläuche.
    HINWEIS: Lagern Sie das gefärbte Gefäß bei 4 °C und führen Sie die Bildaufnahme innerhalb von 2 Wochen durch.
11. Färben Sie F-Aktin mit fluoreszierendem Phalloidin, das Golgi-Apparat mit Anti-GM130 und die Kerne mit DAPI.
12. Analysieren Sie die Phalloidin-Bilder mithilfe von FibrilTool⁷⁴, um die durchschnittliche Ausrichtung der F-Aktin-Stressfasern zu bestimmen.
13. Bestimmen Sie die Achse zwischen den Schwerpunkten jedes Kerns und des Golgi-Apparats. Analysieren und plotten Sie die resultierenden Orientierungen in einer numerischen Software wie zuvor beschrieben⁷⁵.

Ergebnisse

Die Verwendung von opfernacher Tinte zum Drucken verschiedener röhrenförmiger Gewebe ist bereits von mehreren Arbeitsgruppen gut etabliert worden, insbesondere durch das Lewis-Labor, das Nierentubuli zusammen mit Blutgefäßen hergestellt hat^67,76. Ähnliche Ansätze wurden zum Drucken alveolärer Strukturen⁷⁷ und vaskularisierter Tumore⁷⁸ verwendet. Hier wurden diese Ansätze angepasst, um vaskuläre Geometrien zur Untersuchung endothelialer Reaktionen unter physiologischem Flüssigkeitsfluss zu erzeugen (Abbildung 2). Die Gefäßgeometrien wurden aus einem vaskulären Bild in eine Koordinatenkarte und anschließend in G-Code zur Definition der Druckbahn umgewandelt (Abbildung 2A–C). Der resultierende Ansatz ermöglichte die Herstellung von Gefäßvorlagen zur Untersuchung, wie endotheliale Funktion und zytoskelettale Organisation durch gewundene Gefäße und Aneurysmen verändert werden (Abbildung 2D–G). Ein 3D-druckbares Rose-Kammer-Design wurde ebenfalls integriert, um den Zugang zu mechanischen Werkstätten überflüssig zu machen (Abbildung 2H). Eine Beispiel-G-Code-Datei für den Gefäßdruck ist in Zusatzdatei 1 enthalten, und die entsprechenden CAD-Dateien für die Rose-Kammer und die Probenträgerbefestigung sind in Zusatzdatei 2 bzw. Zusatzdatei 3 enthalten. Beim auf STL-Daten basierenden Druck können mehrere Druckkopfdurchläufe erforderlich sein, was zu geflochtenen Gefäßgeometrien mit getrennten Lumina führt (Zusatzabbildung 1). Die resultierende Plattform wurde so konzipiert, dass sie für vaskuläre Zellbiologen mit minimalen Kenntnissen in Bioengineering zugänglich ist, gleichzeitig physiologische Druck- und Durchflussraten unterstützt und Zugang zu Mikroskopie mit hoher Auflösung bietet (Abbildung 2I).

Nach der Gefäßherstellung und Zellbesiedlung wurde das Gefäßgerät in ein geschlossenes Perfusionsystem integriert, um eine kontrollierte Mediumzirkulation zu ermöglichen (Abbildung 3). Das System bestand aus einer peristaltischen Pumpe, einem Dreiweghahn, der mit einer Spülsspritze verbunden war, einer Blasenfalle, einem Pulsdämpfer, dem Gefäßgerät und einem Mediumsreservoir, die nacheinander im Durchflusskreislauf angeordnet waren (Abbildung 3A). Diese Konfiguration ermöglichte eine kontinuierliche Zirkulation des Mediums durch das konstruierte Gefäß und enthielt gleichzeitig Komponenten zur Systemspülung, Entfernung von Blasen und Dämpfung der von der peristaltischen Pumpe erzeugten Pulsationen. Das aufgebaute System konnte betrieben werden, während das Gefäßgerät in der experimentellen Anordnung positioniert war, wie in Abbildung 3B dargestellt, und bot so eine praktische Konfiguration für die anschließende Perfusionsbehandlung zellbesiedelter Gefäße unter kontrollierten Strömungsbedingungen.

Eine Modifikation der zuvor beschriebenen Ansätze mit opfernacher Tinte war die Pasteurisierung der Tinte vor dem Druck. Diese Modifikation war notwendig, da die Anwendung veröffentlichter Protokolle zur Tintenherstellung zu schimmelpilzkontaminierten Kulturen führte. Wie bei anderen Pluronic-basierten Tinten, die für diese Anwendung verwendet werden, bleibt die Tinte aus 25 % Pluronic F127 und 1 % PEO bei niedrigen Temperaturen flüssig und geht beim Anstieg der Temperatur in ein gepacktes mikellares Gel über. Diese Formulierung weist eine Übergangstemperatur von 15 °C auf, was sich als günstig für die Strukturierung bei Inkubatortemperaturen und das Entfernen der Tinte bei 4 °C erweist. Ähnlich wie reines Pluronic zeigt dieses Material ebenfalls eine deutliche Scherverdünnung bei der Drucktemperatur (Abbildung 4A). Allerdings ist die Tinte selbst bei niedrigen Temperaturen zu viskos, um sie mittels Standard-Gewebekulturfiltern und Vakuum zu filtrieren und zu sterilisieren. Obwohl die Tinte durch Pasteurisierung bei 70 °C oder höher für 20 s sterilisiert werden kann, verändern diese Temperaturen die Tinte irreversibel und verringern ihre Viskosität bei der Drucktemperatur (Daten nicht gezeigt). Eine Pasteurisierung bei niedrigerer Temperatur über längere Dauer bei 63 °C für >1 h vermindert die Kontamination durch Pilze und andere Mikroorganismen, ohne die komplexe Viskosität der Tinte bei für den Druck geeigneten Temperaturen zu beeinträchtigen. Rheologische Charakterisierung mittels eines Rheometers mit 25-mm-Kegel-Platte-Geometrie zeigte, dass rohe und pasteurisierte Tinte über einen Bereich von Deformationsgeschwindigkeiten hinweg bei Drucktemperaturen ähnliche Viskositäten aufweisen (Abbildung 4B), was belegt, dass die Pasteurisierung die Druckfähigkeit nicht beeinträchtigt. Die pasteurisierte Tinte ermöglicht außerdem eine langfristigere Kultivierung von Gefäßen, ohne dass antimykotische Wirkstoffe erforderlich sind, die die endotheliale Funktion verändern können.

Sobald das Gefäß zellulär besiedelt ist, sollten konfluente Endothelzellen das gesamte Gefäß bedecken, wie in Abbildung 5 dargestellt, wobei die Projektion mit maximaler Intensität in Abbildung 5A und der Querschnitt in Abbildung 5B gezeigt ist. Der Medienfluss kann dann auf physiologische Scherraten erhöht werden, die für annähernd kreisförmige Gefäße mithilfe der Hagen-Poiseuille-Gleichung⁷⁹ abgeschätzt werden können. In der Praxis lässt sich die für eine gewünschte Scherspannung erforderliche Flussrate durch Berücksichtigung der Viskosität des Mediums und des mikrofluidischen Widerstands abschätzen. In einem typischen zweidimensionalen in-vitro-Kultursystem induziert ein Medienfluss von 12 dyn/cm² die meisten Endothelzelltypen dazu, sich entlang der Flussachse auszurichten. Diese Reaktion kann durch fluoreszierende Phalloidin-Färbung von F-Aktin (Abbildung 5D,E) oder durch Analyse der Golgi-Kern-Achse (Abbildung 5D,F) sichtbar gemacht werden, wobei beide Methoden eine anisotrope Ausrichtung zeigen, die mit der Endothelzellpolarisation übereinstimmt, wie zuvor beschrieben¹⁸. Obwohl in vivo Scherspannungen über 40 dyn/cm² auftreten, wurden solche Bedingungen hier nicht modelliert.

Eine wesentliche Folge veränderter Gefäßgeometrie ist eine veränderte Strömung, auf die Endothelzellen über mehrere Signalwege reagieren^80,81. Zur Überwachung der Blutflussgeschwindigkeit stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, darunter 4D-Doppler-Ultraschall⁸², 4D-Fluss-Magnetresonanztomographie⁸³ und Laser-Speckle-Bildgebung⁸⁴. Obwohl diese Techniken wichtige in vivo-Vorteile bieten, kann die Auflösung lokaler Strömungsunterschiede innerhalb eines einzelnen Gefäßes schwierig sein. Die hohe numerische Apertur der Bildgebung auf dieser Plattform ermöglicht ein direktes fluoreszentes Partikel-Tracking (Abbildung 6B) und eine hochauflösende kartografische Darstellung von Strömungsanomalien, die durch die Krümmung des Gefäßes hervorgerufen werden, mithilfe der Particle-Image-Velocimetry (Abbildung 6C). Beispielsweise wird langsamerer Fluss entlang der inneren Krümmung des Gefäßes im Vergleich zur äußeren Krümmung beobachtet (Abbildung 6C), was zu veränderten endothelialen Reaktionen beitragen könnte⁸⁵.

Sobald ein konfluenter Gefäßabschnitt etabliert ist, können Durchgängigkeit und Barrierefunktion überprüft werden, indem fluoreszenzmarkierte Makromoleküle wie Dextrane oder Proteine durch das Lumen perfundiert werden. Durchgängige, mit HUVECs ausgekleidete Gefäße behindern den Durchtritt fluoreszenzmarkierter Dextrane (Abbildung 6D,F). Im Gegensatz dazu erhöht die Exposition gegenüber barrierefunktionsstörenden Stimuli wie TNFα die Gefäßleckage (Abbildung 6H, J). Lokale Leckageraten können mittels Kymographenanalyse visualisiert werden (Abbildung 6E,G,I,K). Da im Kymographen die Distanz auf der X-Achse und die Zeit auf der Y-Achse dargestellt wird, lassen sich relative Leckageraten vergleichen, indem die Steigungen von Linien quantifiziert werden, die an segmentierte Fluoreszenzintensitäten angepasst wurden (Abbildung 6E,G,I,K). Diese Analysen ermöglichen die Beurteilung, wie die lokale Gefäßgeometrie die endotheliale Barrierefunktion als Reaktion auf definierte Stimuli beeinflusst.

Ein entscheidender Vorteil dieser Plattform ist der verbesserte mikroskopische Zugang im Vergleich zu dem, was in vivo möglich ist. Das System erleichtert außerdem die immunhistochemische Analyse der molekularen Organisation der Endothelzellen, insbesondere des Aktin-Zytoskeletts. Endothelzellen sind sehr dünn und in vivo von glatten Muskelzellen umgeben, was die Lokalisierung zytoskelettaler Strukturen spezifisch innerhalb des Endothels erschweren kann. Diese Plattform ermöglicht eine einfache Färbung und Abbildung von Adhäsionsmolekülen und filamentösem Aktin in Endothelzellen (Abbildung 5) und unterstützt multikomponentige Analysen, die in vivo schwierig sind, wie beispielsweise die Untersuchung der endothelialen Polarisation und Zellteilung unter physiologischem Fluss (Abbildung 5D–F). Die Kombination dieser Assays auf einer einzigen Plattform ermöglicht die direkte Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Gefäßgeometrie, verändertem Fluss, Barrierefunktion, molekularer Organisation der Endothelzellen und interzellulärer Adhäsion.

Abbildung 1: Arbeitsablauf zum Drucken und zur Verwendung von 3D-Blutgefäßen auf einem Chip. Flussdiagramm der Protokolle zur Erzeugung und Nutzung von 3D-Blutgefäßen auf einem Chip. Schwarze Kreise zeigen die entsprechenden Protokollnummern an. Die Farben der Felder geben die Temperatur an, bei der jedes Protokoll durchgeführt wird oder die Probe inkubiert wird. Der Arbeitsablauf umfasst die Modellierung der Gefäßform, die Zubereitung der Tinte, die Vorbereitung der extrazellulären Matrix (ECM), die Herstellung der Kammer, das Drucken der Gefäße, das Spülen und Beschichten der Gefäße, die Zellbesiedlung, die Durchströmungskultur, funktionelle Assays und die histologische Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Druck von Gefäßen und Konstruktion der Kammer. Gefäße können anhand von in vivo-Gefäßbildern entworfen werden, um patientenspezifische Gefäßgeometrien nachzubilden. (A) Kleines koronares Gefäß, abgebildet mittels kontrastverstärkter Computertomographie (CT), wiedergegeben mit Genehmigung von Parekh et al.⁸⁶ Maßstabsbalken = 2 mm. (B) Koordinatenkarte mit Markierungspunkten aus einem Ausschnitt des Gefäßes in Panel A, erstellt durch Punktregistrierung in FIJI. (C) G-Code-Ausgabe, generiert aus der Koordinatenkarte mithilfe einer Drucksteuerungssoftware. Die X-, Y- und Z-Koordinaten sind unten rechts angegeben. (D) Schematische Darstellung einer Rose-Kammer mit einem biogedruckten Gefäß. Die Konstruktion mit oberen Daumenschrauben ist kompatibel mit der 3D-gedruckten Polymilchsäurekammer (PLA). (E) Rose-Kammer mit einem Gefäß und Reservoiren, die mit opfernacher Bio-Tinte auf einer ECM-beschichteten Deckglasunterlage gedruckt wurden. Maßstabsbalken = 9 mm. (F) Schematische Darstellung einer Rose-Kammer, konfiguriert für das Aneurysma-Modell. Ein durch die Ein- und Auslassnadeln geführter Draht dient als Gefäßvorlage, und opferne Bio-Tinte, die auf dem Draht abgeschieden ist, fungiert als Aneurysmavorlage. (G) Rose-Kammer mit Draht und opferner Bio-Tinte-Vorlage auf einer ECM-beschichteten Deckglasunterlage. (H) 3D-gedruckter PLA-Mikroskopstufenadapter (links) und Rose-Kammer (rechts), die Alternativen zu maschinell bearbeiteten Aluminiumkomponenten darstellen. Metallklammern am Stufenadapter sind an der Adapterplatte befestigt. Maßstabsbalken = 30 mm. (I) Gedrucktes und gespültes Gefäß in einer aus Aluminium gefertigten Rose-Kammer, montiert auf einer Mikroskopstufe mit angeschlossenen Ein- und Auslassnadeln sowie Schläuchen. Maßstabsbalken = 20 mm. Abkürzungen: CT = Computertomographie; ECM = extrazelluläre Matrix; PLA = Polymilchsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Flüssigkeitsdurchflusssystem für ein zellbesiedeltes Gefäß in einer Rose-Kammer. (A) Schematische Darstellung der Schlauchkonfiguration zur Erzeugung eines Flüssigkeitsdurchflusses durch eine Rose-Kammer mit einem zellbesiedelten Gefäß. Pfeile zeigen die Durchflussrichtung an. Nummerierte Komponenten sind (1) peristaltische Pumpe, (2) Dreiventil mit Ansaugspritze, (3) Blasenfalle, (4) Pulsdämpfer, (5) Gefäßvorrichtung und (6) Mediumreservoir. Alle Komponenten, die mit dem Kulturmedium in Kontakt kommen, werden vor der Verwendung sterilisiert. (B) Flüssigkeitsdurchflusssystem mit einem zellbesiedelten Gefäß in einer Rose-Kammer innerhalb eines Zellkultur-Inkubators. Die Nummern entsprechen den in Teil A dargestellten Komponenten. Einlass- und Auslassnadeln sind zur Stabilisierung mit Klebeband befestigt. Maßstabsbalken = 40 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Rheologische Charakterisierung der opferbaren Bio-Tinte. (A) Scherviskosität der nicht pasteurisierten 25 %igen Pluronic F127/1 %igen Polyethylenoxid (PEO)-Tinte in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit bei 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C und 23 °C. (B) Komplexe Viskosität in Abhängigkeit von der Winkelfrequenz für nicht pasteurisierte und pasteurisierte Pluronic F127/PEO-Tinte bei 25 °C und 37 °C. Abkürzung: PEO = Polyethylenoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Bildgebung und quantitative Analyse fixierter und gefärbter endothelialisierter Gefäße. (A) Projektion der maximalen Intensität von Spinning-Disk-Konfokal-Fluoreszenzbildern eines vollständig zellulären Gefäßes nach anfänglichem Ansäen und Kultivierung unter niedrigem Schubspannung (1 dyn/cm²). Das Gefäß wurde für VE-Cadherin (grün), F-Aktin (rot) und DNA mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 50 µm. (B) Rekonstruierter xz-Querschnitt eines z-Stapels von Spinning-Disk-Konfokal-Fluoreszenzbildern eines vollständig zellulären Gefäßes, das mit fluoreszierendem Phalloidin zur Markierung von F-Aktin (rot) gefärbt wurde. Maßstabsbalken = 50 µm. (C) Projektion der maximalen Intensität eines z-Stapels von Spinning-Disk-Konfokal-Fluoreszenzbildern eines vollständig zellulären Gefäßes nach 24 h Fluss bei 12 dyn/cm². F-Aktin wurde mit fluoreszierendem Phalloidin (rot) markiert. Maßstabsbalken = 100 µm. (D) Spinning-Disk-Konfokal-Fluoreszenzbild eines Gefäßabschnitts nach 24 h Kultivierung unter einer Schubspannung von 16 dyn/cm². Das Gefäß wurde für VE-Cadherin (gelb), F-Aktin (magenta), den Golgi-Marker GM130 (grün) und DNA mit DAPI (blau) gefärbt. Der Pfeil zeigt die Strömungsrichtung an. Maßstabsbalken = 30 µm. (E) Repräsentative Quantifizierung der mittleren Orientierung der Spannungsfasern aus dem F-Aktin-Kanal in Panel D mithilfe von FibrilTool74. Ein Raster aus 45 Regionen, jede mit einer Fläche von 1.600 µm², wurde analysiert, und die mittleren Faserorientierungen werden als radiales Histogramm relativ zur Strömungsrichtung dargestellt. (F) Repräsentative Quantifizierung der Kern-Golgi-Achse aus Panel D als Maß für die Polarisation endothelialer Zellen. Vektoren vom Zentrum jedes Kerns zum Zentrum des entsprechenden Golgi-Apparats sind als radiales Histogramm relativ zur Strömungsrichtung dargestellt; n = 75 Vektoren. Abkürzung: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Analyse des Flüssigkeitsflusses und der vaskulären Durchlässigkeit. (A) Schematische Darstellung der Gefäßgeometrie, die für die Analysen in den Panels B–K verwendet wurde. Die Buchstaben zeigen die ungefähren Gefäßbereiche an, die den jeweiligen Panels entsprechen. (B) Farbkodierte zeitliche Projektion einer zeitraffenden Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie-Fluoreszenzbildsequenz, die fluoreszierende Kügelchen zeigt, die sich unter Fluss durch einen gekrümmten Gefäßabschnitt bewegen. Die Farbe gibt die Bildnummer von 1 bis 100 an; die äußere und innere Krümmung sind markiert. (C) Particle-Image-Velocimetry-(PIV)-Analyse, die die relative Strömungsgeschwindigkeit im gekrümmten Gefäßbereich zeigt. Die Farben repräsentieren die relative Geschwindigkeit, Pfeile zeigen Strömungsrichtung und -stärke. Maßstab = 50 µm. (D–G) Repräsentativer vaskulärer Barriertest an einem unbehandelten Gefäß, das mit Alexa 647-markiertem 10 kDa Dextran perfundiert wurde. (D,D′,D″) Bilder eines geraden Gefäßabschnitts, aufgenommen zu den Zeitpunkten 0, 70 und 150 min. Die weiße Linie markiert den Bereich, der für das Kymograph in Panel E verwendet wurde. (E) Kymograph des geraden Bereichs in Panel D zeigt eine Leckrate von 0,39 µm/min, was der Steigung der gestrichelten Linie entspricht. (F,F′,F″) Bilder des gekrümmten Gefäßbereichs, aufgenommen zu den Zeitpunkten 0, 70 und 150 min. Die weiße Linie markiert den Bereich, der für das Kymograph in Panel G verwendet wurde. Maßstab = 150 µm. (G) Kymograph des gekrümmten Bereichs in Panel F zeigt eine Leckrate von 1,01 µm/min, was der Steigung der gestrichelten Linie entspricht. (H–K) Repräsentativer vaskulärer Barriertest nach Vorinkubation mit 250 ng/mL Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNFα). (H,H′,H″) Bilder eines geraden Gefäßabschnitts, aufgenommen zu den Zeitpunkten 0, 200 und 400 min. Die weiße Linie markiert den Bereich, der für das Kymograph in Panel I verwendet wurde. Maßstab = 250 µm. (I) Kymograph-Analyse des geraden Gefäßbereichs in Panel H zeigt eine Leckrate von 2,1 µm/min, was der Steigung der gestrichelten Linie entspricht. (J,J′,J″) Bilder des gekrümmten Gefäßbereichs, aufgenommen zu den Zeitpunkten 0, 200 und 400 min. Die weiße Linie markiert den Bereich, der für das Kymograph in Panel K verwendet wurde. Maßstab = 250 µm. (K) Kymograph-Analyse des gekrümmten Gefäßbereichs in Panel J zeigt eine Leckrate von 6,7 µm/min, was der Steigung der gestrichelten Linie entspricht. Die Sternchen in den Panels D–K markieren die entsprechenden Enden der Linien, die zur Erstellung der Kymographen verwendet wurden. Abkürzungen: PIV = Particle-Image-Velocimetry; TNFα = Tumor-Nekrose-Faktor-alpha. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Gefäßdruck mittels STL-basierter Druckerprogrammierung. (A) Differenziell-interferenzmikroskopische Aufnahme eines gedruckten Gefäßes, das mittels STL-basierter Druckerprogrammierung erzeugt wurde, bei der der Druckkopf zu zwei Durchgängen angewiesen wird, wodurch eine geflochtene Gefäßstruktur entsteht. Maßstab = 250 µm. (B) 3D-Darstellung des durchspülten, geflochtenen Gefäßes, das mit mit Alexa 647 markiertem Rinderserumalbumin (BSA) gefüllt ist. Zwischen den Lumina der beiden geflochtenen Stränge ist eine Lücke sichtbar. Maßstab = 100 µm. Abkürzungen: BSA = bovine serum albumin; STL = standard tessellation language. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: G-Code zum Drucken des Gefäßes. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: CAD-Zeichnung der Rose-Kammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 3: CAD-Zeichnung des Bühnenhalterungsadapters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Es wird ein robustes System zur Modellierung vaskulärer Geometrien im Zusammenhang mit gestörter Strömung beschrieben, einschließlich gewundener Gefäße, Aneurysmen und Verzweigungspunkte. Die Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung, Strömungsabbildung und die Beurteilung der vaskulären Barrierefunktion innerhalb einer Plattform, die für Zellbiologen mit begrenzter Erfahrung in der Bioingenieurwissenschaft zugänglich ist. Obwohl der primäre Ansatz einen Bioprinter erfordert, reicht die Palette der im Handel erhältlichen extrusionsbasierten Drucker von Open-Source-Systemen bis hin zu fortschrittlicheren Plattformen mit mehreren Druckköpfen. Zu den wesentlichen Druckfunktionen gehören die Steuerung der Druckkopf- und Tintentemperatur, eine präzise Druckregulierung sowie die Temperierung des Druckbetts. Neben biogedruckten gewundenen und verzweigten Gefäßen umfasst die Methode auch ein Aneurysma-Modell, das ohne einen Bioprinter hergestellt werden kann. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die Untersuchung der Endothelzellenfunktion in gewundenen Gefäßen mithilfe von Mikroskopiemethoden, die in Zellbiologielabors üblich sind.

Zahlreiche in vitro-Modellsysteme stehen zur Untersuchung der vaskulären Funktion zur Verfügung^87,88, jedes mit spezifischen Stärken und Einschränkungen. Das hier beschriebene System, das auf früheren Arbeiten basiert^54,67,69, eignet sich besonders gut, um die Auswirkungen vaskulärer Torsion auf die endotheliale Funktion zu untersuchen, da es die direkte Modellierung patientenbasierter Gefäßgeometrien sowie eine systematische Variation der vaskulären Krümmung innerhalb eines einzelnen Geräts ermöglicht. Andere Ansätze haben patientenbasierte koronare Gefäße unter physiologischem Fluss mithilfe von photopolymerisierbarem Gelatine-Methacrylat nachgebildet, um verkleinerte Gefäßstrukturen herzustellen⁶⁰. Solche Systeme bieten eine genaue Modellierung der Gefäße, eine Analyse des Flusses und die mögliche Einbindung von Tunica-media-Schichten. Aufgrund ihrer Gesamtgröße und der Notwendigkeit einer Glasunterlage können sie jedoch hochauflösende Bildgebung und lokalisierte Leckage-Assays einschränken. Demgegenüber ermöglichen kleinere Systeme, die auf der Selbstorganisation von aus iPSCs abgeleiteten endothelialen Zellen beruhen, eine hochauflösende Bildgebung und können sowohl endotheliale als auch vaskuläre glatte Muskelzellen integrieren⁸⁹. Diese Modelle bieten jedoch weniger Kontrolle über die Gefäßgeometrie, und die Erzeugung hoher Flussraten und Scherkräfte kann schwierig sein. Das vorliegende System stellt daher einen praktischen Mittelweg dar, der definierte Gefäßgeometrie mit hochauflösender Bildgebung der vaskulären Torsion kombiniert.

Ein wesentlicher Vorteil dieser Plattform ist die Möglichkeit, Gefäße mit sowohl gekrümmten als auch geraden Abschnitten herzustellen, wodurch ein direkter Vergleich lokaler Gefäßgeometrien innerhalb derselben Probe möglich ist, während andere experimentelle Variablen konstant bleiben, wie in Abbildung 6 gezeigt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, bildgebende Verfahren wie Angiographie oder CT mit Kontrastmittel zur Gewinnung patientenstammender Gefäßbilder nutzen zu können. Die Hauptbeschränkung bei der Nachbildung patientenstammender Gefäße ist deren Größe. Gefäße mit einem Durchmesser unter 150 µm sind nur schwer reproduzierbar druckbar, während Gefäßsegmente, die sich über mehrere Zentimeter erstrecken, größere Haltekammern erfordern. Die Gefäßsegmente sollten außerdem in der dritten Dimension relativ flach bleiben, damit sie auf die Basismatrixschicht aufgedruckt werden können und während der mikroskopischen Bildgebung innerhalb der Arbeitsdistanz der Objektivlinse verbleiben.

In zukünftigen Arbeiten könnte das hier beschriebene System weiter modifiziert werden, um Erkrankungen wie die Arteriosklerose zu modellieren, bei denen die Gefäßgeometrie zur Pathophysiologie beitragen kann. Genetisch veränderte Endothelzellen oder zusätzliche Zelltypen, einschließlich glatter Muskelzellen und Immunzellen, könnten integriert werden, um die physiologische Komplexität zu erhöhen. Die Einbindung glatter Muskelzellen unterhalb der Endothelschicht, wie bereits in einfacheren Systemen gezeigt, könnte zusätzliche Einblicke in die Interaktionen zwischen glatten Muskelzellen und Endothel bei vaskulärer Torsion und Erkrankungen ermöglichen⁹⁰. Weitere Modifikationen könnten Tumorzellen umfassen, um den Intravasationsprozess^68,91 und den Einfluss der Torsion auf diesen Vorgang zu untersuchen. Die Plattform könnte ebenfalls genutzt werden, um zu erforschen, wie gestörte Strömungsverhältnisse entzündliche Reaktionen verändern^92,93 und möglicherweise zu vaskulären Komplikationen im Zusammenhang mit Infektionen wie COVID-19 beitragen⁹⁴. Angesichts der weiten Beteiligung des vaskulären Systems an der menschlichen Gesundheit und Krankheit könnten zugängliche Systeme wie dieses die weitere Untersuchung der Endothelfunktion in verschiedenen Krankheitskontexten erleichtern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS), 97 %	Sigma-Aldrich	281778	Wird zur Silanisierung und Aktivierung von Glasdeckgläsern vor der ECM-Anbindung verwendet.
1-mL-Sterilspritze	Fisher Scientific	14-823-434	Wird zur Reagenzienzufuhr, Beschichtung von Gefäßen und Flüssigkeitshandhabung verwendet.
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP	Wird zur Reagenzienherstellung, zum Waschen und Spülen von Gefäßen verwendet.
10-mL-Sterilspritze	Fisher Scientific	14-955-459	Wird zur Reagenzienherstellung und Flüssigkeitsübertragung verwendet.
Kegelröhrchen mit Verschluss, 15 mL	Fisher Scientific	05-538-59A	Wird zur Reagenzienherstellung, Zellhandhabung und Lösungslagerung verwendet.
Petrischale aus Polystyrol, 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Dient als steriler Arbeits- oder Inkubationsbehälter.
21-G-Nadel	Fisher Scientific	14-817-227	Wird zur Herstellung von Gefäßvorlagen und zum Zugang zur Kammer verwendet.
23-G-Nadel	Fisher Scientific	14-817-237	Wird für Ein- und Auslassanschlüsse der Gefäße während Spülen und Perfusion verwendet.
27-G-transparente konische Dosier-Nadel	Nordson	7018417	Wird zur Extrusion des opfern Tintenmaterials und zur Visualisierung von Luftblasen während des Druckens verwendet.
3-mL-Sterilspritze	Fisher Scientific	14-955-459	Wird zur Flüssigkeitsübertragung und Reagenzienzufuhr verwendet. Überprüfen Sie die Artikelnummer, da die angegebene Nummer auch für die 10-mL-Spritze aufgeführt ist.
Medizinischer Formdraht aus rostfreiem Stahl 304, Durchmesser 0,0190 Zoll	Component Supply	GWX-0190-36	Dient als entfernbares Modell für das gerade Lumen im drahtbasierten Aneurysma-Modell.
Kegelröhrchen mit Verschluss, 50 mL	Fisher Scientific	05-526B	Wird zur Herstellung, Mischung, Pasteurisierung und Lagerung von Reagenzien verwendet.
Alexa 488-markiertes sekundäres Antimaus-Antikörper	Thermo Fisher Scientific	A32723TR	Fluoreszierender sekundärer Antikörper für Immunfärbungen.
Alexa 555-markiertes sekundäres Kaninchen-Antikörper	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Fluoreszierender sekundärer Antikörper für Immunfärbungen.
Alexa 647-markiertes Rinderserumalbumin	Thermo Fisher Scientific	A34785	Fluoreszierender makromolekularer Tracer für Assays zur Gefäßbarriere/Leckage.
Alexa 647-markiertes Dextran, 10 kDa	Thermo Fisher Scientific	D22914	Fluoreszierender Tracer zur Beurteilung der endothelialen Barrierefunktion und Gefäßleckage.
Alexa 647-Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	Wird zur fluoreszierenden Markierung von F-Aktin für die zytoskelettale Bildgebung und Orientierungsanalyse verwendet.
Albumin, Rinderserum, Fraktion V, fett- und säurefrei	Sigma-Aldrich	126575-10GM	Wird zum Blockieren und zur Herstellung proteinhaltiger Lösungen verwendet.
Antibiotikum-Antimykotikum, 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Optionales antimikrobielles Zusatzmittel für ECM und Kulturmedium.
Anti-GM130-Antikörper, Klon 4A3	Sigma-Aldrich	MABT1363	Primärer Antikörper zur Markierung des Golgi-Apparats für die Analyse der endothelialen Polarität.
Anti-VE-Cadherin-Kaninchen-monoklonaler Antikörper, D87F2	Abcam	65707	Primärer Antikörper zur Visualisierung von endothelialen Zell-Zell-Verbindungen.
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C7902	Wird bei der Herstellung von ECM und Pufferlösungen zur Fixierung verwendet. Überprüfen Sie, ob das gewünschte Reagenz wasserfreies oder wasserhaltiges Calciumchlorid ist.
Verbindersatz	World Precision Instruments	504954	Luer- auf Schlauchverbinder zur Montage des mikrofluidischen Perfusionskreislaufs.
Deckglas-Färbehalter	Electron Microscopy Sciences	72240	Wird zum Halten von Deckgläsern während Reinigung, Silanisierung, Aktivierung und Waschen verwendet.
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G7021-100G	Komponente des Permeabilisierungspuffers, der während der Immunfärbung verwendet wird.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Fluoreszierender Kernfarbstoff zur Zellbildgebung und Polaritätsanalyse.
Digitaler Heizplatte	Fisher Scientific	11-475-028	Wird verwendet, um die Gefäßkammer und Reagenzien während der Montage auf etwa 37 °C zu halten.
EGTA-Tetranatriumsalz	Sigma-Aldrich	E8145-10G	Chelatbildner, der im Permeabilisierungspuffer verwendet wird.
Weiblicher barbierter Luer-Verbinder für Schlauch mit 1/16 Zoll Innendurchmesser	Scientific Commodities Inc.	BB330A	Wird zum Verbinden von Schläuchen innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs verwendet.
Weiblicher Luer mit 1/16 Zoll Innendurchmesser-Barb, CrystalVu QC	Fisher Scientific	01-000-123	Wird für Schlauch- und Gefäßkammer-Verbindungen verwendet.
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630	ECM-Komponente, die zusammen mit Gelatine und Thrombin zur Bildung des hydrogelförmigen, gefäßtragenden Gerüsts verwendet wird. Quelle überprüfen: Die Publikation beschreibt Fibrinogen aus menschlichem Plasma, während die Tabelle Fibrinogen aus Rinderplasma angibt.
Flüssigkeitspulsdämpfer	Darwin Microfluidics	SE-D1606-3NB-PC-31	Wird verwendet, um pulsierende Schwankungen zu reduzieren, die von der peristaltischen Pumpe erzeugt werden.
Silikonkautschukstreifen für die Lebensmittelindustrie, hitzebeständig	McMaster-Carr	8417K51	Wird zur Herstellung der Dichtung für die Rose-Kammer verwendet.
Gelatine aus Schweinehaut, Gelierfestigkeit 300, Typ A	Sigma-Aldrich	G2500	Hauptbestandteil der ECM, der zur Bildung des Hydrogels um das Gefäßlumen verwendet wird.
Glasdeckglas, Nr. 1,5	VWR	EN-MAS-25X25-1-5-CS	Substrat für hochauflösende Mikroskopie und Kammeroberfläche.
Glutaraldehyd, 25 %	Electron Microscopy Sciences	16220	Wird verdünnt zur Aktivierung von Deckgläsern vor der ECM-Anbindung verwendet.
Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040	Zusatzkit, das mit dem basalen vaskulären Zellmedium für die endotheliale Zellkultur verwendet wird.
Growth Kit-VEGF	ATCC	PCS-100-041	Endotheliales Wachstumszusatzmittel, das bei Bedarf mit dem basalen vaskulären Zellmedium verwendet wird.
Fibronectin aus menschlichem Plasma	Sigma-Aldrich	FC010	Optionale luminalen ECM-Beschichtung zur Förderung der endothelialen Anheftung.
In-Line-Schlauchklemme	Sigma-Aldrich	Z503371-1PAK	Wird verwendet, um den Fluss durch Schläuche während der Kammermanipulation und Inkubation zu stoppen und zu regulieren.
Ismatec Reglo Digital peristaltische Pumpe	Masterflex	78018-12	Wird verwendet, um kontrollierten Flüssigkeitsstrom durch zellbesiedelte Gefäße zu erzeugen.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Optionale luminalen ECM-Beschichtung zur Modifikation der endothelialen Adhäsion und Polarisation.
Satz mit Luer- auf Schlauchkupplungen	World Precision Instruments	504954	Wird zum Verbinden von Schläuchen, Spritzen und Ein-/Auslasskomponenten der Kammer verwendet. Doppelter Eintrag der Artikelnummer des Verbindersatzes; bei Identität einen Eintrag beibehalten.
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	M2393-100G	Komponente der Fixier- und Permeabilisierungspuffer.
Männlicher barbierter Luer-Verbinder für Schlauch mit 1/16 Zoll Innendurchmesser	Scientific Commodities Inc.	BB329A	Wird für mikrofluidische Schlauchverbindungen verwendet.
Männlicher Luer-Verbinder, 1/16 Zoll Innendurchmesser	World Precision Instruments	13160-100	Wird zum Anschließen von Schläuchen an Spritzen und Kammerkomponenten verwendet.
Matrigel	Sigma-Aldrich	CLS356234-1EA	Optionale luminalen ECM-Beschichtung zur endothelialen Anheftung.
Flaschendeckel für Medien	Fisher Scientific	05-719-310	Zweilochdeckel zur Herstellung steriler Kulturmediumreservoirs für den Flusskreislauf.
Nalgene Pharma-Grade Silikonschlauch, 1/16 Zoll Innendurchmesser	Thermo Fisher Scientific	8600-0020	Flexibler Schlauch für mikrofluidische Perfusions- und Spülschaltungen.
Parafilm	Electron Microscopy Sciences	70990-125	Wird als nicht haftende Oberfläche während der Polymerisation von ECM-Beschichtungen auf Deckgläsern verwendet.
PBS, 10x, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	70011044	Konzentrierter Puffer zur Herstellung von Arbeitslösungen mit PBS.
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotikazusatz für endotheliales Kulturmedium und Spüllösungen.
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851-25G	Pufferkomponente der Permeabilisierungslösung.
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Temperaturabhängige Komponente der opfern Drucktinte.
Polycarbonat-Dreiwegehahn mit männlichem Luer	Fisher Scientific	NC9593742	Wird zum Priming, Umschalten und Steuern von Fluidpfaden im Perfusionskreislauf verwendet.
Polyethylenglykol (PEO)	Sigma-Aldrich	372781	Polymerkomponente der opfern Tintenformulierung.
Drehmischer	Fisher Scientific	88861050	Wird zum Mischen der opfern Tinte aus PEO/Pluronic bei 4 °C verwendet.
Färbebehälter für Objektträger	MSE Supplies	DWK90020	Wird zum Waschen, Färben oder zur Reagenzieninkubation von Deckgläsern verwendet.
Quadratisches Deckglas, Nr. 2, 25 mm × 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS285525-1000EA	Kammerdeckglas; das dickere Nr.-2-Glas bietet erhöhte Bruchfestigkeit und ist kompatibel mit geeigneten Luft- oder Wasserobjektiven.
Stumpfe Edelstahl-Dosier-Nadel, 21 G, 1 Zoll	Component Supply	NE-212PL	Wird zur Flüssigkeitszufuhr oder zur Konstruktion des drahtbasierten Gefäßmodells verwendet.
Steriflip-Vakuumfiltereinheiten	MilliporeSigma	SE1M179M6	Wird zum sterilen Filtrieren von warmer Gelatine und anderen kompatiblen Lösungen verwendet.
Sterile Kunststoff-Spritzen, 5 mL	Allevi	PSYR5-S	Wird zum Befüllen der opfern Tinte für den pneumatischen Extrusionsdruck verwendet.
Thrombin, aus menschlichem Plasma, hohe Aktivität	Sigma-Aldrich	605195	Wird zur Initiierung der Fibrinpolymerisation während der ECM-Gelbildung verwendet.
Transglutaminase	Moo Gloo	1201	Vernetzendenzym, das während der Herstellung und Modifikation des Gelatine-/Fibrin-ECM verwendet wird.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648466	Reinigungsmittel zur Permeabilisierung endothelialer Zellen vor der Immunfärbung.
TrypLE Express Enzym, 1x, mit Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	12605010	Zelldissoziationsreagenz zur Gewinnung endothelialer Zellen vor der Besiedlung der Gefäße.
Tween 20	Sigma-Aldrich	11332465001	Reinigungsmittelkomponente des Blockierpuffers für die Immunfärbung.
Basales vaskuläres Zellmedium	ATCC	PCS-100-030	Basismedium für die endotheliale Zellkultur und Perfusionsversuche.