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Methodenartikel

Peristaltik-induzierte mechanische Aktivierung von Makrophagen

104 Aufrufe

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DOI:

10.3791/72607

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18. August 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines patentierten Bioreaktors für Studien zur mechanisch-immunmodulatorischen Wirkung. Anhand eines speziell angefertigten Bioreaktors, der physiologische Kräfte nachbildet, zeigen wir hier, dass Makrophagen auf mechanische Stimulation mit einer deutlich proinflammatorischen Antwort reagieren.

Zusammenfassung

Entzündung ist ein komplexer Prozess, der sowohl akute als auch chronische Erkrankungen vorantreibt. Er wird durch aufeinanderfolgende biochemische und biophysikalische Signale moduliert, die zur Aktivierung von Immunzellen führen. Makrophagen sind eine zentrale Immunzellpopulation, die an zahlreichen entzündlichen Erkrankungen beteiligt ist, darunter Krebs, Fibrose und Autoimmunerkrankungen. Herkömmliche Methoden zur Untersuchung der Makrophagenaktivierung beinhalten die biochemische Stimulation mit definierten Zytokinen oder Chemokinen, wodurch Makrophagen in Zustände mit pro- oder anti-inflammatorischer Polarisation überführt werden. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass neben biochemischen auch biophysikalische Signale eine Rolle bei der Makrophagenaktivierung spielen. Ein solches weit verbreitetes mechanisches Signal ist die Peristaltik, die aus mehrachsiger Dehnung und Scherkräften besteht und im Magen-Darm-Trakt, Uterus, sich entwickelnden Atemwegen und Harnleitern auftritt. In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese geprüft, dass Peristaltik Makrophagen aktivieren könnte. In diesem Protokoll wird die Anwendung eines peristaltischen Bioreaktors zur Untersuchung der mechanischen Aktivierung von Makrophagen beschrieben. Polydimethylsiloxan-Membranen wurden mit Fibronectin beschichtet, um die Makrophagenadhäsion zu verbessern. Immortalisierte murine Makrophagen aus Knochenmark (iBMDM) wurden auf fibronectinbeschichteten Membranen ausgesät und entweder als statische Kontrollen gehalten oder vier Stunden lang Peristaltik ausgesetzt. Die Peristaltik führte zur Aktivierung der Makrophagen, wobei signifikante Unterschiede in der Genexpression beobachtet wurden. Il6 (50,9-fach gegenüber statischen Kontrollen; p < 0.0001, t-Test) und Nos2 (19,8-fach gegenüber statischen Kontrollen; p = 0,0046). Interessanterweise wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet in Chil3 (1,22-fach gegenüber statischen Kontrollen; p = 0,9726) oder Mrc1 (1,16-fach gegenüber statischen Kontrollen; p = 0.9810) im Vergleich zu statischen Kontrollen, was darauf hindeutet, dass mechanische Reize die proinflammatorische Aktivierung maßgeblich antreiben. Die vorliegenden Ergebnisse stützen das Konzept der mechano-immunmodulatorischen Wirkung auf Makrophagen, insbesondere als Reaktion auf Peristaltik-bedingte mechanische Reize, die in vielen glattmuskulären Geweben verbreitet sind.

Einleitung

Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die essentielle Rollen in der Abwehr des Wirts, der Gewebeumgestaltung und der Regulierung von Entzündungen durch Phagozytose und Zytokinausschüttung spielen1,2,3,4. Abhängig von Stimuli im in vivo-Mikromilieu können undifferenzierte Makrophagen (M0) plastisch in proinflammatorische (M1) oder antiinflammatorische/pro-regenerative (M2) Phänotypen polarisieren5,6. In-vitro-Modelle werden typischerweise verwendet, um diese unterschiedlichen Stimuli zu isolieren und die komplexen Mechanismen, die die Makrophagenpolarisierung steuern, besser zu verstehen. Klassisch aktivierte M1-Makrophagen werden in vitro üblicherweise durch biochemische Stimuli wie Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon-gamma (IFN-γ) induziert, was zu einer erhöhten Expression entzündungsfördernder Mediatoren führt, darunter induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), Interleukin-6 (IL6) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α)7,8. Alternativ aktivierte M2-Makrophagen werden häufig durch Exposition gegenüber Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) induziert, wodurch Gewebeumgestaltungs- und Wundheilungsreaktionen gefördert werden8,9. M2-Makrophagen lassen sich weiter in M2a-, M2b- und M2c-Phänotypen unterteilen, basierend auf unterschiedlichen Aktivierungswegen und Profilen der Oberflächenmarkerausprägung10,11. Obwohl die biochemische Regulation der Makrophagenpolarisierung sowohl in in-vivo- als auch in in-vitro-Systemen umfassend charakterisiert wurde, leben Makrophagen in hochdynamischen Mikromilieus, die auch erhebliche biophysikalische Stimuli enthalten12. Neben löslichen Zytokinen und Chemokinen sind Makrophagen der extrazellulären Matrix und Zell-Zell-Interaktionen, Substratsteifigkeit, Fluidschubspannung, hydrostatischem Druck und zyklischer Gewebedehnung ausgesetzt12,13,14. Als mechanosensitive Zellen können Makrophagen ihre entzündlichen Phänotypen als Reaktion auf diese physikalischen Reize verändern, was die Bedeutung der Mechanobiologie in der Immunregulation unterstreicht.

Eine zunehmende Zahl wissenschaftlicher Arbeiten hat gezeigt, dass isolierte mechanische Reize in vitro den Aktivierungszustand von Makrophagen erheblich beeinflussen können (Abbildung 1). Die Exposition gegenüber steiferen Substraten führte im Vergleich zu weicheren Substraten, die ein pro-regeneratives Phänotyp hervorriefen, zu einer stärkeren M1-Polarisierung und erhöhter Produktion entzündungsfördernder Zytokine15,16,17,18,19,20. Ebenso moduliert Scherspannung durch Flüssigkeitsströmung den Makrophagenphänotyp in abhängigkeit von der Stärke, wobei geringe Strömungsraten im Interstitium häufig eine pro-regenerative Aktivierung fördern21,22, während höhere Scherspannungen, wie sie in den Arterien vorkommen, entzündungsfördernde Reaktionen auslösen können23,24,25,26,27,28. Zyklische Dehnung in vitro, die zur Nachbildung der mechanischen Bedingungen im muskuloskelettalen System, Myokard, Lungengewebe und Darm entwickelt wurde, führte ebenfalls zu einer erhöhten Expression entzündlicher Mediatoren, wobei die Ergebnisse je nach Stärke, Dauer, Frequenz und Dimensionalität der aufgebrachten Kraft variieren29,30,31,32. Darüber hinaus unterscheidet sich die mechanosensorische Empfindlichkeit von Makrophagen zwischen verschiedenen Arten und Zellquellen, was die Bedeutung einer geeigneten Auswahl experimenteller Modelle für die Mechanobiologie unterstreicht13,14.

Diagramm der Makrophagenaktivierung; biochemische, biophysikalische Stimuli; phänotypische Veränderungen; Stressfaktoren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der in vitro biochemischen und biophysikalischen Stimuli zur Aktivierung von Makrophagen in proinflammatorische oder pro-regenerative Zustände. Makrophagen können in vitro durch Zugabe chemischer Stimuli wie Lipopolysaccharid (LPS), Interferon γ (IFN-γ) oder durch Exposition gegenüber mechanischen Stimuli – einschließlich Scherstress, erhöhter Steifigkeit, hohen zyklischen und statischen einachsigen dehnungsinduzierten Belastungen, Kompression sowie mehrachsigen kompressionsinduzierten Dehnungen – in einen proinflammatorischen Zustand stimuliert werden. Makrophagen können durch die in vitro-Zugabe der chemischen Stimuli Interleukin-13 (IL-13) und IL-4 in einen pro-regenerativen Zustand überführt werden. Sie können auch pro-regenerativ werden, wenn sie mechanischen Stimuli wie oszillierendem Scherstress, interstitiellem Fluss, weichen Substraten oder geringen einachsigen zyklischen Dehnungen ausgesetzt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Neben der Untersuchung isolierter mechanischer Reize ist es wichtig, auf diesen Erkenntnissen aufzubauen, um die Auswirkungen zusammengesetzter physikalischer Kräfte zu erforschen, da Makrophagen in vivo gewöhnlich Kombinationen simultan wirkender Kräfte ausgesetzt sind. Die Peristaltik stellt eine solch komplexe mechanische Umgebung dar, die aus gleichzeitig auftretender mehrachsiger zyklischer Dehnung und Scherbelastung durch Flüssigkeitsströmung besteht, hervorgerufen durch Kontraktionen des glatten Muskelgewebes33. Diese mechanischen Bedingungen finden sich in mehreren Organsystemen, darunter im Magen-Darm-Trakt, den sich entwickelnden Atemwegen, dem Gefäßsystem, der Gebärmutter und den Harnleitern34,35,36. Bedeutsamerweise ist die peristaltische Funktion bei entzündlichen Erkrankungen häufig gestört, wie beispielsweise bei Fibrose, entzündlichen Darmerkrankungen, Krebs und Erkrankungen mit Umbau der Atemwege, bei denen jeweils eine erhebliche, von Makrophagen vermittelte Entzündungsreaktion auftritt33,37,38,39. Trotz der anerkannten Rolle von Makrophagen bei diesen Erkrankungen besteht weiterhin eine entscheidende Wissenslücke hinsichtlich des direkten Einflusses peristaltischer mechanischer Kräfte auf die Aktivierung von Makrophagen.

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung eines Peristaltik-Bioreaktorsystems, um die mechanische Immunmodulation von Makrophagen unter physiologisch relevanten mechanischen Bedingungen zu untersuchen. Im Vergleich zu herkömmlichen statischen Kultursystemen oder Plattformen mit einaxialer mechanischer Stimulation ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Applikation zyklischer multiaxialer Dehnung und Scherbelastung durch Flüssigkeitsströmung, wodurch das mechanische Mikromilieu von Geweben auf Basis glatter Muskulatur in vivo besser nachgebildet wird. In diesem Protokoll zeigten immortalisierte, aus murinem Knochenmark stammende Makrophagen (iBMDMs), die unter Peristaltik-Bedingungen in Bioreaktoren kultiviert wurden, erhöhte Marker der M1-Aktivierung, ohne gleichzeitig Tendenzen zur M2-Aktivierung aufzuweisen. Diese Ergebnisse zeigen, dass peristaltische mechanische Reize ausreichen, um das entzündliche Verhalten von Makrophagen zu modulieren, und stützen das weiter gefasste Konzept der mechanischen Immunmodulation in Geweben, die dynamischen, von glatter Muskulatur erzeugten Kräften ausgesetzt sind. Diese Methode eignet sich besonders für Forschende, die Mechanobiologie, Entzündungen, Gewebeengineering, gastrointestinale Physiologie, pulmonale Entwicklung, Fibrose und andere Erkrankungen untersuchen, bei denen Makrophagen komplexen mechanischen Mikroumgebungen ausgesetzt sind. Durch sorgfältige Montage, konsistente Kalibrierung und kontinuierliche Überwachung können Anwender eine reproduzierbare Leistung der Bioreaktoren sicherstellen und häufige Einschränkungen dieser Technik vermeiden.

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Protokoll

Das Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines patentierten40 Bioreaktorsystems für Studien zur mechano-immunmodulatorischen Wirkung. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Zellkultur

  1. Kultivieren Sie immortalisierte murine aus Knochenmark stammende Makrophagen (iBMDMs) in komplettem RPMI 1640, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 1% HEPES-Puffer, 1% Natriumpyruvat und 1% Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C mit 5% CO2.

2. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)

  1. Wiegen und mischen Sie die Basis und den Härter des Silikonelastomer-Kits im Gewichtsverhältnis 10:1 (w/w).
  2. Rühren Sie die Mischung 5 Minuten lang um, um eine gleichmäßige Durchmischung sicherzustellen.
  3. Gießen Sie das gemischte PDMS vorsichtig in eine quadratische Petrischale (100 mm × 15 mm), bis das PDMS eine Höhe von 3 mm erreicht.
  4. Stellen Sie die Petrischalen mit PDMS in einen Exsikkator.
  5. Entgasen Sie unter Vakuum für 1 Stunde, um Luftblasen zu entfernen.
  6. Entnehmen Sie das PDMS aus dem Exsikkator und vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen mehr vorhanden sind.
  7. Überführen Sie die ungehärteten PDMS-Membranen in einen auf 60 ˚C vorgeheizten Ofen und härten Sie sie 4 Stunden lang aus.
  8. Entnehmen Sie die PDMS-Membranen aus dem Ofen und lassen Sie sie über Nacht auf der Laborbank abkühlen.
  9. Nach 18–24 Stunden lösen Sie die gehärteten PDMS-Membranen vorsichtig von den Petrischalen und schneiden Sie sie zu 70 mm × 40 mm × 3 mm großen PDMS-Membranen zurecht.

3. Sterilisation der PDMS-Membran

  1. Spülen Sie die PDMS-Membranen innerhalb eines Sicherheitswerkbanks mit 70%igem Ethanol und legen Sie sie direkt auf die Oberfläche der Sicherheitswerkbank (BSC) (Zusatzmaterial Abbildung 1).
  2. Sterilisieren Sie die Membranen 10 Minuten lang mit UV-Licht und überführen Sie die PDMS-Membran anschließend in eine nicht gewebekulturbehandelte 90-mm-Kulturschale, wobei die der UV-Bestrahlung ausgesetzte Seite nach oben zeigt.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die PDMS-Membranen immer an den Seiten anzufassen und niemals die Hände über deren Oberseite zu kreuzen, um das Kontaminationsrisiko zu verringern.
  3. Verwenden Sie für Peristaltik-Experimente die PDMS-Membranen in ihren ursprünglichen Abmessungen.
  4. Bei statischen Kulturbedingungen schneiden Sie jede 70 mm × 40 mm große PDMS-Membran in zwei gleich große Hälften von jeweils 35 mm × 40 mm.

4. Fibronectin-Beschichtung von PDMS-Membranen

  1. Bereiten Sie innerhalb eines BSC eine sterile Fibronectin-Lösung mit einer Konzentration von 0,5 mg/mL in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in ausreichender Menge vor, um je Membran 100 µL hinzuzufügen.
  2. Geben Sie 100 µL dieser Beschichtungslösung in die Mitte jeder PDMS-Membran, wobei sichergestellt werden muss, dass der beschichtete Bereich genau mit dem Kontaktbereich zwischen PDMS und Schraube übereinstimmt.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Lösung vorsichtig zu einem dünnen, gleichmäßigen Film zu verteilen.
  3. Lassen Sie die beschichteten PDMS-Membranen 45 Minuten lang mit geöffnetem Deckel in der Kulturschale, damit die Adsorption erfolgen kann.
    HINWEIS: Halten Sie die Sichtscheibe des BSC geöffnet, um einen kontinuierlichen Luftstrom aufrechtzuerhalten.
  4. Aspirieren Sie nach 45 Minuten die verbliebene Fibronectin-Lösung von jeder Membran.
  5. Spülen Sie die Membranen vorsichtig mit 1 mL steriler PBS.

5. Aussäen von iBMDM-Zellen auf der PDMS-Membran

  1. Wenn die iBMDM-Zellen in einem T25-Fläschchen eine Konfluenz von 70–80 % erreicht haben, diese mit Trypsin behandeln, um sie von der Oberfläche zu lösen.
  2. Die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer bestimmen und eine Zelldichte von 100.000 Zellen/mL in Medium herstellen.
  3. Auf jede mit Fibronectin beschichtete PDMS-Membran 1 mL der hergestellten Zellsuspension pro Membran ausplattieren.
  4. Für jedes Experiment mindestens eine statische Membran und eine Peristaltik-Membran beimpfen, um einen parallelen Vergleich zwischen den Bedingungen zu gewährleisten.
  5. Die beimpften PDMS-Membranen für mindestens 24 Stunden in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 stellen, um die Zellanheftung unter statischen und peristaltischen Bedingungen zu ermöglichen (Supplementary Figure 1B).

6. Bioreaktor

  1. Stellen Sie den Bioreaktor mithilfe der in dem Bioreaktor-Patent (US12522795)40 bereitgestellten Konstruktionsunterlagen und Spezifikationen aus dem Bereich des computergestützten Designs (CAD) her, oder beziehen Sie eine vormontierte Einheit von den Autoren.

7. Zusammenbau und Kalibrierung der Arduino-Schaltung

  1. Schaltungsdesign
    1. Bauen Sie die Steuerschaltung auf einer Lochrasterplatine unter Verwendung von Potentiometern, Widerständen, Transistoren und leitfähigen Verbindungen wie gezeigt zusammen Zusatzmaterial Abbildung 2.
    2. Installieren Sie die Arduino-IDE auf dem Computer und öffnen Sie ein neues Sketch.
    3. Stellen Sie die Motordrehzahl auf 5 Umdrehungen pro Minute (RPM) und die peristaltische Pumpe auf 28 mL/min ein.
    4. Schließen Sie das Arduino-Board an den Computer an. über USB-Anschluss und Hochladen des bereitgestellten Codes in Zusatzdatei 1 über die Schaltfläche „Hochladen“ in der IDE.
      HINWEIS: Die Arduino-LED leuchtet während des Hochladens orange und kehrt danach wieder auf grün zurück, sobald sie bereit zum Ausführen ist. Nach Abschluss des Hochladevorgangs führt der Arduino das Programm automatisch aus, sobald er mit Strom versorgt wird.
  2. Motor-Kalibrierung
    1. Starten Sie den Motor und zählen Sie die Umdrehungen für 1 Minute mit einer Stoppuhr.
      HINWEIS: Passen Sie den Motordrehzahl-Parameter im Arduino-Code bei Bedarf so an, dass 5 U/min erreicht werden.
    2. Laden Sie den Code nach jeder Anpassung erneut hoch, bis die gewünschte Geschwindigkeit erreicht ist.
  3. Pumpenkalibrierung
    1. Pumpen Sie 30 s lang und messen Sie die gesammelte Masse, um eine Durchflussrate von 28 mL/min zu überprüfen (~14 g in 30 s)
    2. Stellen Sie den Potentiometer ein und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Ausgabe über 30 s hinweg konstant nahe bei 14 g liegt.
  4. Sobald sowohl der Motor als auch die Pumpe kalibriert sind, koppeln Sie sie mit einer Bioreaktoreinheit.
    HINWEIS: Die kalibrierte Motor–Pumpe–Bioreaktor-Anordnung ist nun bereit für den experimentellen EinsatzAbbildung 2).

Schema des Bioreaktors für das Makrophagen-Kultursystem; Abbildung und PCR-Analyse für die Zellstudieergebnisse
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Peristaltik-Bioreaktor-Anordnung und nachgeschalteten Analyse. iBMDM-Zellen werden auf einer mit Fibronectin beschichteten PDMS-Membran ausgesät, die im Inneren des Bioreaktors untergebracht ist. Nach einer 4-stündigen Exposition gegenüber Peristaltik oder als statische Kontrollen werden die Zellen für nachgeschaltete Analysen gewonnen, einschließlich qPCR, immunfluoreszenzbasierter Färbung und Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

8. Zusammenbau und Einrichtung des Peristaltik-Bioreaktors

  1. Vorbereitung der Komponenten
    1. Sammeln Sie alle erforderlichen Komponenten, darunter Medienflasche, Medienverschluss, 3D-gedruckten Medienflaschendeckel, 3D-gedruckten Bioreaktordeckel, 3D-gedruckten Bioreaktorboden, 3D-gedruckten Schneckenantrieb, Kabelbinder (drei pro Bioreaktor), Gelenkzange, Seitenschneider, 150-mm-Zellkulturschalen, Silikonfett und 3D-gedruckten Motorträger. Besprühen Sie jedes Teil mit 70 %igem Ethanol, bevor Sie es in den Sicherheitswerkbank (BSC) legen.
    2. Stellen Sie den Gleichstrommotor, die peristaltische Pumpe und eine zusätzliche Länge an Pumpschlauch in die BSC.
    3. Schließen Sie den BSC-Deckel und schalten Sie die UV-Lampe für 10 Minuten ein, um alle Komponenten zu sterilisieren (Supplementary Figure 1C).
  2. Überprüfung der Zelladhäsion und -viabilität
    1. Untersuchen Sie sowohl die besiedelten statischen als auch die Peristaltik-PDMS-Membranen unter dem Mikroskop. Bestätigen Sie eine Zelladhäsion von >80 % auf den mit Fibronectin beschichteten PDMS-Oberflächen und prüfen Sie die Zellmorphologie auf Lebensfähigkeit.
    2. Nehmen Sie bei Bedarf repräsentative Bilder der Zellen vor der Montage auf.
  3. Vorbereitung der statischen Kontrollen
    1. Aspirieren Sie 1 mL vollständiges RPMI-Medium von jeder statischen Membran.
    2. Geben Sie 1 mL frisches vollständiges RPMI-Medium auf jede Membran.
    3. Beschriften Sie die Schalen als „statisch“ und stellen Sie sie zurück in den Inkubator.
  4. Montage des Peristaltik-Bioreaktors
    1. Geben Sie 15 mL Medium in jede Medienflasche, die für den Bioreaktor vorgesehen ist.
    2. Befestigen Sie die Medienverschlüsse mit den 3D-gedruckten Flaschendeckeln (mit Ein- und Auslassöffnungen) an den Medienflaschen. Stellen Sie diese beiseite (Supplementary Figure 1D).
    3. Montieren Sie den Bioreaktorboden.
      1. Setzen Sie den 3D-gedruckten Schneckenantrieb in die zentrale Vertiefung des Bioreaktorbodens ein.
      2. Setzen Sie den Gleichstrommotor in den Motornut des Bioreaktorbodens ein.
      3. Stellen Sie sicher, dass die Motorwelle sicher in das zentrale Loch des 3D-gedruckten Schneckenantriebs eingreift.
      4. Schieben Sie den Motorträger in Position, um den Motor zu stabilisieren.
  5. Stellen Sie den teilweise montierten Bioreaktor in eine 150-mm-Zellkulturschale, um den Transport von der BSC zum Inkubator nach der Montage zu erleichtern (Supplementary Figure 1E).
  6. Tragen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf die Rillen des Schneckenantriebs auf, an denen die PDMS-Membran den Schneckenantrieb berühren wird. Dies ermöglicht eine leichte Drehung der Schnecke und verringert die Reibung.
  7. Beladen der mit Zellen besiedelten PDMS-Membran
    1. Überführen Sie die mit Zellen besiedelten Peristaltik-PDMS-Membranen vorsichtig vom Inkubator in die BSC.
    2. Aspirieren Sie das Medium von jeder Membran und legen Sie die Membran in den Bioreaktor, wobei die mit Zellen besiedelte Oberfläche nach oben zeigt, entgegengesetzt zur gefetteten Schneckenantriebsfläche.
    3. Positionieren Sie den Bioreaktordeckel so, dass die Vertiefung für die Zellkammer mit der PDMS-Membran ausgerichtet ist. Schieben Sie den Deckel in die Führungsrillen des Bioreaktorbodens.
  8. Befestigung des Bioreaktors
    1. Befestigen Sie den Bioreaktordeckel und -boden mit Kabelbindern und Seitenschneider.
    2. Schneiden Sie mit der Zange überschüssige Kabelbinderlänge ab.
  9. Fluidische Anschlüsse und Systemaufbau
    1. Richten Sie die peristaltische Pumpe so aus, dass ihr Metallanschluss in dieselbe Richtung wie der Motoranschluss zeigt.
    2. Verbinden Sie das Pumpschlauchende, das dem Bioreaktor am nächsten ist, mit dem Einlass nahe dem Motor am Bioreaktordeckel. Stecken Sie den Schlauch vollständig über die Einlassdüse.
    3. Tauchen Sie das gegenüberliegende Ende dieses Schlauchs in die Medienflasche ein.
    4. Verbinden Sie mit dem zusätzlichen Stück Pumpschlauch ein Ende mit der Auslassdüse des Bioreaktordeckels und führen Sie das andere Ende in die Medienflasche oberhalb des Mediums, um eine Rezirkulation ohne Rückfluss zu ermöglichen (Supplementary Figure 1F).
  10. Inkubation und Betrieb
    1. Stellen Sie die gesamte Bioreaktormontage (innerhalb der 150-mm-Schale) in den Inkubator (Supplementary Figure 1G) und lassen Sie die Platine/Arduino außerhalb, an die Stromversorgung angeschlossen.
    2. Verbinden Sie die Krokodilklemmen
      1. Pumpe: positiv zu positiv, negativ zu negativ.
      2. Motor: Polarität gemäß Schaltplan umkehren.
    3. Stellen Sie leere sterile Petrischalen in den Inkubator für die spätere Probenentnahme bereit.
    4. Lassen Sie das Peristaltik-Bioreaktorsystem 4 Stunden (oder die gewünschte Zeitdauer) unter Standardkulturbedingungen im Inkubator laufen (Supplementary Figure 1H).

9. Abbau des Bioreaktors

  1. Öffnen Sie den Inkubator und heben Sie das Zulaufrohr aus der Mediumflasche, um Luft in das System gelangen zu lassen und das restliche Medium vollständig aus dem Bioreaktor ablaufen zu lassen.
  2. Sobald der Mediumfluss gestoppt ist, trennen Sie die Motor- und/oder Pumpenkabel von der Leiterplatte, um die mechanische Bewegung zu beenden.
  3. Bewegen Sie die gesamte Bioreaktorbaugruppe in den Sicherheitswerkbank (BSC), entfernen Sie die Schläuche, durchtrennen Sie die Kabelbinder und nehmen Sie die Bioreaktorabdeckung ab.
  4. Aspirieren Sie das restliche Medium von der PDMS-Membran und überführen Sie die Membran zurück in die gleiche Petrischale, die während der Vorbereitung verwendet wurde.
  5. Überprüfen Sie die Zelladhärenz und -viabilität durch Beurteilung der Zellmorphometrie unter einem Zellkulturmikroskop und führen Sie anschließend je nach Bedarf weiterführende Analysen durch.

10. Nachfolgeanalyse

  1. Probensammlung für die qPCR
    1. Beschriften Sie im Sicherheitswerkbank (BSC) 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit Probenkennungen, einschließlich Zelltyp und experimenteller Bedingung.
    2. Überprüfen Sie unter dem Zellkulturmikroskop, ob die Zellen auf der PDMS-Membran sowohl unter statischen als auch unter Peristaltik-Bedingungen noch vorhanden sind.
    3. Aspirieren Sie das restliche Medium von jeder PDMS-Membran.
    4. Stellen Sie den RNA-Lysepuffer frisch her, indem Sie β-Mercaptoethanol in Buffer RLT im Verhältnis 1:100 zugeben.
    5. Geben Sie 370 µL Buffer RLT + β-Mercaptoethanol auf jede PDMS-Membran, um die Zellen zu lysieren.
    6. Verwenden Sie einen sterilen Zellabstreifer, um den beimpften Bereich der PDMS-Membran kräftig abzuschaben und alle Zellen abzulösen.
    7. Überführen Sie etwa 350 µL des Lysats in das entsprechende 1,5-mL-Röhrchen.
    8. Fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort oder lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
    9. Entkontaminieren Sie die Sicherheitswerkbank.
      HINWEIS: Buffer RLT und β-Mercaptoethanol müssen gemäß den jeweiligen Sicherheitsdatenblättern (SDS) behandelt und in den dafür vorgesehenen Abfallbehältern entsorgt werden.
  2. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Geben Sie 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) auf jede Membran und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.
    2. Aspirieren Sie das PFA und entsorgen Sie es im dafür vorgesehenen Gefahrstoffbehälter.
    3. Geben Sie 1 mL PBS auf jede Membran, um restliche Fixierungslösung zu entfernen.
    4. Fahren Sie mit der Immunfluoreszenz-Färbung gemäß dem für die Zielmarker geeigneten Protokoll fort.

11. Reinigung von Bioreaktoren und zugehörigen Komponenten

  1. Sprühen Sie alle Bioreaktorkomponenten, die mit Medium, Zellen oder PDMS-Membranen in Kontakt kommen, mit 70 %igem Ethanol ein, einschließlich der Einlass- und Auslassanschlüsse des Bioreaktors.
  2. Aspirieren Sie jegliches verbleibende Medium aus der Mediumflasche, spülen Sie das Innere durch großzügiges Einsprühen mit 70 %igem Ethanol aus und aspirieren Sie erneut.
  3. Entfernen Sie alle desinfizierten Komponenten aus dem Sicherheitswerkbank (BSC) und lagern Sie sie in einem dafür vorgesehenen sauberen Bereich.
  4. Für Mediumflaschen:
    1. Reinigen Sie diese mit 20 %iger Bleichlauge, schwenken Sie sie und entsorgen Sie den Inhalt bei laufendem Wasser in das Waschbecken.
    2. Schrubben Sie sie mit 1:10 verdünntem Essig, waschen Sie sie mit Seife und ultrareinem Wasser, spülen Sie anschließend mit 70 %igem Ethanol nach und lassen Sie sie kopfüber trocknen.
    3. Reinigen Sie die Verschlüsse der Mediumflaschen und die Pumpeneinsätze mit 70 %igem Ethanol.
  5. Reinigung der Peristaltikpumpen
    1. Stellen Sie 250 mL-Bechergläser bereit, gefüllt entweder mit (1) 70 %igem Ethanol, (2) ultrareinem Wasser oder (3) einem leeren Abfallbehälter.
    2. Verbinden Sie die Pumpe mit Schläuchen zu einem geschlossenen Durchflusssystem und schalten Sie sie über die Arduino-gesteuerte Platine ein.
    3. Lassen Sie die Pumpe 1 Minute lang mit 70 %igem Ethanol und anschließend 1 Minute lang mit ultrareinem Wasser laufen, um den Inhalt in das leere Abfallbecherglas auszuspülen.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll hatte zum Ziel, eine reproduzierbare Methode zur Bestimmung darzustellen, wie peristaltische mechanische Kräfte die Makrophagenaktivierung direkt modulieren. Vor den Bioreaktorexperimenten wurde bestätigt, dass iBMDMs angemessen auf standardmäßige biochemische Stimulationsbedingungen polarisieren. Gemäß diesem Protokoll wurden PDMS-Membranen mit Fibronectin beschichtet und mit iBMDMs besiedelt. Den Zellen wurde 24 h Zeit zur Adhäsion gegeben, bevor eine visuelle Inspektion erfolgte, um eine erfolgreiche ...

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Diskussion

Das aktuelle Verständnis darüber, wie peristaltische Kräfte die Funktion von Makrophagen beeinflussen, bleibt begrenzt, obwohl eine dysregulierte Peristaltik bei entzündlichen Erkrankungen häufig auftritt. Während einzelne mechanische Reize wie Scherkräfte und zyklische Dehnung bekanntermaßen die Aktivierung von Makrophagen modulieren, wurden die Wirkungen gleichzeitiger mehrachsiger Dehnung und Flüssigkeitsströmung, die zusammen die Peristaltik ausmachen, im Kontext der Mechanobiologie von Makrophagen bisher nicht umfas...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation, Förderkennziffer 2440798, finanziert. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit einer lizenzierten Version von BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTAFisher25200056
1,5-mL-MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5510
100 mm × 15 mm PetrischalenFisher50-190-0276
150-mm-KulturschalenFisherFB012925
4 % ParaformaldehydSanta Cruzsc-281692
90-mm-KulturschalenFisherFB012923
Alexa Fluor 488 Anti-F4/80-AntikörperAbcamab204266
Alexa Fluor 647 Anti-CD40-AntikörperAbcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
SteckplatineAmazon
Puffer RLTQiagen79216
ZellabstreiferFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
ExsikkatorMilliporeSigmaZ119008
SeitenschneiderAmazon
Fötales RinderserumInnovative Biosciences11-01-500
FibronectinMilliporeSigmaF1141-1MG
HEPES-PufferFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Motor RobotshopFT-SPARK16-360
PE Anti-Ym-1 + Ym-2-AntikörperAbcamab211621
Penicillin-StreptomycinFisher15140122
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