Methodenartikel

Dissizierung von Aedes albopictus und Gesamt-RNA-Extraktion aus Gewebeproben nach der Dissizierung

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DOI:

10.3791/72811

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30. Oktober 2026

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1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird eine Anleitung zur Isolierung des Mitteldarms, der Ovarien und der Speicheldrüsen von Aedes albopictus vorgestellt, gefolgt von der Extraktion der gesamten RNA zur molekularen Charakterisierung von Vektorgeweben in Studien zur Übertragung von durch Mücken übertragenen Viren.

Zusammenfassung

Im Juli 2025 trat in Foshan, Provinz Guangdong, China, ein Ausbruch von Dengue-Fieber und Chikungunya auf. Ae. albopictus ist ein wichtiger Vektor für diese Viren. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, standardisierte Methode zur Dissektion von Mitteldarm, Speicheldrüsen und Ovarien von Ae. albopictus sowie zur Extraktion der gesamten RNA aus den präparierten Geweben. Drei Tage alte, nicht blutmehlernährte weibliche Mücken wurden durch Einfrieren bei −20 °C für 2 min betäubt, woraufhin die Zielgewebe dissekiert wurden. Die gesamte RNA wurde mit einem Gewebe-RNA-Extraktionskit extrahiert, mittels Mikrovolumen-Spektrophotometer quantifiziert und für die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dissektionsmethode die Gewebe schnell und vollständig trennt und dass die aus den getrennten Geweben gewonnene RNA eine relativ hohe Reinheit erreichen kann. Die RT-qPCR zeigte die Expressionsmuster und relative Stabilität von drei Referenzgenen (GAPDH, β-actin und RPS6). Die Methode ist einfach, validiert und bietet standardisierte technische Unterstützung für die Forschung an Ae. albopictus.

Einleitung

Aedes albopictus (Ae. albopictus) ist ein Vektor für mehrere Krankheitserreger, darunter das Dengue-Virus (DENV) und das Chikungunya-Virus (CHIKV)1,2,3. Es ist weltweit verbreitet und hat in vielen Regionen Ausbrüche von durch Mücken übertragene Krankheiten verursacht4,5. Die Fähigkeit von Ae. albopictus, Krankheitserreger zu übertragen – bekannt als Vektorkompetenz – variiert zwischen Populationen und hängt mit der spezifischen Genexpression in Mitteldarm, Ovarien und Speicheldrüsen zusammen6. Das Verständnis der Struktur dieser Gewebe und die Gewinnung von hochwertiger RNA sind entscheidend, um die Vermehrung, Ausbreitung und Übertragung von vektorübertragenen Viren zu verstehen7.

Der Nachweis relativer Genexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR (Echtzeit-RT-PCR) hängt von der präzisen Dissektion der Gewebe von Ae. albopictus und der Isolierung von hochwertiger RNA8,9 ab. Bisherige publizierte Videoprotokolle zur Dissektion von Mitteldarm, Ovarien und Speicheldrüsen konzentrierten sich hauptsächlich auf Aedes aegypti10. Daher beschreibt dieses Protokoll die Dissektion von Mitteldarm, Ovarien und Speicheldrüsen von Ae. albopictus, wobei die präparierten Gewebe direkt in Zerkleinerungsröhrchen mit RNA-Konservierungslösung gegeben werden, um Übertragungsschritte zu vermeiden und Verluste bei der Übertragung zu minimieren. Die Gesamt-RNA wird aus den dissekierten Geweben mittels einer Säulen-basierten Methode isoliert, die weniger Handgriffe und weniger Zeit erfordert als die konventionelle TRIzol-Methode11. Diese Isolierung liefert typischerweise 0,1–0,3 µg Gesamt-RNA aus den Speicheldrüsen von fünf Ae. albopictus mit A260/A280-Verhältnissen von 1,8–2,0, was die Reinheitsanforderungen für nachfolgende Echtzeit-RT-PCR-Analysen erfüllt. Die Echtzeit-RT-PCR wird durchgeführt, um die Expression von drei Referenzgenen in verschiedenen Geweben von Ae. albopictus zu messen und somit die Qualität der aus jedem Gewebe isolierten RNA zu bewerten.

Es ist darauf hinzuweisen, dass dieses Protokoll nur für den Mitteldarm, die Ovarien und die Speicheldrüsen 3 Tage alter, nicht blutmehlernährter weiblicher Ae. albopictus validiert wurde und nicht für die RNA-Extraktion aus dem Fettkörper geeignet ist. Die Gewinnung intakter und einzelner Gewebe stellt die Grundlage für die anschließende Analyse dar. Durch die systematische Dissektion der Gewebe von Ae. albopictus und die Extraktion von hochwertiger RNA bietet dieses Protokoll technische Unterstützung für die nachfolgende Detektion der Genexpression, die Bewertung der vektoriellen Kompetenz auf Populationsebene sowie die Kontrolle der Arbovirus-Übertragung.

Protokoll

Diese Studie verwendete ausschließlich im Labor gezüchtete Ae. albopictus Mücken. Daher war für diese Studie keine institutionelle ethische Genehmigung erforderlich. Die Ae. albopictus Der in diesem Experiment verwendete Stamm wurde vom Schlüssellabor für die Kontrolle und Prävention parasitärer Krankheiten der Nationalen Gesundheitskommission Chinas (Jiangsu) bereitgestellt. Diese Kolonie wurde ursprünglich in den 1980er Jahren aus der Stadt Wuxi gesammelt und seither in der Insektenzuchtstätte gehalten. Jiangsu-Institut für Parasitäre Krankheiten unter Standardbedingungen. Die Mückenkolonie wurde in einer künstlichen Klimakammer bei 25 °C ± 1 °C, 75% ± 5 % relative Luftfeuchte und einem Licht-Dunkel-Wechsel von 10 Stunden Licht und 14 Stunden Dunkelheit. Die Larven wurden in ultrareinem Wasser gezüchtet und mit einer Mischung aus Schweineleberpulver und Hefeextrakt (Shanghai Brewery) im Verhältnis 2:1 gefüttert. Adulte Mücken wurden mit einer 5%igen Glucoselösung gehalten. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Zubereitung der Lösungen
    1. Herstellung eines 1x PBS-Puffers: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4und 0,24 g KH2PO4. In 800 mL ultrareinem Wasser unter Rühren lösen. Den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Auf ein Endvolumen von 1 L auffüllen. Bei 121 °C für 20 min.
    2. Zubereitung der DEPC-Lösung: 1 mL DEPC-Stammlösung zu 1 L ultrareinem Wasser geben. 12–16 h kräftig mit einem Magnetrührer rühren. Autoklavieren bei 121 °C für 20 min.
      ACHTUNG: DEPC ist hochtoxisch und krebserregend. Tragen Sie Handschuhe und Sicherheitsschutzbrille und arbeiten Sie im Abzug.
      HINWEIS: Den Becher während des starken Rührens mit Aluminiumfolie abdecken. DEPC-Lösung portionieren und bei -20 °C bis zu 6 Monate
  2. Herstellung von Verbrauchsmaterialien
    1. Sterilisieren Sie die Operationswerkzeuge: Geben Sie 1-mm-Operationsnadeln und feine Pinzetten in einen Aluminiumbehälter und autoklavieren Sie bei 121 °C für 20 min.
    2. Bereiten Sie 2 mL Mahlröhrchen mit 0,5–1,0 mm Silikakügelchen vor. Stellen Sie diese in einen Aluminiumbehälter und autoklavieren Sie bei 121 °C für 20 min.
    3. Hinzufügen 200 µL der vom Kit bereitgestellten RNA-Konservierungslösung zu jedem Zerkleinerungsrohr
      HINWEIS: Die RNA-Qualität in Geweben nimmt bereits innerhalb von 1 Minute nach Entnahme aus dem Organismus signifikant ab. Bereiten Sie Mahlröhrchen mit Konservierungslösung im Voraus vor.

2. Sammlung von Ae. albopictus

HINWEIS: Tragen Sie weiße Laborkittel und Handschuhe. Vermeiden Sie dunkle Kleidung, da dunkle Farben Mücken anziehen.

  1. Schließen Sie alle Türen, Fenster und Lüftungsanlagen in dem Raum mit dem Moskitokäfig, um die Flucht von Ae. albopictus zu verhindern.
  2. Schalten Sie den elektrischen Aspirator ein und führen Sie ihn in den Moskitokäfig ein. Richten Sie den Aspirator auf Ae. albopictus, die an den Innenwänden des Käfigs ruhen, und sammeln Sie die Mücken.
  3. Halten Sie den Aspirator in Betrieb, während Sie ihn langsam aus dem Käfig herausziehen. Verschließen Sie den Käfig unverzüglich und schließen Sie den Deckel des Aspirators.
  4. Entfernen Sie die Sammelkammer und stellen Sie sie zur Kälteimmobilisierung von Ae. albopictus für 2 min bei -20 °C.
  5. Stellen Sie eine 10 cm große Glaswanne auf Eis, um sie vorzukühlen. Überführen Sie die immobilisierten Ae. albopictus aus der Sammelkammer in die Glaswanne.
    HINWEIS: Die Dauer der Kälteimmobilisierung muss streng kontrolliert werden, um Gewebeschäden zu vermeiden.

3. Identifizierung weiblicher Ae. albopictus vor der Dissektion

  1. Wählen Sie morphologisch intakte, kalt-anaesthetisierte Ae. albopictus aus der Glaschale aus und übertragen Sie sie auf einen Objektträger. Untersuchen Sie sie unter einem Stereomikroskop bei 80-facher Vergrößerung.
  2. Identifizieren Sie den weißen Längsstreifen am Mesonotum.
  3. Bestätigen Sie die weißen Bänder an der Basis der Tarsenglieder und an der Basis der abdominalen Tergite II–VI12.
  4. Untersuchen Sie die Antennen bei 80-facher Vergrößerung. Unterscheiden Sie filiforme Antennen (Weibchen) von plumosen Antennen (Männchen), um die Weibchen zu identifizieren.

4. Bauchhöhlenpräparation von Ae. albopictus

  1. Geben Sie drei Tropfen sterilem 1x PBS von links nach rechts auf einen sterilisierten Objektträger, wobei jeder Tropfen ungefähr 20 µL im Volumen und etwa 5 mm voneinander beabstandet.
    HINWEIS: Die PBS-Tropfen sollten groß genug sein, um die gesamte Ae. albopictus.
  2. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Flügel zu fassen. Ae. albopictus und die Mücke in den am weitesten links liegenden PBS-Tropfen geben.
  3. Orientieren Sie Ae. albopictus mit der ventralen Seite nach oben. Halten Sie mit der linken Hand eine Präpariernadel und drücken Sie auf das zweite Bauchsegment, um die Ae. albopictus.
  4. Setzen Sie mit der rechten Hand eine 1 mm durchmessende Präpariernadel in der Mitte des sechsten Bauchsegments an. Führen Sie einen quer verlaufenden, halbkreisförmigen Schnitt durch, um die Bauchhöhle zu öffnen.
  5. Bewegen Sie die in der rechten Hand gehaltene Präpariernadel etwa 2 mm nach posterior und drücken Sie auf den mittleren Bereich der Bauchsegmente VI–VIII, um den Abdomen zu fixieren.
    HINWEIS: Die Ovarien befinden sich dorsal in den Bauchsegmenten II–VI. Bewegen Sie die Nadel nicht willkürlich, während Sie auf die Segmente VI–VIII drücken, um die intakte Morphologie der Ovarien nicht zu beschädigen.
  6. Verwenden Sie die linke Hand, um mit der Präparationsnadel das zweite abdominale Segment zu fassen und vorsichtig nach außen zu ziehen, um das Abdomen am sechsten Segment zu trennen. Während der Trennung werden Vorderdarm, Mitteldarm und Malpighische Tubuli vollständig freigelegt.
    HINWEIS: Die Malpigh'schen Tubuli sind weiß und schlank. Der Mitteldarm ist halbtransparent und spindelförmig.
  7. Trennen Sie den Mitteldarm vom Vorder- und Hinterdarm. Spülen Sie den Mitteldarm zweimal in dem zentralen PBS-Tropfen.
  8. Überführen Sie es in ein Zerkleinerungsrohr mit 200 µL der RNA-Konservierungslösung, die im kommerziellen RNA-Extraktionskit enthalten ist.
  9. Drücken Sie mit der Präpariernadel auf die Mitte des achten Bauchsegments, um die paarig angeordneten Ovarien auf beiden Seiten freizulegen. Entfernen Sie die Ovarien, spülen Sie sie zweimal in dem zentralen PBS-Tropfen aus und überführen Sie sie in ein Zerkleinerungsgefäß, das enthält 200 µL RNA-Konservierungslösung
    HINWEIS: Die paarigen Eierstöcke sind symmetrisch, reiskorngleich und milchig-weiß. Vorsichtig behandeln, um die strukturelle Integrität der Eierstöcke während der Entnahme zu gewährleisten.

5. Dissektion der Speicheldrüsen von Ae. albopictus

  1. Erhöhen Sie die Mikroskopvergrößerung auf 400x. Übertragen Sie das am Abdomen präparierte Ae. albopictus zum äußersten rechten PBS-Tropfen
  2. Üben Sie mit der linken Hand vorsichtig Druck auf das Mesothorax mit der Präpariernadel aus, bis der Kopf leicht angehoben ist.
  3. Heben Sie mit der rechten Hand den Kopf am Halsring mit der Präpariernadel an und ziehen Sie langsam nach außen. Beobachten Sie die Speicheldrüsen (dreilappige Struktur), während sie gemeinsam mit dem Kopf vom Thorax abgelöst werden.
    HINWEIS: Die Speicheldrüsen befinden sich im vorderen Thorax und sind mit dem Kopf verbunden. über der Speicheldrüsenkanal. Durch gleichmäßigen Druck auf das Thorax wird ein Reißen des Speicheldrüsenkanals verhindert, sodass die Speicheldrüsen zusammen mit dem Kopf vollständig vom Thorax abgelöst werden können. Die Kontrolle der Kraftanwendung erfordert wiederholte Übung.
  4. Trennen Sie die Speicheldrüsen vom Kopf. Spülen Sie sie zweimal in dem zentralen PBS-Tropfen und überführen Sie sie in ein vorbereitetes Zerkleinerungsrohr.
    HINWEIS: Speicheldrüsen sind etwa 1 mm groß. Überführen Sie sie in ein Zerkleinerungsgefäß, das enthält 200 µL RNA-Konservierungslösung und beobachten Sie gegen eine weiße Lichtquelle, um das Vorhandensein kleiner, weißer Partikel in der Lösung zu bestätigen.

6. RNA-Extraktion aus Ae. albopictus und dessen Speicheldrüsen, Ovarien und Mitteldarm

HINWEIS: Alle RNA-Extraktionsschritte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers für das kommerzielle RNA-Extraktionskit aus Gewebe ohne Modifikation durchgeführt.

  1. Kühlen Sie den Gewebemörser auf 4 °C vor. Stellen Sie die Parameter auf 30 Hz, 30 s Zerkleinerungszeit, 10 Zyklen und 8 s Pausenzeit ein.
  2. Platzieren Sie die Zerkleinerungsgefäße mit den Gewebeproben in den Mörser und führen Sie das Programm aus.
    ANMERKUNG: Überprüfen Sie nach der Zerkleinerung, ob das Gewebe vollständig in der RNA-Konservierungslösung dispergiert ist. Falls die Zerkleinerung unvollständig ist, führen Sie zusätzliche 5 Zyklen durch.
  3. Übertragen Sie das Homogenat in ein steriles 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 5 min bei 12.000 x g und 4 °C.
  4. Übertragen Sie den Überstand in ein neues steriles 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 30 µL Chloroform hinzu.
    ACHTUNG: Chloroform ist toxisch und krebserregend. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille und arbeiten Sie im Abzug.
  5. Vortexen Sie kräftig für 20 s. Inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur, dann zentrifugieren Sie 15 min bei 12.000 x g und 4 °C.
    ANMERKUNG: Aspirieren Sie vorsichtig die obere wässrige Phase, wobei die mittlere weiße Schicht vermieden werden sollte, um Proteinverunreinigungen zu verhindern.
  6. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues steriles 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 75 µL Isopropanol hinzu.
  7. Mischen Sie durch Inversion und übertragen Sie die gesamte Mischung auf eine Silica-Spin-Säule. Zentrifugieren Sie 1 min bei 12.000 x g.
  8. Geben Sie 600 µL Waschpuffer auf die Säule. Zentrifugieren Sie 30 s bei 12.000 x g. Entsorgen Sie den Durchlauf.
  9. Geben Sie 600 µL 80 % Ethanol auf die Säule. Zentrifugieren Sie 30 s bei 12.000 x g. Entsorgen Sie den Durchlauf. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, insgesamt also zwei Waschungen.
  10. Geben Sie 30 µL DEPC-Wasser in die Mitte der Säulenmembran. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur.
  11. Platzieren Sie die Säule in ein steriles 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 1 min bei 12.000 x g, um die RNA eluieren zu lassen.
  12. Entnehmen Sie 1 µL der eluierten RNA und messen Sie die Konzentration und Reinheit mithilfe eines Mikrovolumen-Spektrophotometers.

7. Reverse Transkription der RNA

  1. Vorbereitung des Reaktionssystems
    1. 4x Reverse Transkriptions-Mastermix, nukleasefreies Wasser und RNA-Template auf Eis auftauen lassen.
    2. In einem 200 µL PCR-Röhrchen ein 20 µL großes Reaktionssystem herstellen, indem 5 µL 4x Reverse Transkriptions-Mastermix, 10 µL Gesamt-RNA-Template und 5 µL nukleasefreies Wasser zugegeben werden.
    3. Kurz bei 1.000 x g für 1 min zentrifugieren, um die Reaktionsmischung am Röhrchenboden zu sammeln.
    4. Das PCR-Röhrchen in einen Thermocycler stellen und das Reverse-Transkriptions-Programm durchführen: 50 °C für 5 min; 85 °C für 5 s.
      HINWEIS: Das Produkt der reversen Transkription vor der Verwendung 20-fach verdünnen, um den Einfluss möglicher Inhibitoren auf die RT-qPCR zu verringern.

8. Echtzeit-quantitative PCR (Echtzeit-qPCR)

  1. Vorbereitung des RT-qPCR-Reaktionssystems
    1. 2x SYBR Green qPCR-Mastermix, cDNA-Vorlage sowie 10 µM vorwärts- und rückwärtsgerichtete Primer auf Eis auftauen, wobei die Proben während des gesamten Vorgangs vor Licht geschützt werden müssen.
    2. In einer 96-Loch-PCR-Platte je Loch ein 20 µL großes Reaktionssystem herstellen, indem 10 µL 2x SYBR Green qPCR-Mastermix, jeweils 0,8 µL 10 µM vorwärts- und rückwärtsgerichteter Primer (endgültige Konzentration 400 nM), 2 µL 20-fach verdünnte cDNA-Vorlage und 6,4 µL nukleasefreies Wasser zugegeben werden.
    3. Die 96-Loch-Platte mit einer optischen Klebefolie verschließen, wobei sichergestellt werden muss, dass alle Löcher vollständig versiegelt sind.
    4. Zentrifugieren bei 1.000 x g für 1 min, um die Reaktionsmischung am Boden der Löcher zu sammeln.
    5. Die PCR-Platte in ein Echtzeit-PCR-Erkennungssystem geben und das thermische Zyklenprogramm starten.
      HINWEIS: Thermisches Zyklenprogramm: Vor-Denaturierung bei 95 °C für 30 s (1 Zyklus); Amplifikation: 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s (40 Zyklen); Schmelzkurvenanalyse: 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min, Erhitzung auf 95 °C mit 0,15 °C/s. Jede RNA-Probe aus Gewebe wird im qPCR in vierfacher technischer Wiederholung analysiert. Jede Gewebeprobe besteht aus gepooltem Gewebe von 5 Ae. albopictus. Die für die RT-qPCR verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
  2. Datenanalyse
    1. Die Schmelzkurve jedes Primerpaares überprüfen, um einen einzigen, klar definierten Dissoziationspeak zu bestätigen.
    2. Die Ct-Werte aus der Gerätesoftware exportieren. Die Erstellung von Diagrammen und die Datenanalyse erfolgen mit statistischer und Diagrammsoftware.
Primer-NamenPrimersequenzen (5'-3')
Ae. albopictus β-actin Vorwärtsprimer GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus β-Actin Reverse PrimerTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus GAPDH-Forward-PrimerCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus GAPDH reverses PrimerTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus RPS6 VorwärtsprimerACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus RPS6 Reverse PrimerCTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

Tabelle 1: Primersequenzen von Ae. albopictus, die in der RT-qPCR verwendet wurden.

Ergebnisse

Diese Studie besteht aus zwei Teilen: der Dissektion von Ae. albopictus und der RNA-Extraktion aus den nach der Dissektion gewonnenen Geweben. Der gesamte Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt, wobei Abbildung 1A die Dissektion von Ae. albopictus veranschaulicht und Abbildung 1B die RNA-Extraktion sowie die anschließende Detektion der Expressionslevel von Referenzgenen zeigt.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Dissektion von Ae. albopictus und der Gesamt-RNA-Extraktion aus den nach der Dissektion gewonnenen Geweben. (A) Sammlung, Anästhesie und Dissektion von Ae. albopictus. (B) RNA-Extraktion aus den nach der Dissektion gewonnenen Geweben, Bestimmung der Reinheit und Nachweis der Expressionslevel von Referenzgenen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Fünf im Labor gezüchtete Ae. albopictus wurden seziert, um Mitteldarm, Speicheldrüsen und Eierstöcke zu isolieren. Bei einer Vergrößerung von 80× waren der durchsichtige Vorderdarm, Mitteldarm und Hinterdarm von Ae. albopictus deutlich sichtbar, wobei die körnigen Eierstöcke beidseits angeordnet und von den weißen Malpighianischen Tubuli bedeckt waren (Abbildung 2A). Bei einer Vergrößerung von 400× wurden die durchscheinenden Speicheldrüsen von Ae. albopictus klar erkennbar (Abbildung 2B). Abbildung 2C,D veranschaulichen die isolierten Mitteldarm- und Eierstockgewebe. Die Ergebnisse zeigten, dass die durch diese Dissektionsmethode isolierten Gewebe ihre strukturelle Integrität bewahrten, was für die anschließende Gesamt-RNA-Extraktion aus den postdissezierten Proben entscheidend ist.

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Abbildung 2: Nach der Dissektion durchgeführte Analyse der Gewebe von Ae. albopictus. (A) Gewebe werden aus dem Abdomen von Ae. albopictus isoliert. (B) Durchscheinende, dreilappige Speicheldrüsen von Ae. albopictus. (C) Vorderdarm und Mitteldarm von Ae. albopictus. (D) Reiskornförmige, paarig angeordnete Eierstöcke von Ae. albopictus. I: Vorderdarm; II: Mitteldarm; III: Hinterdarm; IV: Malpighische Tubuli; V: Eierstöcke. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Gesamt-RNA wurde aus dissezierten Geweben von Ae. albopictus extrahiert. Gewebeproben (Speicheldrüsen, Mitteldarm und Ovarien) wurden vor der Extraktion vollständig homogenisiert. Die RNA-Konzentrationen variierten je nach Gewebetyp: Speicheldrüsen wiesen 7,8 ng/µL auf, während Mitteldarm, Ovarien und Gesamtkörper-Homogenate weiblicher Ae. albopictus 55,3, 45,7 bzw. 42,7 ng/µL betrugen. Alle Proben zeigten eine hohe Reinheit mit A260/A280-Verhältnissen von 1,87–2,10 und A260/A230-Verhältnissen von 1,73–2,13 (Tabelle 2). Die Expressionslevel dreier Kandidaten-Referenzgene (GAPDH, β-actin und RPS6) wurden mittels RT-qPCR in allen Geweben analysiert. Obwohl ihre Expression etwas mit der RNA-Konzentration variierte, blieben alle drei Gene über verschiedene Gewebetypen hinweg relativ stabil (Abbildung 3). GAPDH, β-actin und RPS6 eignen sich als stabile Referenzgene zur Normalisierung der Genexpression in verschiedenen Geweben von Ae. albopictus.

GewebeAnzahl der ProbenRNA-Konzentration (ng/μL)A260/A280A260/A230
Speicheldrüse57,81,871,73
Mitteldarm555,31,941,98
Eierstock545,72,102,13
Weiblich142,72,041,92

Tabelle 2: RNA-Konzentration und -reinheit der aus Ae. albopictus-Gewebe extrahierten RNA.

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Abbildung 3: Ct-Werte der Referenzgene (GAPDH, β-Actin und RPS6), die mittels RT-qPCR detektiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Ae. albopictus ist in gemäßigten, subtropischen und tropischen Regionen auf allen Kontinenten mit Ausnahme der Antarktis weit verbreitet13,14. Als wichtiger Vektor für Arboviren wie das Dengue-Virus (DENV), das Zika-Virus (ZIKV) und das Chikungunya-Virus (CHIKV) hat es in Guangdong, China, immer wieder Ausbrüche von durch Mücken übertragenen Krankheiten verursacht15.

Um die Forschung zu Ae. albopictus-assoziierten Viren und deren Übertragung zu unterstützen, haben wir eine einfache Methode zur Dissektion von Ae. albopictus-Geweben entwickelt. Bei herkömmlichen Dissektionsprotokollen bleiben die Speicheldrüsen nach Trennung des Kopfes vom Thorax je nach ausgeübter Kraft entweder am Thorax oder am Kopf haften; da die Speicheldrüsen nur etwa 1 mm groß sind, ist ihre Lokalisierung innerhalb des Thorax schwierig16. Diese Methode baut auf standardmäßigen Protokollen zur Isolierung von Mückenorganen auf und optimiert die Trennung der Speicheldrüsen unterhalb der Prosternal- und Mesosternalsterniten, die unter 400×-Vergrößerung beobachtet werden sollten17. Zur Durchführung der Dissektion wird der Mesothorax mit einer Nadel leicht gedrückt, während mit einer zweiten Nadel ein Druck erzeugt wird, der den Kopf löst, wodurch die Speicheldrüsen intakt abgetrennt werden. Dieser Ansatz vermeidet die Notwendigkeit, die Speicheldrüsen im Thorax zu suchen, verhindert Kontamination und Beschädigung der Drüsen und verkürzt die gesamte Dissektionszeit. Die Eierstöcke befinden sich in der Nähe der abdominalen Segmente VI–VIII und werden geschont, indem die Dissektion am sechsten abdominalen Segment begonnen und Darm, Malpighiesche Tubuli und Eierstöcke vorsichtig aus dem Abdomen extrahiert werden18. Diese Methode liefert intakte Speicheldrüsen, typische Eierstockformen ohne Adhäsionen sowie einen unversehrten Mitteldarm (Abbildung 2). Diese Dissektionstechnik bietet wertvolle Anleitung für Studien zu Ae. albopictus sowie zur Replikation, Ausbreitung und Übertragung von vektorübertragenen Viren.

Die RNA-Extraktion aus Ae. albopictus-Geweben ist entscheidend für den Nachweis von mückenübertragenen Viren. Die herkömmliche TRIzol-Methode ist zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll, liefert jedoch bei korrekter Durchführung typischerweise hohe RNA-Ausbeuten und qualitativ hochwertige RNA. Im Gegensatz dazu bietet die spaltenbasierte Methode eine bessere Reproduzierbarkeit und ist einfacher durchzuführen, kann aber zu einer geringeren RNA-Rückgewinnung führen und arbeitet ineffizient, wenn sie auf das Fettkörpergewebe angewendet wird19,20. In dieser Studie wurden die präparierten Gewebe umgehend in einem Nukleinsäure-Stabilisator aufbewahrt, gründlich homogenisiert und mittels der Spin-Säulen-Methode zur RNA-Extraktion für die cDNA-Synthese verarbeitet21. Um eine genaue Normalisierung der RT-qPCR-Daten trotz Variationen in der cDNA-Qualität sicherzustellen, sind stabile Referenzgene erforderlich22. Während Referenzgene für verschiedene Entwicklungsstadien von Ae. albopictus bereits etabliert sind, müssen gewebespezifische Referenzgene weiter validiert werden23,24. Die RT-qPCR-Analyse der revers transkribierten RNA aus allen präparierten Geweben ergab eine konsistente Amplifikation von GAPDH, β-actin und RPS6, was bestätigt, dass die durch dieses Präparationsprotokoll erzielte RNA-Qualität ausreicht, um anschließende gewebespezifische Genexpressionsstudien bei Ae. albopictus zu unterstützen.

Während der Dissektion von Ae. albopictus-Geweben nach diesem Protokoll kann es gelegentlich vorkommen, dass die Speicheldrüsen nicht gemeinsam mit dem Kopf abgelöst werden. Dies resultiert gewöhnlich aus unzureichendem Druck auf das Thorax in Kombination mit einer zu schnellen Trennung des Kopfes. Um dies zu beheben, üben Sie gleichmäßigen Druck auf das Mesothorax aus und ziehen den Kopf langsam nach außen, sodass die Speicheldrüsen intakt zusammen mit dem Kopf abgelöst werden. Wenn Sie die Speicheldrüsen in ein Zerkleinerungsrohr mit RNA-Konservierungslösung überführen, untersuchen Sie die Lösung sorgfältig gegen eine Lichtquelle auf kleine, schwimmende weiße Partikel. Falls die Speicheldrüsen im Rohr nicht auffindbar sind, überprüfen Sie unverzüglich, ob sie noch an der Dissektionsnadel haften. Befolgen Sie während der RNA-Extraktion streng die Anleitung des Kit-Herstellers. Falls die erhaltene RNA-Konzentration niedrig ist, kann eine zweite Elution mit dem Elutionspuffer durchgeführt werden. Bei der RT-qPCR können mehrere Peaks in der Schmelzkurve auftreten; überprüfen Sie in diesem Fall zunächst die Primer-Spezifität. Falls die Ct-Werte hoch sind, passen Sie die Annealing-Temperatur des Programms gemäß der Schmelztemperatur der Primer an. Im Allgemeinen sollte die Annealing-Temperatur im Programm 1–2 °C unterhalb der Schmelztemperatur der Primer liegen25.

Diese Studie weist einige Einschränkungen auf. Der Stichprobenumfang ist relativ eng gefasst, da ausschließlich Mitteldarm, Speicheldrüsen und Ovarialgewebe untersucht wurden, während andere Gewebe wie die Malpighi’schen Tubuli und der Fettkörper nicht einbezogen wurden26. Zudem beschränkte sich die Analyse auf drei Tage alte, im Labor gezüchtete weibliche Mücken, wobei blutgefütterte und virusinfizierte Individuen ausgeschlossen wurden27. Zukünftige Verbesserungen sollten die Erweiterung des Stichprobenumfangs auf Gewebe wie die Malpighi’schen Tubuli sowie die Einbeziehung von Ae. albopictus-Individuen in verschiedenen physiologischen Zuständen umfassen.

Zusammenfassend bietet die Dissektion des Mitteldarms, der Ovarien und der Speicheldrüsen von Ae. albopictus sowie die anschließende Extraktion der Gesamt-RNA eine technische Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Vektorfähigkeit und zur Übertragung von Arboviren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3 mL extra-lange Pasteur-PipetteWHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 Reaktionen
HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix für qPCR-KitVazymeR433-01100 Reaktionen
Micro Total RNA ExtraktionskitMedTechMDT-CFR07100 T/Box
Mikro-Pipetten 0,5–10μLEppendorf4043444
Mikroskop-ObjektträgerCITOTEST80302-210475 mm×25 mm
MikrospektrophotometerKAIAOK5600C
Puffer für die Nukleinsäure-ExtraktionMedTechMDT-TP01100 mL
PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (steril)ServicebioG4202500 mL
PCR-ThermocyclerEppendorfMastercycler X50s
QuantStudioTM 7 Pro Echtzeit-PCR-SystemApplied biosystemsEN61326-1
Stemi 305 LAB-Mikroskop-SetZEISS435063-9010-000

Referenzen

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