Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Zelluläre Modelle zur Untersuchung der Alexander-Krankheit: Funktionelle Analyse primärer Ratten-Astrozyten

108 Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/72930

⸱

8. September 2026

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University, 2School of Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir entwickeln ein primäres Ratten-Astrozyten-Modell, das ein physiologisch relevantes System zur Untersuchung der Alexander-Krankheit (AxD) bereitstellt und die Untersuchung der GFAP-Aggregation, pathologischen Modifikation sowie der Astrozyten-Dysfunktion ermöglicht. Dieses System schließt die Lücke zwischen in vitro- und in vivo-Studien und bietet eine robuste Plattform, um die Pathologie der AxD zu erforschen und therapeutische Zielstrukturen für neurodegenerative Erkrankungen zu identifizieren.

Zusammenfassung

Astrozyten spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des zentralen Nervensystems, der Unterstützung der neuronalen Funktion und der Reaktion auf Verletzungen oder Erkrankungen. Eine Dysfunktion der Astrozytenaktivität wird zunehmend als wesentlicher Faktor bei neurodegenerativen Erkrankungen erkannt, darunter die Alexander-Krankheit (AxD), eine seltene und tödliche Erkrankung, die durch Mutationen im glialen fibrillären sauren Protein (GFAP) verursacht wird. Diese Mutationen führen zur Aggregation von GFAP, zur Bildung von Rosenthal-Fasern und zu einem fortschreitenden Funktionsverlust der Astrozyten. Während in vivo-Tiermodelle eine komplexe zelluläre Umgebung bieten, weisen sowohl bestehende in vitro- als auch in vivo-Modelle Einschränkungen hinsichtlich der genauen Nachbildung des komplexen zellulären Kontexts und der Funktionen von Astrozyten auf. Um dies zu beheben, haben wir ein zelluläres Modell entwickelt, das primäre Rattenastrozyten aus Wildtyp- (WT-) und AxD-Modellratten verwendet, um die funktionellen Auswirkungen von GFAP-Mutationen zu untersuchen. Dieses physiologisch relevante System ermöglicht eine detaillierte Untersuchung astrozytenspezifischer Mechanismen, einschließlich der GFAP-Aggregation, der Reaktionen auf oxidativen Stress und pathologischer Modifikationen. Für Forscher, die keinen Zugang zu AxD-Modellratten haben, bietet die lentivirale Transduktion eine alternative Methode, um AxD-assoziierte GFAP-Mutationen in Astrozyten normaler Ratten einzubringen und erweitert damit die Anwendbarkeit dieses Ansatzes. Im Vergleich zu immortalisierten Astrozytenzelllinien oder in vitro-Studien mit rekombinanten Proteinen bewahren primäre Astrozyten die native zelluläre Architektur und molekularen Profile besser auf und bieten eine robuste Plattform zur Untersuchung der Dynamik und Löslichkeit von GFAP sowie der astrozytären Reaktionen auf Stressfaktoren wie oxidativen Schaden und pathologische Modifikationen. Dieses zelluläre Modell schließt die Lücke zwischen molekularen und systemischen Studien und bietet ein kontrolliertes experimentelles Framework, um die Astrozytendysfunktion bei AxD zu erforschen. Durch die Ergänzung bestehender Methoden verbessern Kulturen primärer Astrozyten unser Verständnis der AxD-Pathologie und stellen ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Zielstrukturen bei neurodegenerativen Erkrankungen dar.

Einleitung

Astrozyten sind spezialisierte Gliazellen, die das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS) durchziehen und entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gehirn-Homeostase, der Regulierung neuronaler Aktivität sowie der Reaktion auf Verletzungen oder Erkrankungen spielen1. Zu ihren Funktionen gehören die Entfernung und der Wiederkreislauf von Neurotransmittern, die Homöostase von extrazellulären Ionen und Wasser sowie die Unterstützung der Funktion neuronaler Schaltkreise. Von Astrozyten sezernierte Moleküle sind für die Synapsenentwicklung und die synaptische Plastizität im erwachsenen Gehirn unerlässlich2. Als Reaktion auf eine ZNS-Verletzung oder -Erkrankung durchlaufen Astrozyten reaktive Veränderungen, die entweder pro- oder antiinflammatorische Signalwege vermitteln können, wodurch neuroprotektive Funktionen ermöglicht werden, je nach Kontext aber auch zu ZNS-Pathologien beitragen können3. Eine Fehlregulation der Astrozytenfunktion wird zunehmend als entscheidender Faktor für die Gesundheit und Erkrankung des ZNS anerkannt4,5.

Das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP), ein Protein des Typ-III-Zwischenfilaments (IF), ist eine wichtige zytoskelettale Komponente von Astrozyten und wird von den meisten, aber nicht allen Astrozyten exprimiert. GFAP wird als Reaktion auf Verletzungen des zentralen Nervensystems hochreguliert und dient als Marker für das Ausmaß der Gewebeschädigung6. Obwohl GFAP traditionell mit strukturellen Funktionen assoziiert wird7, sind seine funktionellen Bedeutungen noch wenig erforscht. Mutationen im GFAP-Gen verursachen die Alexander-Krankheit (AxD)8, eine seltene neurodegenerative Erkrankung, die durch GFAP-Aggregation, Bildung von Rosenthal-Fasern und einen fortschreitenden Funktionsverlust der Astrozyten gekennzeichnet ist. Obwohl in vitro-biochemische Untersuchungen9,10,11 und in vivo-Tiermodelle12,13 Einblicke in die Pathologie der AxD ermöglicht haben, erfassen sie nicht den komplexen zellulären Kontext der Astrozytenfunktion14.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein zelluläres Modell entwickelt, das primäre Rattenastrozyten aus Wildtyp- (WT) und AxD-Modellratten verwendet13. Dieses System erhält die native zelluläre Architektur und molekularen Profile der Astrozyten bei und ermöglicht die Untersuchung von GFAP-Aggregation, oxidativen Stressantworten und pathologischen Veränderungen, die mit AxD assoziiert sind. Für Forscher, die keinen Zugang zu AxD-Modellratten haben, bietet die lentivirale Transduktion eine alternative Methode, um AxD-assoziierte GFAP-Mutationen in Astrozyten aus normalen Ratten einzubringen10.

Im Vergleich zu immortalisierten Zelllinien bewahren primäre Astrozyten die Heterogenität und Komplexität der Astrozytenpopulationen in vivo und bieten eine physiologisch relevante Plattform zur Untersuchung astrozytenspezifischer Mechanismen15. Im Gegensatz zu in vitro-Studien mit rekombinanten Proteinen9 exprimieren primäre Astrozyten natürlicherweise GFAP und andere astrozytenspezifische Marker, wodurch die Untersuchung krankheitsassoziierter Varianten in einem nativen zellulären Umfeld ermöglicht wird10,16,17. Darüber hinaus ermöglichen primäre Astrozyten die Untersuchung funktioneller Antworten auf Stressreize wie oxidativen Schaden18 und Entzündungen19, die in vereinfachten in vitro-Systemen schwer nachzubilden sind.

In der AxD-Forschung ergänzen primäre Astrozyten biochemische und in vivo-Ansätze, indem sie eine Brücke zwischen molekularen und systemischen Studien schlagen. Während biochemische Assays auf die molekularen Eigenschaften von GFAP-Mutationen fokussieren, fehlt ihnen die zelluläre Komplexität; in vivo-Modelle hingegen erfassen systemische Effekte, eignen sich aber weniger für mechanistische zelluläre Untersuchungen. Primäre Astrozyten stellen ein Zwischensystem dar, das sowohl zelluläre Komplexität als auch experimentelle Kontrolle bietet und damit aktuellen Entwicklungen in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen entspricht, die zelluläre Modelle betonen, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren20.

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung primärer Rattenastrozyten als zelluläres Modell für die AxD-Forschung. Durch die direkte Vergleichbarkeit zwischen WT- und AxD-Astrozyten behebt dieser Ansatz wesentliche Einschränkungen alternativer Methoden und erhöht die Zugänglichkeit mittels lentiviraler Transduktion. Diese Ergebnisse tragen zu einem tieferen Verständnis der Astrozytenfunktionsstörung bei AxD bei und stellen ein wertvolles Werkzeug für die Voranbringung therapeutischer Entdeckungen bei neurodegenerativen Erkrankungen dar.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des College of Life Sciences and Medicine der Nationalen Tsing Hua-Universität (NTHU IACUC Genehmigungsnummer 109088 und 111060) genehmigt und entsprechen den Richtlinien des Agriculture Guidebook für die Pflege und Verwendung von Labor­tieren.

1. Herstellung von Medien, Deckgläsern, Schalen und Platten 

  1. Stellen Sie vor Beginn sicher, dass die folgenden Lösungen (Tabelle 1) vorbereitet und gebrauchsfertig sind.
  2. Sterilisieren Sie die Schere und Pinzette vor Gebrauch im Autoklaven, um Sterilität zu gewährleisten.
  3. Bereiten Sie eine Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung mit einer Konzentration von 0,02 mg/mL in Borsäurepuffer vor.
  4. Geben Sie ausreichend PLL-Lösung hinzu, um die Oberfläche des Deckgläschens oder den Boden der Kulturschale/-platte vollständig zu bedecken. Achten Sie darauf, dass die Beschichtung gleichmäßig ist.
  5. Lassen Sie die mit PLL beschichteten Deckgläser und Schalen über Nacht bei Raumtemperatur im laminaren Luftstromgehäuse inkubieren.  
  6. Am nächsten Tag entfernen Sie vorsichtig die PLL-Lösung. Spülen Sie die beschichteten Deckgläser oder die Schale/Platte dreimal mit frischem sterilen Wasser, um restliches PLL zu entfernen.
    HINWEIS: Es ist entscheidend, die mit PLL beschichteten Kolben/Platten oder Deckgläser gründlich zu spülen, um verbliebenes PLL zu entfernen, das die Zellviabilität negativ beeinflussen könnte. 

2. Herstellung einer primären Astrozytenkultur

HINWEIS: Eine schematische Übersicht ist in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Nach der Einleitung der Hypothermie durch Platzieren der Welpen auf Eis, den postnatalen Tag 1–3 alten Rattenwelpen enthaupten und den Kopf vom Körper trennen.
  2. Den Kopf in eine 60-mm-Schale legen und die Seiten mit einer Pinzette fixieren. Mit feinen Scheren vorsichtig die Haut an der Oberseite des Kopfes dissezieren.
  3. Mit feinen Scheren einen Schnitt am Scheitelpunkt des Kopfes machen, um den Schädel vorsichtig zu öffnen. Die beiden Schädelflächen vorsichtig trennen und entfernen.
  4. Das Gehirn mit der Pinzette an der Basis abklemmen und in eine 60-mm-Schale mit Dissektionsmedium überführen.
  5. Jede Hemisphäre so platzieren, dass die mediale Fläche nach oben zeigt, um die mittige Struktur freizulegen.
  6. Unter einem Dissektionsmikroskop vorsichtig das Mittelhirn und das Hirnstammgewebe entfernen, wobei die Hemisphären mit Kortex und Hippocampus intakt bleiben.
  7. Mit feiner Pinzette die Hirnhäute vorsichtig abziehen, idealerweise als ein einziges Stück. Sorgfältig auf verbliebene Hirnhäute in den Fissuren prüfen und diese vollständig entfernen.
  8. Das dissezierte Gehirngewebe in einen laminaren Flussabzug bringen. Das Dissektionsmedium mit einer 1-mL-Pipette absaugen und frisches Dissektionsmedium hinzufügen.
  9. Das Gewebe mit einer sterilen Skalpellklinge fein zerkleinern.
  10. Das zerkleinerte Gewebe in 5 mL Dissoziationsmedium in einem 15-mL-Röhrchen überführen. Das Röhrchen 15 min im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren, dabei alle 5 min vorsichtig schütteln, um eine optimale Enzym-Gewebe-Interaktion sicherzustellen.
  11. Nach der Inkubation das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen lassen. Den Überstand absaugen und 5 mL frisches Dissektionsmedium hinzufügen.
  12. Das Röhrchen fünfmal umdrehen, um das Gewebe zu waschen. 3 min stehen lassen, damit sich das Gewebe absetzen kann, dann den Waschvorgang dreimal mit frischem Dissektionsmedium wiederholen.
  13. Nach dem letzten Waschgang den Überstand entfernen und 2,5 mL Dissektionsmedium sowie 2,5 mL Erhaltungsmedium hinzufügen.
  14. Das Gewebe durch 10–15-maliges Auf- und Abpipettieren mit einer 10-mL-Pipette trituriert.
  15. Das Röhrchen 3 min stehen lassen, damit sich das Gewebe absetzen kann. Den Überstand (mit den Zellen) in ein neues 50-mL-Konusröhrchen überführen.
  16. 5 mL MEM-Medium in das ursprüngliche Röhrchen mit dem abgesetzten Gewebe geben. Weitere 10–15 Mal mit einer 10-mL-Pipette trituriert, bis die meisten Gewebestücke verschwunden sind.
  17. Die Zellsuspension durch ein steriles 40-µm-Zellsieb in ein sauberes 50-mL-Konusröhrchen mit 5 mL Erhaltungsmedium filtrieren.
  18. Die gefilterte Zellsuspension 5 min bei Raumtemperatur mit 200 × g zentrifugieren.
  19. Den Überstand entfernen und das Zellpellet durch leichtes Antippen des Röhrchens vorsichtig lösen. 
  20. 5 mL MEM-Medium hinzufügen und 10 Mal auf- und abpipettieren, um das Pellet erneut aufzuschwemmen. Die Zellsuspension während der Zellzählung im 37 °C warmen Wasserbad aufbewahren.
  21. 10 μL der Zellsuspension mit 90 μL MEM-Medium verdünnen. Gut mischen mit einer 200-μL-Pipettenspitze.
  22. 20 μL der verdünnten Zellsuspension mit 20 μL Trypanblau mischen. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
  23. Die Zellen wie folgt in Kulturgefäßen ansäen: für eine 24-Loch-Platte 2 × 10⁵ Zellen pro Loch; für eine 6-Loch-Platte 5 × 10⁵ Zellen pro Loch; für eine 6-cm-Schale 1 × 10⁶ Zellen pro Schale.
  24. Die Platten oder Schalen in einen Zellkultur-Inkubator stellen. Vermeiden Sie, dass die Zellen über längere Zeit bei Raumtemperatur verbleiben.
  25. Die Zellen unter dem Mikroskop untersuchen, um sicherzustellen, dass sie 4 h nach der Aussaat am Substrat angeheftet sind.
  26. 24 h nach der Aussaat das Kulturmedium durch frisches Erhaltungsmedium ersetzen.
  27. Die Kultur alle 2–3 Tage füttern, indem die Hälfte des Mediums durch frisches Erhaltungsmedium ersetzt wird.
  28. Nach 7 Tagen sollten die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben und für Experimente bereit sein.
    ANMERKUNG: Um optimale Bedingungen für Astrozytenkulturen sicherzustellen, sollten alle Schritte in steriler Umgebung, vorzugsweise im laminaren Flussabzug, durchgeführt werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Außerdem sicherstellen, dass alle Reagenzien, wo erforderlich, auf 37 °C vorgewärmt sind. Bei der Entfernung der Hirnhäute äußerst sorgfältig vorgehen, da verbliebenes Meningealgewebe die Kulturen beeinträchtigen kann. Ferner vermeiden, dass die Zellen während der Aussaat und Zählung über längere Zeit bei Raumtemperatur verbleiben, um die Zellviabilität und Integrität zu erhalten.

3. Herstellung von lentiviralen Partikeln und Transduktion 

HINWEIS: Eine schematische Übersicht ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. HEK293T-Zellen in einer 10 cm2 Petrischale mit frischem Kulturmedium säen (Tabelle 1).
  2. Die Zellen über Nacht in einem 37 °C-Inkubator wachsen lassen, bis sie eine Konfluenz von 50 %–60 % erreichen.
  3. In 1 mL Opti-MEM 20 µg Lentivirus-Plasmid, das GFAP oder seine Varianten kodiert, 5,6 µg Verpackungsvektor und 1,8 µg Hüllvektor hinzufügen. 
  4. 45 µL Transfektionsreagenz zur DNA-haltigen Lösung hinzufügen.
  5. Vorsichtig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Die Transfektionslösung direkt zu den HEK293T-Zellen geben und 4 Stunden im Zellkulturinkubator bei 37 °C inkubieren.
  7. Die Transfektionslösung vorsichtig abpipettieren und durch frisches Kulturmedium ersetzen.  
  8. Die Zellen weitere 2 Tage kultivieren.
  9. Das Zellkulturüberstandmedium sammeln und durch frisches Kulturmedium ersetzen.
  10. Am nächsten Tag das Zellkulturüberstandmedium erneut sammeln und durch frisches Kulturmedium ersetzen.
  11. Am folgenden Tag das endgültige Zellkulturüberstandmedium sammeln.
  12. Die Überstände aus den Schritten 3.9–3.11 in einem 50-mL-Konischglas vereinigen.
  13. Den vereinigten Überstand mithilfe einer 60-mL-Spritze durch einen 0,45-µm-Filter filtrieren, um Partikelrückstände zu entfernen.  
  14. Den filtrierten Überstand 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 1.400 × g zentrifugieren, um tote Zellen zu entfernen.
  15. Den geklärten Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen überführen.
  16. 70 Minuten bei 4 °C mit 100.000 × g zentrifugieren, um die Lentivirus-Partikel zu pelletieren.
  17. Den Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören.
  18. Das Pellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren in 600 µL Opti-MEM resuspendieren.
  19. Die resuspendierten Lentivirus-Partikel in 50-µL-Aliquote aufteilen und bei -80 °C lagern, bis sie benötigt werden. 
  20. Primäre Astrozyten in einer 6-Well-Platte ansäen und sie bis zu einer Konfluenz von 50 %–70 % wachsen lassen (Abschnitt 2).
  21. Die benötigte Menge an Lentivirus-Partikeln auf Eis auftauen.
  22. 50 µL Lentivirus-Partikel pro Vertiefung zugeben, ergänzt mit 8 µg/mL Polybrene.
  23. Die Platte vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung des Virus und von Polybrene sicherzustellen. Die Zellen 4–8 Stunden im Zellkulturinkubator bei 37 °C inkubieren.
  24. Das virushaltige Medium vorsichtig abpipettieren, um die Zellen nicht zu stören.
  25. Das Medium durch frisches Kulturmedium ersetzen und die Zellen weitere 2–3 Tage kultivieren.
  26. Downstream-Analysen an den transduzierten Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der Bildung des Intermediärfilamentnetzwerks oder mittels Immunoblotting zur Beurteilung der GFAP-Expression durchführen.
    HINWEIS: Bei der Handhabung von Lentivirus-Partikeln ist es entscheidend, geeignete persönliche Schutzausrüstung (PPE) zu verwenden, um die Sicherheit zu gewährleisten. Um die Integrität der Viruspartikel zu erhalten, sollten wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen vermieden werden.

4. Immunfluoreszenzmikroskopie 

  1. Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium aus den Vertiefungen mit Deckgläsern und angesiedelten Zellen. Vermeiden Sie es, die Zellen zu stören.
  2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie eine der folgenden Fixierungslösungen hinzufügen: Für primäre Astrozyten verwenden Sie 3,2 % (Gew/Vol) Paraformaldehyd; für Astrozyten-Neuronen-Kulturen verwenden Sie 3,2 % (Gew/Vol) Paraformaldehyd und 4 % (Gew/Vol) Saccharose.
  3. Incubieren Sie die Deckgläser in der Fixierungslösung 15 min bei Raumtemperatur. Sofern nicht anders angegeben, führen Sie alle nachfolgenden Schritte bei Raumtemperatur durch. 
  4. Spülen Sie die fixierten Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um die Fixierungslösung zu entfernen.
  5. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie sie 15 min in 0,2 % (Vol/Vol) Triton X-100, hergestellt in Blockierpuffer (5 % (Vol/Vol) normales Ziegenserum in PBS), inkubieren. 
  6. Spülen Sie die permeabilisierten Zellen dreimal mit PBS aus.
  7. Bereiten Sie die Primärantikörperlösung vor, indem Sie den Antikörper gemäß der vom Hersteller empfohlenen Konzentration im Blockierpuffer verdünnen.
  8. Incubieren Sie die Deckgläser mindestens 1 h bei Raumtemperatur in der Primärantikörperlösung.
  9. Spülen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS aus, um nicht gebundenen Primärantikörper zu entfernen.
  10. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie die mit Fluorophoren konjugierten Sekundärantikörper (Ziege anti-Maus und Ziege anti-Kaninchen) im Blockierpuffer in einem Verdünnungsverhältnis von 1:500 verdünnen.  
  11. Incubieren Sie die Deckgläser 1 h bei Raumtemperatur in der Sekundärantikörperlösung.
  12. Spülen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS aus, um nicht gebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.
  13. Übertragen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer Pinzette auf Objektträger.
  14. Fixieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedium, um die Fluoreszenz zu erhalten.
  15. Dichten Sie die Ränder des Deckglases vorsichtig mit farblosem Nagellack ab, um Bewegungen und Verdunstung zu verhindern.
  16. Lassen Sie den Nagellack vollständig trocknen, bevor Sie mit der Bildaufnahme fortfahren.
  17. Die vorbereiteten Objektträger sind bereit für die Bildaufnahme mittels Immunfluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie.
    HINWEIS: Um den Erfolg der Experimente sicherzustellen, bereiten Sie alle Reagenzien wie PBS, Blockierpuffer und Antikörper frisch zu und halten Sie Sterilität ein. Handhaben Sie die Deckgläser sorgfältig, um die Zellen nicht zu beschädigen oder die Glasoberfläche zu zerkratzen. Schützen Sie die Proben vor Licht während der Antikörperinkubation und nach dem Eindecken, um eine Photobleiche der fluoreszierenden Signale zu verhindern. Optimieren Sie außerdem die Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten entsprechend dem spezifischen experimentellen Aufbau.

5. Immunoblotting

  1. Spülen Sie die Astrozyten zweimal mit PBS, um restliches Medium und Ablagerungen zu entfernen.
  2. Stellen Sie die Platte oder Schale auf Eis, um den Proteinabbau zu minimieren. Arbeiten Sie jeweils eine Vertiefung ab und aspirieren Sie den PBS vollständig.
  3. Geben Sie eiskalte Radioimmunpräzipitationspuffer (RIPA-Puffer) mit Protease- und Phosphataseinhibitoren hinzu. Für eine 6-Loch-Platte geben Sie 250 µL pro Vertiefung; für eine 6-cm-Schale geben Sie 500 µL pro Schale hinzu.
  4. Verwenden Sie einen Zellabstreifer, um alle Astrozyten gründlich in den RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % (Gew./Vol.) NP-40, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat und 0,1 % (Gew./Vol.) SDS, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]) abzuschaben.
  5. Überführen Sie die abgeschabten Zellen in einen 1-mL-Dounce-Homogenisator, der auf Eis steht. Homogenisieren Sie die Zellen, indem Sie sie vorsichtig mit dem Stößel zerkleinern.
  6. Inkubieren Sie die homogenisierten Zelllysate 10 min auf Eis, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. Heben Sie 20 µL der Gesamtlysate auf, um die Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure-(BCA-)Assay zu bestimmen.
  7. Zentrifugieren Sie die Zelllysate 10 min bei 13.500 × g bei 4 °C, um unlösliche Proteine zu pelletieren.
  8. Überführen Sie das Überstand vorsichtig in ein sauberes Röhrchen. Heben Sie 20 µL des Überstandes auf, um die Proteinkonzentration mittels BCA-Assay zu bestimmen.
  9. Konzentrieren Sie den Überstand durch Methanol/Chloroform-Fällung.
  10. Lösen Sie das resultierende Präzipitat in 0,1 mL Laemmli-Probelösungspuffer (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 % (Gew./Vol.) SDS, 12,5 % (Vol./Vol.) Glycerin, 0,01 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau, 355 mM β-Mercaptoethanol) wieder auf.
  11. Lösen Sie das Pellet im Laemmli-Probelösungspuffer auf und dispergieren Sie es durch Beschallung. 
  12. Führen Sie drei Beschallungszyklen mit 0,5-s-Impulsen bei 10 % Leistung durch. Halten Sie die Sondenspitze dabei am Boden des Röhrchens, um Schaumbildung zu vermeiden.
  13. Führen Sie einen Bicinchoninsäure-(BCA-)Proteinassay am RIPA-Überstand und an den Gesamtzelllysaten durch. 
  14. Tragen Sie die Proteinproben auf ein 12 % oder 15 %iges Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE-)Gel auf. Führen Sie das Gel 45 min bei konstanter Spannung von 200 V durch.
  15. Übertragen Sie die Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran mithilfe eines Nassübertragungssystems. Befolgen Sie die Herstelleranweisungen und übertragen Sie bei 100 V für 70 min.
  16. Legen Sie die Membran in 5 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % (Gew./Vol.) Tween-20 (TBST). Blockieren Sie mindestens 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  17. Verdünnen Sie die primären Antikörper gemäß den Herstelleranweisungen in TBST. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C in der primären Antikörperlösung unter leichtem Schütteln.
  18. Spülen Sie die Membran dreimal mit TBST, wobei jede Waschung 5 min dauert.
  19. Verdünnen Sie fluorophor- oder Horseradish-Peroxidase-(HRP-)konjugierte sekundäre Antikörper in TBST in einem Verdünnungsverhältnis von 1:500 (oder gemäß Herstellerangaben).
  20. Inkubieren Sie die Membran 1 h bei Raumtemperatur in der sekundären Antikörperlösung unter leichtem Schütteln.
  21. Spülen Sie die Membran dreimal mit TBST, wobei jede Waschung 5 min dauert.
  22. Entwickeln Sie die Membran mithilfe von Fluoreszenz oder verstärkter Chemilumineszenz (ECL) gemäß den Herstelleranweisungen.
  23. Visualisieren Sie die Proteinbänder mithilfe eines Bildgebungssystems.
    HINWEIS: Um den Proteinabbau zu verhindern, führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch, mit Ausnahme der Inkubation und Blockierung mit Antikörpern. Stellen Sie sicher, dass alle Puffer, Reagenzien und Geräte vorab gekühlt sind, um während des gesamten Prozesses niedrige Temperaturen aufrechtzuerhalten. Vermeiden Sie eine Überladung des Gels, um Verschmierungen zu verhindern, und optimieren Sie die Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten entsprechend dem jeweiligen Experiment.

6. Vorbereitung primärer Neuronen für die Kokultur

  1. Töten Sie die trächtige Ratte mit Kohlendioxid als inhalativen Anästhetikum. Entfernen Sie die Gebärmutter und legen Sie sie in eine sterile Petrischale.
  2. Entfernen Sie die Gehirne der Föten und legen Sie sie in eine 6-cm-Schale, die Dissektionslösung enthält. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe stets in der Lösung eingetaucht bleibt, um Austrocknung zu verhindern.
  3. Dissektieren Sie die Cortexregionen und entfernen Sie die Hirnhäute, wie beschrieben (Schritt 2.7).
  4. Überführen Sie das dissektierte Gewebe in einen laminaren Luftstrom.
  5. Aspirieren Sie die Dissektionslösung mit einer 1-mL-Pipette und geben Sie frische Dissektionslösung in die Schale.  
  6. Zerkleinern Sie das Gehirngewebe mit einer sterilen Skalpellklinge in kleine Stücke.
  7. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe in 5 mL neuronale Dissoziationslösung (Tabelle 1), die zuvor auf 37 ºC vorgewärmt wurde, in ein 15-mL-Röhrchen.
  8. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 min in einem 37 ºC warmen Wasserbad, wobei Sie das Röhrchen alle 5 min vorsichtig schütteln, um eine optimale Enzym-Gewebe-Interaktion sicherzustellen. 
  9. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Wasserbad und lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens absinken. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand mit einer 1-mL-Pipettenspitze, ohne das Gewebe zu stören.
  10. Geben Sie 5 mL vorgewärmte Dissektionslösung in das Röhrchen und kippen Sie es fünfmal um, um das Gewebe zu spülen. Lassen Sie das Röhrchen 3 min stehen, damit sich das Gewebe absetzen kann, und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal, jeweils mit frischer Dissektionslösung.
  11. Nach dem letzten Waschgang entfernen Sie den Überstand und geben 2,5 mL Dissektionslösung sowie 2,5 mL Plattiervolumen hinzu.
  12. Triturieren Sie das Gewebe, indem Sie die Lösung mit einer 10-mL-Pipette 10–15 Mal auf- und abpipettieren.
  13. Lassen Sie das Röhrchen 3 min stehen, damit sich das Gewebe absetzen kann. Überführen Sie den Überstand (mit den Zellen) in ein neues 50-mL-Konischglas.
  14. Geben Sie 5 mL Plattiervolumen in das ursprüngliche Röhrchen mit dem abgesetzten Gewebe. 
  15. Triturieren Sie das Gewebe erneut 10–15 Mal mit einer 10-mL-Pipette, bis die meisten Gewebestücke verschwunden sind.
  16. Leiten Sie die Zellsuspension durch einen sterilen 40-µm-Zellsieb in ein sauberes 50-mL-Konischglas, das 5 mL Plattiervolumen enthält.
  17. Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension 5 min bei Raumtemperatur mit 200 × g.
  18. Entfernen Sie den Überstand und lockern Sie das Zellpellet vorsichtig durch leichtes Antippen des Röhrchens. Geben Sie 5 mL vorgewärmtes Plattiervolumen hinzu und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um das Pellet erneut in Suspension zu bringen.
  19. Zählen Sie die Zellen, wie zuvor beschrieben (Schritte 2.21 und 2.22). Halten Sie die Zellsuspension während des Zellzählens in einem 37 °C warmen Wasserbad.
  20. Plattieren Sie die Neuronen direkt auf die primären Astrozyten in den Kulturgefäßen wie folgt: für eine 24-Loch-Platte säen Sie 1,45 × 105 Zellen pro Vertiefung; für eine 6-Loch-Platte säen Sie 5 × 105 Zellen pro Vertiefung; für eine 6-cm-Schale säen Sie 1 × 106 Zellen pro Schale.
  21. Stellen Sie die Platten oder Schalen in einen Zellkultur-Inkubator, der auf 37 ºC mit 5 % CO₂ eingestellt ist. Vermeiden Sie längere Aufenthalte der Zellen bei Raumtemperatur, um die Vitalität zu erhalten.
  22. Ersetzen Sie das Plattiervolumen 4 h nach dem Plattieren durch neuronales Erhaltungsmedium.
  23. Ersetzen Sie alle 3–4 Tage die Hälfte des Mediums durch frisches neuronales Erhaltungsmedium.
    HINWEIS: Die kokultivierten Neuronen sind nach 7–10 Tagen in vitro (DIV) versuchstauglich.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Ein morphologischer Überblick über primäre Astrozytenkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Isolation ist in Abbildung 3 dargestellt. Nach dem Ansäen der kortikalen Zellsuspension haften einige Astrozyten innerhalb der ersten 24 Stunden an der Oberfläche der Kulturschale (Abbildung 3A). In den ersten drei bis fünf Tagen enthalten die Kulturen Zelltrümmer und absterbende Neuronen (Abbildung 3B), da das Kulturmedium darauf opt...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Primäre Astrozytenkulturen haben unser Verständnis der Rolle von Astrozyten in Gesundheit und Krankheit erheblich vorangebracht. Aufbauend auf den bahnbrechenden Arbeiten von McCarthy und de Vellis21 sind diese Kulturen entscheidend für die Erforschung der Alexander-Krankheit (AxD), da sie eine detaillierte Untersuchung astrozytenspezifischer Prozesse ermöglichen, insbesondere die Auswirkungen von AxD-Mutationen auf die GFAP-Assemblierung und die Bildung von Aggregaten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) für die Bereitstellung der R237H-Knock-in-Ratten. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Science and Technology Council (111-2320-B-007-008 und 112-2320-B-007-006 an N.-H. L. und M.-D.P.) unterstützt. Die Autoren danken der Unterstützung durch die konfokale Bildgebungseinrichtung der National Tsing Hua University, Taiwan, die vom National Science and Technology Council (NSTC-114-2740-M-007-001) gefördert wird. Wir danken außerdem dem Instrumentenlabor der National Tsing Hua University für den Zugang zum Elektronenmikroskop.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 M HEPES , pH 7,4 Gibco15630-080
100× Penicillin-Streptomycin  Gibco15140-122
10× Hank’sche Pufferlösung (HBSS)Gibco14180-046
2,5 % TrypsinGibco15090046
30 % Acrylamid/Bis-Lösung 37,5:1Biorad1610158
anti-GFAP-AntikörperCell Signaling Technology12389
anti-menschlicher GFAP-AntikörperBiolegend837202Clone SMI21
anti-panGFAP-AntikörperAgilentGA524
anti-Ubiquitin-AntikörperMilliporeST 1200Clone FK2
anti-Vimentin-AntikörperSigma-AldrichV6389Clone V9
anti-β III-Tubulin-AntikörperBiolegend801201
B27-ZusatzGibco17504044
Calciumchlorid (CaCl2)Arcos34961
Reagenzien für die Zellkultur
ChemiDoc-BildgebungssystemBioRadNA
Coomassie-Blau-FärbemittelUSB32826
CysteinSigma-AldrichC1276
Dithiothreitol (DTT)URDTT
DNase I Sigma-AldrichD5025
Dounce-HomogenisatorWheaton
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)Corning10-013-CM
Endotoxinfreies Plasmid-DNA-Präparationskit Qiagen12943
Verstärktes chemilumineszierendes (ECL) ReagenzPerkinElmerNEL 105001
Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA)USB15699
Fötales Rinderserum  GibcoA5209401
GlukoseSigma-AldrichG8270
GlutaMaxGibco35050-061
Minimal essentielles Medium (MEM)Corning10-010-CVR
NaClHoneywell31434S
Neurobasal-MediumGibco21103049
Optima XE-90 UltrazentrifugeBeckmanNA
PapainWorthingtonLS003126
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)ACROS ORGANICS215740050
PolyethyleniminSigma-AldrichP3143
Poly-L-lysinSigma-AldrichP6516
Kaliumchlorid (KCl)Honeywell12636
Rhodamin-anti-Aktin-AntikörperBioRad12004164
Natriumdodecylsulfat (SDS)USB75819
NatriumpyruvatGibco11360070
StarBright Blue 520 Ziegen-anti-Maus-IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 Ziegen-anti-Kaninchen-IgG BioRad12004161
SaccharoseSigma-AldrichS5391
SW-28-RotorBeckmanNA
TansIT-LT1 TransfektionsreagenzMirusMR-MIR-2300
TEMEDUSB76320
Tris(Hydroxymethyl)aminomethan (Tris)USB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
β-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148

Referenzen

  1. Verkhratsky A, Nedergaard M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 2018;98(1):239-389.
  2. Eroglu C, Barres BA. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 2010;468(7321):223-31.
  3. Sofroniew MV. Astrogliosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;7(2):a020420.
  4. Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 2010;119(1):7-35.
  5. Brandebura AN, Paumier A, Onur TS, Allen NJ. Astrocyte contribution to dysfunction, risk and progression in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci. 2023;24(1):23-39.
  6. Sofroniew MV. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 2009;32(12):638-47.
  7. Hol EM, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 2015;32:121-30.
  8. Brenner M, et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 2001;27(1):117-20.
  9. Lin NH, Jian WS, Perng MD. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 2025;26(5):1913.
  10. Yang AW, et al. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 2022;33(8):ar69.
  11. Lin NH, Perng MD. Experimental approaches for biochemical analysis of glial fibrillary acidic protein and its disease-associated variants. J Vis Exp. 2025;(225).
  12. Hagemann TL, Connor JX, Messing A. Alexander disease-associated glial fibrillary acidic protein mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 2006;26(43):11162-73.
  13. Hagemann TL, et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 2021;13(620):eabg4711.
  14. Hagemann TL. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 2022;72:140-7.
  15. Lange SC, et al. Primary cultures of astrocytes: their value in understanding astrocytes in health and disease. Neurochem Res. 2012;37(11):2569-88.
  16. Lin NH, Yang AW, Chang CH, Perng MD. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 2021;35(5):e21614.
  17. Lin NH, Jian WS, Snider N, Perng MD. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 2024;300(7):107402.
  18. Goya-Iglesias N, et al. Alexander disease mutations differentially sensitize glial fibrillary acidic protein (GFAP) to posttranslational modifications and network disruption by oxidants. Redox Biol. 2026;92:104103.
  19. Olabarria M, Putilina M, Riemer EC, Goldman JE. Astrocyte pathology in Alexander disease causes a marked inflammatory environment. Acta Neuropathol. 2015;130(4):469-86.
  20. Lee HG, Wheeler MA, Quintana FJ. Function and therapeutic value of astrocytes in neurological diseases. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(5):339-58.
  21. McCarthy KD, de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 1980;85(3):890-902.
  22. Olsen ML, et al. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 2006;53(5):516-28.
  23. Strack A, et al. Chemokines are differentially expressed by astrocytes, microglia and inflammatory leukocytes in Toxoplasma encephalitis and critically regulated by interferon-gamma. Acta Neuropathol. 2002;103(5):458-68.
  24. East E, Golding JP, Phillips JB. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. J Tissue Eng Regen Med. 2009;3(8):634-46.
  25. Zhang Y, Barres BA. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 2010;20(5):588-94.
  26. Oberheim NA, Goldman SA, Nedergaard M. Heterogeneity of astrocytic form and function. Methods Mol Biol. 2012;814:23-45.
  27. Vasile F, Dossi E, Rouach N. Human astrocytes: structure and functions in the healthy brain. Brain Struct Funct. 2017;222(5):2017-29.
  28. Oberheim NA, et al. Uniquely hominid features of adult human astrocytes. J Neurosci. 2009;29(10):3276-87.
  29. Peterson IL, et al. Isolation and monoculture of functional primary astrocytes from the adult mouse spinal cord. Front Neurosci. 2024;18:1367473.
  30. Agalave NM, et al. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 2020;340:108742.
  31. Du F, et al. Purity, cell viability, expression of GFAP and bystin in astrocytes cultured by different procedures. J Cell Biochem. 2010;109(1):30-7.
  32. Lin NH, et al. The role of gigaxonin in the degradation of the glial-specific intermediate filament protein GFAP. Mol Biol Cell. 2016;27(25):3980-90.
  33. Lin NH, Perng MD. Synergistic effects of glial fibrillary acidic protein mutation and overexpression in the pathogenesis of Alexander disease. Int J Mol Sci. 2026;27(10).
  34. Perng M, et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 2006;79(2):197-213.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

GFAP-MutationenAstrozytendysfunktionoxidativer StressRosenthal-Fasernlentivirale TransduktionAstrozytenkulturneurodegenerative Erkrankung

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.