Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt, wie C. elegans zu dopaminergen Neuronen Neurodegeneration als Modell für die Parkinson-Krankheit zu beurteilen. Darüber hinaus sind genetische Screens verwendet, um Faktoren, die entweder zu verstärken Degeneration oder neuroprotektive identifizieren.

Zusammenfassung

Verbesserungen bei der Diagnose und Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD) sind abhängig von Wissen über die Anfälligkeit Faktoren, die Bevölkerung zu machen in Gefahr. In den Prozess der Versuch, neue genetische Faktoren mit PD verbunden zu identifizieren, haben Wissenschaftler viele Listen von Kandidaten-Gene, Polymorphismen, und Proteine, die wichtige Fortschritte darstellen erzeugt, aber diese führt bleiben mechanistisch undefined. Unsere Arbeit richtet sich deutlich verengt solche Listen unter Ausnutzung der Vorteile einer einfachen Tiermodell System abzielen. Während Menschen Milliarden von Neuronen haben, hat die mikroskopische Fadenwurm Caenorhabditis elegans genau 302, von denen nur acht produzieren Dopamin (DA) in hemaphrodites. Expression eines menschlichen Gens für den PD-assoziierten Protein, alpha-Synuclein, in C. elegans DA Neuronen führt zu Dosierung und altersabhängige Neurodegeneration.

Worms zum Ausdruck menschlichen Alpha-Synuclein in DA Neuronen isogenen und exprimieren sowohl GFP und humanes Alpha-Synuclein unter der DA-Transporter-Promotor (PDAT-1). Die Anwesenheit von GFP dient als leicht visualisiert Marker für folgende DA Neurodegeneration bei diesen Tieren. Wir haben uns zunächst gezeigt, dass Alpha-Synuclein-induzierte DA Neurodegeneration bei diesen Tieren konnte durch torsinA, ein Protein mit molekularer Chaperone Aktivität ¹ gerettet werden. Weitere, Kandidat PD-assoziierter Gene in unserem Labor über eine groß angelegte RNAi-Screening Bemühungen mit einem Alpha-Synuclein Fehlfaltung Assay identifiziert wurden dann in C. elegans DA Neuronen überexprimiert. Wir haben festgestellt, dass fünf der sieben Gene vertreten signifikanten Kandidaten Modulatoren von PD getestet, wie sie alpha-Synuclein induzierten Neurodegeneration DA ² gerettet. Darüber hinaus hat die Lindquist Lab (diese Ausgabe von JoVE) Hefe-Bildschirme durchgeführt, wobei Alpha-Synuclein-abhängige Toxizität als Anzeige für die Gene, die zu verbessern oder zu unterdrücken Zytotoxizität verwendet wird. Wir Anschließend prüfte die Hefe Kandidatengene in unserem C. elegans alpha-Synuclein induzierten Neurodegeneration Assay und erfolgreich validiert viele dieser Ziele ^{3, 4.}

Unsere Methodik umfasst Erzeugung eines C. elegans DA Neuronen-spezifische Expressionsvektor mit recombinational Klonen von Kandidatengen cDNAs unter der Kontrolle der PDAT-1-Promotor. Diese Plasmide werden dann in Wildtyp-(N2) Würmer mikroinjiziert, zusammen mit einem Selektionsmarker für eine erfolgreiche Transformation. Mehrere stabilen transgenen Linien Herstellung der Kandidaten-Protein in DA Neuronen erhalten und dann unabhängig gekreuzt in die alpha-Synuclein degenerative Belastung und bewertet für Neurodegeneration, sowohl an der Tier-und individuellen Neuron Ebene, im Laufe des Alterns.

Protokoll

A. Expressionsplasmid Construction

Zwei Plasmide sind erforderlich: eine für Gewebe-spezifische Expression des Gens von Interesse und eine zweite als wählbare Transformation Marker (obwohl die Marker-Plasmid ist in der Regel innerhalb der Forschergemeinschaft zur Verfügung).

Experimentelle Plasmid

1. Wählen Sie einen Promotor, der in dem Gewebe / Zelltyp von Interesse zum Ausdruck kommt, in diesem Fall, der DA-Transporter (PDAT-1) Promotor verwendet wird. Das Expressionsplasmid wurde als Invitrogen Gateway-System-kompatiblen Destination-Vektor (pDEST-DAT-1) geschaffen, um die Einfügung eines Gens von Inte....

Diskussion

Die altersabhängige Verlust von Dopamin-Neuronen ist ein klinisches Kennzeichen der Parkinson-Krankheit und hat mit der Akkumulation oder Fehlfaltung eines Proteins namens Alpha-Synuclein in Verbindung gebracht. Hier zeigen wir, wie Label, über eine fluoreszierende Transgen, die dopaminergen Neuronen von C. elegans und Mimik der Neurodegeneration bei Parkinson-Erkrankung, die durch Koexpression humanes Alpha-Synuclein zu sehen in diesen Zellen.

Dieses Video zeigt die Methodik für Wachstum, genetische Kreuzung, Montage und S.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Deckglas 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Mikroskopobjektträger	Einfach, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Fluoreszenz-Mikroskop	Stereomikroskop	Nikon Instruments	SMZ800
Stereomikroskop	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ645
Epifluoreszenz-	Mikroskop	Nikon Instruments	Modell E-800
Filterwürfel, GFP HYQ	Endow-Bandpass	Chroma Technology Corp.