Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt, wie C. elegans zu dopaminergen Neuronen Neurodegeneration als Modell für die Parkinson-Krankheit zu beurteilen. Darüber hinaus sind genetische Screens verwendet, um Faktoren, die entweder zu verstärken Degeneration oder neuroprotektive identifizieren.

Zusammenfassung

Verbesserungen bei der Diagnose und Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD) sind abhängig von Wissen über die Anfälligkeit Faktoren, die Bevölkerung zu machen in Gefahr. In den Prozess der Versuch, neue genetische Faktoren mit PD verbunden zu identifizieren, haben Wissenschaftler viele Listen von Kandidaten-Gene, Polymorphismen, und Proteine, die wichtige Fortschritte darstellen erzeugt, aber diese führt bleiben mechanistisch undefined. Unsere Arbeit richtet sich deutlich verengt solche Listen unter Ausnutzung der Vorteile einer einfachen Tiermodell System abzielen. Während Menschen Milliarden von Neuronen haben, hat die mikroskopische Fadenwurm Caenorhabditis elegans genau 302, von denen nur acht produzieren Dopamin (DA) in hemaphrodites. Expression eines menschlichen Gens für den PD-assoziierten Protein, alpha-Synuclein, in C. elegans DA Neuronen führt zu Dosierung und altersabhängige Neurodegeneration.

Worms zum Ausdruck menschlichen Alpha-Synuclein in DA Neuronen isogenen und exprimieren sowohl GFP und humanes Alpha-Synuclein unter der DA-Transporter-Promotor (PDAT-1). Die Anwesenheit von GFP dient als leicht visualisiert Marker für folgende DA Neurodegeneration bei diesen Tieren. Wir haben uns zunächst gezeigt, dass Alpha-Synuclein-induzierte DA Neurodegeneration bei diesen Tieren konnte durch torsinA, ein Protein mit molekularer Chaperone Aktivität ¹ gerettet werden. Weitere, Kandidat PD-assoziierter Gene in unserem Labor über eine groß angelegte RNAi-Screening Bemühungen mit einem Alpha-Synuclein Fehlfaltung Assay identifiziert wurden dann in C. elegans DA Neuronen überexprimiert. Wir haben festgestellt, dass fünf der sieben Gene vertreten signifikanten Kandidaten Modulatoren von PD getestet, wie sie alpha-Synuclein induzierten Neurodegeneration DA ² gerettet. Darüber hinaus hat die Lindquist Lab (diese Ausgabe von JoVE) Hefe-Bildschirme durchgeführt, wobei Alpha-Synuclein-abhängige Toxizität als Anzeige für die Gene, die zu verbessern oder zu unterdrücken Zytotoxizität verwendet wird. Wir Anschließend prüfte die Hefe Kandidatengene in unserem C. elegans alpha-Synuclein induzierten Neurodegeneration Assay und erfolgreich validiert viele dieser Ziele ^{3, 4.}

Unsere Methodik umfasst Erzeugung eines C. elegans DA Neuronen-spezifische Expressionsvektor mit recombinational Klonen von Kandidatengen cDNAs unter der Kontrolle der PDAT-1-Promotor. Diese Plasmide werden dann in Wildtyp-(N2) Würmer mikroinjiziert, zusammen mit einem Selektionsmarker für eine erfolgreiche Transformation. Mehrere stabilen transgenen Linien Herstellung der Kandidaten-Protein in DA Neuronen erhalten und dann unabhängig gekreuzt in die alpha-Synuclein degenerative Belastung und bewertet für Neurodegeneration, sowohl an der Tier-und individuellen Neuron Ebene, im Laufe des Alterns.

Protokoll

A. Expressionsplasmid Construction

Zwei Plasmide sind erforderlich: eine für Gewebe-spezifische Expression des Gens von Interesse und eine zweite als wählbare Transformation Marker (obwohl die Marker-Plasmid ist in der Regel innerhalb der Forschergemeinschaft zur Verfügung).

Experimentelle Plasmid

1. Wählen Sie einen Promotor, der in dem Gewebe / Zelltyp von Interesse zum Ausdruck kommt, in diesem Fall, der DA-Transporter (PDAT-1) Promotor verwendet wird. Das Expressionsplasmid wurde als Invitrogen Gateway-System-kompatiblen Destination-Vektor (pDEST-DAT-1) geschaffen, um die Einfügung eines Gens von Interesse stromabwärts des Promotors durch recombinational Klonen ^{1 zu} ermöglichen.
2. Die cDNA des Gens von Interesse ist die PCR mit den Primern, dass das Gateway att B recombinational Sequenz enthalten. Die amplifizierte cDNA wird zunächst in der Donor-Vektor pDONR201 um den Eintrag zu erstellen Vektor rekombiniert und dann in E. coli-Stamm DH5. Nach der Auswahl von erfolgreichen Rekombinanten und mini-prep Isolierung von DNA, wird der Eintrag Vektor in die pDEST-DAT-1 Zielvektor zu schaffen Expressionsplasmid rekombiniert. Details zu recombinational Klonen sind entweder von der Invitrogen Gateway-Handbuch oder in Caldwell et al Verfügung. ^5.

Selektionsmarker Plasmid

Eine transgene Marker Plasmid besteht aus einem Vektor mit einem Promotor, der die Expression eines fluoreszierenden Proteins in eine offensichtliche Gewebe. In diesem speziellen Verfahren, treibt das unc-54-Promotor Kirsche Proteinexpression in Körperwand Muskel (punktiert-54:: Kirsche).

B. Herstellung von transgenen C. elegans über Mikroinjektion

Siehe zugehörige JoVE Artikel: https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Genetische Kreuze für DA Neurodegeneration Analysis

1. Worms angebaut werden mit Standard-Verfahren ^6.
2. Platz 10 PDAT-1:: α-syn; PDAT-1:: GFP Rüden ^{1, 2} auf eine Gegenplatte mit 3-4 L4 Stadium transgenen Hermaphroditen (Ausdruck PDAT-1:: Gen-X und punktiert-54:: Kirsche) . Diese sind individuell für jede der drei separaten stabile Linien erstellt durchgeführt werden. Nach zwei Tagen, entfernen Sie die Männchen.
3. Überprüfen Sie die F1-Generation, wenn es mehrere männliche Nachkommen sind, war die Paarung erfolgreich.
4. Clone out 5 Hermaphrodit L4 Tiere von jeder Kreuz, das zeigen sowohl die PDAT-1:: GFP fluoreszierenden Marker (geerbt von den männlichen Elternteil) und die punktiert-54:: cherry fluoreszierenden Körper Wand Muskel-Marker (geerbt von der Hermaphrodit Elternteil). Die geklonten Tiere müssen auf der L4 Stadium werden, um sicherzustellen, dass sie noch nicht mit männlichen Tieren auf dem Teller gedeckt. Erlauben Sie ihnen, sich selbst kreuzen und produzieren F2-Nachkommen.
5. F2 Tiere in Schritt 3 erzeugt werden geklont aus. Insbesondere Transfer ~ 5-10 Tieren, die sowohl fluoreszierende Marker aufweisen, ihre eigenen individuellen Platten. Bildschirm der F3 Generation für Platten, wo 100% der Tiere zum Ausdruck GFP in DA Neuronen und einige der Tiere zum Ausdruck Kirsche in Körperwand Muskelzellen. Diese Tiere werden homozygot für die PDAT-1:: α-syn; PDAT-1:: GFP-Gen, während stabil Übertragung der neu geschaffenen Transgen (Gen X).

D. dopaminergen Neuronen Analysis

1. Bereiten Sie eine neue Platte für jede der drei Linien oben erstellt, sowie die PDAT-1:: α-syn; PDAT-1:: GFP allein belasten. Lassen Sie sie bis zum Erwachsenenalter wachsen.
2. Transfer 30-40 transgenen Erwachsene aus jeder Zeile auf eine frische Platte. Erlauben Sie ihnen, Embryonen für 4 Stunden lag bei 20 º C.
3. Entfernen Sie die Erwachsenen. Lassen Sie die Embryonen für 3-4 Tage bei 20 º C zu entwickeln, bis sie die L4 Stadium zu erreichen.
4. Wählen Sie ~ 100 transgenen L4 Tiere eine Platte mit 0,04 mg / ml 5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUDR). Diese Nukleotidanalog Blöcke Entwicklung der nächsten Generation über eine Hemmung der DNA-Synthese und verhindert so den Nachkommen von überwältigender den experimentellen Tiere ^7. Schützen Sie die FUDR Platten aus dem Licht, da sie lichtempfindlich ist.
5. Erwachsene Tiere werden an verschiedenen Tagen nach der Eiablage analysiert werden. Die entsprechenden Tage Analyse werden empirisch ermittelt. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass 77%, 87% und 90% der PDAT-1:: α-syn; PDAT-1:: GFP Tiere zeigen degenerierte DA Neuronen an den Tagen 6, 7 und 10 nach der Entwicklung bzw.. Wenn wir also davon aus, dass das Transgen von Interesse sein könnten Neurodegeneration zu verbessern, werden wir am Tag 6 und / oder 7 zu analysieren. Ebenso werden Transgene, die Neurodegeneration zu unterdrücken könnte an den Tagen 7 und 10 analysiert werden.
6. Machen Sie 4 frische Agarose-Pads (im Gegensatz zu den Mikroinjektion Agar-Pads, diese werden frisch und dürfen nicht austrocknen). Set Sie zwei Objektträger, dass ein Stück Klebeband haben über sie, die Band dient als Abstandshalter für äquivalent dicken Ballen. Lay ein DrittelRutsche zwischen ihnen auf der Bank (sie sind drei nebeneinander positioniert). Geben Sie einen Tropfen geschmolzenen Agarose auf die Mitte schieben und schnell lag eine andere Folie auf der Oberseite des Agarose, senkrecht und quer durch alle drei Dias. Machen Sie mehrere zusätzliche Pads, so dass die beiden Schieber zusammen, bis das Pad einsatzbereit ist.
7. Zur Analyse Wurm DA Neuronen, statt einer 6 ul Rückgang von 3 mM Levamisol (Narkose) auf einem 22 x 30 mm Deckglas. Wählen Sie 40 erwachsenen Tieren (10 zusätzliche jenseits der 30 zu sein hat) in den Tropfen, dann kehren die Deckglas auf das Agarose-Pad. Wiederholen Sie für jede der anderen Linien.
8. Ergebnis 30 Tiere pro Zeile auf das Vorhandensein von jedem CEP und ADE Neuron mit einem zusammengesetzten Mikroskop mit Epifluoreszenz und einen Filter Würfel, der Visualisierung von FITC oder GFP ermöglicht. Wir verwenden ein Endow GFP HYQ Filter Würfel (Chroma Technology). Rekord Daten auf den angeschlossenen Auswertungsbogen. Wild-Typ Tiere behalten die volle GFP-Fluoreszenz in allen 4 CEP und 2 ADE Neuronen. Einzelne Tiere ausstellen Verlust der DA Neurone sind als Nicht-WT oder "entartet" gewertet. Ebenso kann das Ausmaß der Degeneration durch Zählen der insgesamt Neuronen in jedem Tier sowie der Bevölkerung verloren gewertet.
9. Wiederholen Sie die Analyse 2 weitere Male (30 weitere Tiere pro Zeile pro Versuch). Die Gesamtzahl der Würmer ausstellenden Wildtyp-DA Neuronen aus den drei Runden der Analysen gemittelt wird. Statistische Analyse zur Neuroprotektion wird dann unter Verwendung des Student-t-Test (p <0,05) zur Kontrolle Würmer (PDAT-1:: α-syn; PDAT-1:: GFP) zu vergleichen mit den Stämmen, die über-express Kandidatengene in DA Neuronen .

Diskussion

Die altersabhängige Verlust von Dopamin-Neuronen ist ein klinisches Kennzeichen der Parkinson-Krankheit und hat mit der Akkumulation oder Fehlfaltung eines Proteins namens Alpha-Synuclein in Verbindung gebracht. Hier zeigen wir, wie Label, über eine fluoreszierende Transgen, die dopaminergen Neuronen von C. elegans und Mimik der Neurodegeneration bei Parkinson-Erkrankung, die durch Koexpression humanes Alpha-Synuclein zu sehen in diesen Zellen.

Dieses Video zeigt die Methodik für Wachstum, genetische Kreuzung, Montage und S...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Deckglas 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Objektträger	Normal, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Präparieren mit Fluoreszenzmikroskop		Nikon Instruments	SMZ800
Präparieren	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ645
Epifluoreszenzmikroskop		Nikon Instruments	Modell E-800
Filter Cube, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.