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I. Schematische Übersicht:
Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in whole mount Immunhistochemie in Hühnerembryo. Zunächst wird der Embryo in PFA fixiert [IHC1]. Dann wird die endogene Peroxidase Aktivität abgeschreckt [IHC2]. Der Embryo wird dann in Primärantikörper [IHC3] inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wird der Embryo in sekundärem Antikörper [IHC4]; Farbreaktion zeigte mit DAB [IHC5] und Antikörper-Färbung erscheint orange [IHC6].
Teil 1: Befestigung des Embryos
- Um ganze Berg Immunhistochemie auf Hühnerembryonen, öffnen Sie zunächst ein Ei, indem Sie die Schale mit einer Pinzette und Entfernen von Teilen der Schale.
- Entfernen Sie die dicken Albumin mit einer Pinzette, und kippen Sie den Dottersack mit groben Pinzette so, dass der Embryo nach oben zeigt.
- Mit einer feinen Schere, schneiden Sie ein Quadrat der Dottersack rund um den Embryo. Entfernen Sie den Embryo aus dem Eigelb mit einem Löffel, und in eine Schale mit PBS.
- Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie vorsichtig die Membranen und Eigelb und dem Embryotransfer eine frische Schale mit PBS.
- Pin der Embryo sich mit einer Pinzette und Insekten Pins, und saugen Sie den PBS. Ersetzen Sie diese mit 4% PFA in PBS und lassen den Embryo bis 1h bei RT fixieren.
Teil 2: Vorbereiten Embryonen für die Antikörper-Schritt
- Zur Minimierung der potenziellen mikrobiellen Kontamination, verwenden ddH 2 O in allen folgenden Schritten.
- Nach der Embryo fixiert ist, saugen die Fixierlösung und ordnungsgemäß entsorgen als chemischer Abfall. Füllen Sie die Schale mit PBS.
- nächsten, mit einer Mikrodissektion Messer, schneiden Sie ein Quadrat um Embryo extraembryonalen Membranen zu entfernen. Entfernen Insektennadeln mit einer Pinzette.
- Nach der Stifte entfernt wurden, mit einer stumpfen Ende Pasteurpipette auf den Embryo zu einem Szintillations Fläschchen mit PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X) zu übertragen.
- Waschen Sie den Embryo mit PBT, 3-mal für jeweils 10 Minuten.
- Entfernen PBT von der Scintillationsfläschchen, und ersetzen Sie mit PBTx mit 0,3% H 2 O 2, um mögliche endogene Peroxidase zu inaktivieren.
- Inkubieren für 2 h bei RT auf Kolbenpendel.
- Wash Embryo mit PBT, 3-mal für jeweils 10 Minuten, dann 3 mal für jeweils 30 Minuten.
Teil 3: Antikörper Inkubation
- Um Flecken auf den Embryo mit dem Antikörper durch Waschen der Embryo für eine Stunde in Blocking-Puffer oder 1% BSA / 1% NGS / PBT (wir verwenden NGS, weil der sekundäre Antikörper in Ziege angehoben wird) zu starten. Inkubieren auf Kolbenpendel für eine Stunde bei RT.
- Verdünnen Sie den Primärantikörper 1:1 in Blocking-Puffer, und inkubieren Embryo in dieser Lösung für 2 Tage bei 4 ° C auf Kolbenpendel. Primärer Antikörper Verdünnungsfaktor hängt von der Wahl des primären Antikörpers. Hier verwenden wir ein Antikörper aus dem Developmental Studies Hybridoma Bank, die als Überstand vorgesehen ist. Wir verdünnen 1:1 in Blocking-Puffer.
- Führen Sie danach 3 10-minütige Waschungen in PBT, um 3 1-Stunden-Wäschen in PBT gefolgt.
- Nach dem Waschen, verdünnte den sekundären Antikörper 1:2500 in Blocking-Puffer (in diesem Fall Peroxidase konjugierten Ziege anti-Maus IgG (H + L), und inkubieren Embryo in dieser Lösung O / N bei 4 ° C auf Kolbenpendel.
- Führen Sie 3 10-minütige Waschungen in PBT, um 3 1-Stunden-Wäschen in PBT gefolgt.
Teil 3: Farbreaktion
- Zur Entwicklung der Farbreaktion der gefärbten Embryo, führen Sie zuerst 2 20-minütige Waschungen in Tris-Puffer (100 mM Tris HCl, pH 7,4).
- Inzwischen lösen sich DAB Substrat (3,3 '-Diaminobenzidintetrahydrochlorid) in Tris-Puffer bei 500μg/ml unter Abzug; halten Lösung in dunklen, auf Eis.
- Entfernen letzten Tris-Puffer waschen aus dem Fläschchen mit Embryo und ersetzen mit 5 ml DAB-Lösung aus Schritt 3.2. Keep in Dunkelheit auf Kolbenpendel für 20 mn. Entsorgen Eppendorfspitze in Eimer mit einer 10% igen Bleichlösung um DAB zu dekontaminieren.
- In der Zwischenzeit bereiten 0,3% Lager H 2 O 2 in dH 2 O auf dem Eis.
- Add 50 ul Lager H 2 O 2 zu Fläschchen mit Embryonen in DAB. Keep in dunkel. Nach 1-2 Minuten, zu überwachen Reaktion unter dem Mikroskop.
Teil 4: Embryo-Verarbeitung für Fotografie und Histologie
- Wenn Farbreaktion abgeschlossen ist, von DAB verfügen in bleach Eimer. Ersetzen Sie mit 5 ml Leitungswasser.
- Führen Sie 2 10-minütige Waschungen in PBS.
- Für die Verarbeitung für die Fotografie und Wachs Schnitte, in einer Ethanol-Reihe dehydrieren (25%, 50%, 75% und 100%) für jeweils 10 Minuten.
- Ersetzen Sie das Ethanol mit 0,5 bis 1 ml Zedernholz Öl (dieser wird der Embryo durchscheinend zu machen). Prozess für die Fotografie in Zedernholz Öl.
- Nach Fotografie, Rückkehr Embryo Fläschchen und ersetzen Sie das Zedernholz Öl mit 100% Ethanol. Wiederholen Sie Schritt Ethanol.
- Ersetzen Sie ethanol mit 5% Fast Green FCF in 100% Ethanol und Inkubation für 3 Minuten (dieser Schritt wird sichtbar Embryonen für die Histologie). Ersetzen Fast Green FCF-Lösung mit 100% Ethanol und Verfahren für die Histologie.
Repräsentative Ergebnisse:
In den Beispielen unten gezeigt, sind Embryonen in den Stadien HH 10 (A), 12 (B) und 11 (C) seziert; Embryonen zeigen Ausdruck PAX 7 in Schwellenländern neuronalen Crestas sowie in Somiten und Neuralrohr (A, B); In (C), ist Chorda mit 15.3B9 (Not-1) (Antibodies by Developmental Studies Hybridoma Bank hat) gekennzeichnet.