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Pulling Pipetten
Mit Hilfe eines Fadens puller wie Sutter P-97 Flaming / Brown Microelectrode Puller, ziehen eine Reihe von etwa 10-20 Pipetten.
- Wählen Sie Ihr Glas. Wir verwenden Borosilikat (BF150-86 bis 10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Bewahren Sie das Glas vorsichtig damit es sauber und staubfrei bleibt.
- Entwerfen Sie ein Ziehen Programm. Das primäre Ziel ist ein Bahnöffnung etwa die gewünschte Größe, die auf Anwendung abhängen. Sutter P-97 Pipette Cookbook 2 ist eine hervorragende Referenz.
- Beobachten Sie Ihre Pipetten unter dem Mikroskop auf Öffnungsdurchmesser und Glätte zu bestimmen. Discard rau, uneben oder unregelmäßig Tipps. Für Standard-Patch-Clamp-Aufnahme wird ein Bahnöffnung daß 2-4 um über die beste ist. Eine stumpfe Spitze führt zu Widerstand für den gleichen Öffnungsdurchmesser, was bevorzugt ist niedriger. Form und Größe kann beim Polieren geändert werden, siehe unten.
Druck Polieren Pipetten
- Bringen Sie einen Pipettenhalter, um eine saubere, Druckluftleitung. Mit einem Regler, setzen Sie die Druckluftleitung Druck ~ 40 PSI. Schließen Sie die Druckluftleitung in ein 4-Wege-Steuerventil, mit denen die Pipettenhalter Druck ein-und ausgeschaltet werden. Schließen Sie einen Pipettenhalter an das Regelventil mit einer Länge von ⅛ in Tygon ®-Schlauch.
- Verwenden Sie ein Poliertuch rig (microforge) mit einem Hochdruck-Pipettenhalter, ein Polier-Spule durch ein Fußpedal, ein Mikroskop mit einer niedrigen und hohen Vergrößerungen, lange Distanzen (im Idealfall, 10x und 100x) Luft Zielen ausgestattet gesteuert. Es ist wichtig, um der Lage sein, die Pipette Öffnen während das Protokoll zu beobachten.
- Optional: Bestreichen Sie die Pipette mit einer hydrophoben Isolator Kapazität zu verringern und verbessern das Geräuschverhalten (siehe "Pulling Pipetten" für diese Technik).
- Überprüfen Sie das Druckventil ist in der Aus-Stellung. Legen Sie eine Pipette in die Pipettenhalter und ziehen Sie die Montage auf handfest.
Sicherheitshinweis: Wenn die Pipette ist eng in die Pipette Halter gehalten, den Luftdruck bewirkt, dass die Pipette aus dem Pipettenhalter ausgeworfen werden.
- Platzieren Sie die Pipette und Halter in der microforge. Positionieren Sie den Pipettenhalter auf dem Mikroskoptisch so dass sowohl die Spitze und das Polieren Spule sichtbar sind niedrig (10x) Macht auf der microforge. Bringen Sie die Spitze ~ 75 Mikron aus dem Filament. Denken Sie daran, dass der Faden dehnt sich bei Erwärmung.
- Wechseln Sie auf die hohe Leistung (100x) Ziel. Sowohl die Pipettenspitze und das Polieren Spule sollte im Fokus und in das Blickfeld sein. Wenn nicht, stellen Sie die Höhe der Polier Spule. (Die Pipette die Position kann nicht eingestellt werden). Die Pipettenspitze und Polieren Spule sollte nahe an der gegenüberliegenden Seite des Gesichtsfeldes. Vermeiden Sie die Spule zu der Pipettenspitze schließen, weil es zu erweitern wird, wie es erwärmt und stoßen Ihrer Pipette.
- Drehen Sie das Ventil mit Druckluft in die Pipette direkt und Wärme der Pipettenspitze bis zum Kegel hinter der Spitze beginnt, nach außen Ballon.
- Stop-Heizung vor der Spitze Ballons zu umfangreich. Experimentieren ist erforderlich, um die entsprechende Distanz, Wärme und Zeit für die gewünschte Form zu bestimmen.
- Optional: Reduzieren Sie die Spitze Öffnungsdurchmesser durch Polieren der Spitze in Abwesenheit von Druck. Schritte 7 und 8 können zur Feinabstimmung sowohl die Form und die Abmessungen der Pipettenspitze wiederholt.
- Schalten Sie den Druck und während wies die Pipettenspitze in eine sichere Richtung, entfernen Sie die Pipette und legen Sie sie in einem sauberen Aufbewahrungsbox, wo sie vor Staub geschützt werden.
Sicherheitshinweis: Wenn der Luftdruck nicht ausgeschaltet ist, die Pipette aus dem Pipettenhalter beim Entfernen ausgeworfen werden.
Hinweise zu den microforge
Wir verwenden eine microforge von off-the-shelf handelsüblichen Teilen zusammengesetzt. (Sie können auch ein Druck-Polierset von wenigen Unternehmen, zB ALA Science, GlassWorx). Unabhängig von der microforge, ist es wichtig, Optik, die gut genug, um die Spitze Öffnung, die oft nur wenigen Mikrometern Durchmesser zu sehen sind, haben. Wir verwenden eine lange Arbeitsabstand 100x-Objektiv für diesen Zweck. Auch Mantel der Politur Spule mit hoher Schmelztemperatur Glas zur Minimierung der Hinterlegung verdampft Metall auf der Pipetten.
Teil 3: Erwartete Ergebnisse
Moderate Druck Polieren ist die Beständigkeit von einer Pipette, ohne eine spürbare Veränderung in Öffnungsdurchmesser zu reduzieren. Falls gewünscht, kann dieses Protokoll verwendet, um Pipetten mit sub-Mikrometer-Öffnungen und Widerstände zwischen 5-10 M zu machen.