Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.
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Methodenartikel
Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kleinhirnrinde ist eine gut beschriebene Struktur, einzigartige Möglichkeiten zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften und Entwicklung 1,2 bietet. Von den Kleinhirn-Neuronen-Typen (Körnerzellen, Purkinje-Zellen und hemmenden Interneuronen), sind Nervenzellen Granulat bei weitem die meisten und sind die am häufigsten vorkommende Art von Neuronen im Gehirn von Säugetieren. Bei Nagetieren sind zerebelläre Nervenzellen Granulat während der ersten zwei postnatalen Wochen von Vorläuferzellen in der äußersten Schicht der Kleinhirnrinde, die externen Körnerschicht (EGL) generiert. Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt Techniken zu bereichern und Kultur Granulat Neuronen und ihre Vorläuferzellen aus postnatalen Maus Kleinhirn. Wir beschreiben Verfahren Kulturen von zunehmender Reinheit 3,4, die verwendet werden, um die Differenzierung von proliferierenden Vorläuferzellen in Nervenzellen Granulat 5,6-Studie zu erwirken. Sobald die Vorläuferzellen zu differenzieren, die Kulturen auch eine homogene Population von Nervenzellen Granulat für experimentelle Manipulation und Charakterisierung von Phänomenen wie Synaptogenese, Glutamat-Rezeptor-Funktion 7, Interaktion mit anderen gereinigt Kleinhirn Zellen 8,9 oder Zelle Death 7.
Protokoll
Teil 1: Einrichten (1-2 Tage vor Dissektion) (Nicht auf Video gezeigt)
- VORBEREITUNG Nährlösungen und Medien:
- 4X CMF-PBS-EDTA (Calcium und Magnesium free-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-EDTA für Percoll Verdünnungen): pro Liter, fügen Sie 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g Glucose, 2 g NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO 3 Lager, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) zu destilliertem / deionisiertem Wasser. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 Liter und der pH-Wert auf 7,4. Filter sterilisieren.
- HBSS-GLUCOSE: Add Glukose (6 Gramm / Liter), um Calcium und Magnesium freie Hanks Bilanz Salt Solution (HBSS) u....
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Diskussion
Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in der Vergangenheit 3,7,11 beschrieben worden sind, basiert. Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten wie unten diskutiert.
Die Nervenzellen Granulat-und Vorläuferzellen innerhalb von 2 Stunden plating halten. Gesunde Zellen haben einen runden Morphologie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop 4. Innerhalb von 24 Stunden nach dem Ausplattieren werden gesunde Zellen gleichmäßig verteilt auf der ganzen Deckgläser oder der Kunststoff gut und Prozesse bi.......
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Danksagungen
Wir danken Barbara Carletti und Anna Marie Kenney für wertvolle Anregungen. , DK07328: Hyl wird durch die Ausbildung Grant "Biochemie und Molekularbiologie Hormone" unterstützt. Unterstützte teilweise durch NIH 5R01 NS16951 (CAM).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zellfilter mit 70μm Maschenweite | BD Biosciences | 352350 | |
| Rückenmarknadel | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 Zoll |
| Poly-D-Lysin, Molekulargewicht>300.000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Jede neue Charge von Poly-D-Lysin muss getestet werden. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Muss frei von Kalzium und Magnesium sein. |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I-Zusatz | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 Serumfreier Zusatz (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12-mm-Runddeckgläser | Carolina Biological | 63-3029 | Diese werden in Deutschland von Deckgläser hergestellt. |
| 25-mm-Runddeckgläser | Carolina Biological | 63-3037 | Diese werden in Deutschland von Deckgläser hergestellt. |
| Papain-Dissociationssystem | Worthington Biochemical | LK 003150 | Das Kit reicht für fünf Isolationen. |
| Permaset-Scheren | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4-Loch-Kulturschale | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6-Loch-Kulturschale | Nalge Nunc international | 140685 |
Referenzen
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
