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Tests für gentechnisch veränderte Lebensmittel

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Testing For Genetically Modified Foods

1.3: Using GIS to Investigate Urban Forestry

1.15: Analysis of Earthworm Populations in Soil

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12:45 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Labors von Margaret Workman und Kimberly Frye – Depaul University

Gentechnische Veränderung von Lebensmitteln wurde ein kontroverses Thema diskutierten Gründen über Umwelt-und Arbeitsschutz. Dieses Experiment zeigt technisches Verständnis der wie Essen DNA genetisch identifiziert wird, zulassend Entscheidung machen über die Sicherheit und potenziellen Gefahren der Verwendung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) in Nahrungsmittel erzogen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um Lebensmittel DNA test für das Vorhandensein von gentechnisch veränderte DNA in Lebensmitteln zu verstärken. Vorhandensein von spezifischen DNA-Bänder detektiert mittels Gelelektrophorese extrahierten Nahrung DNA durch ein 3 % Agarosegel, eine Konzentration dicht genug, um den Bands von DNA mit der gentechnisch veränderten DNA trennen zu ziehen. Mehrere Steuerelemente werden im Elektrophorese-Verfahren verwendet, um DNA Test Lebensmittel (Werk Primer) erfolgreich entzogen und um bekannte Beispiele beider genetisch verändert DNA (gekauft gentechnisch veränderte DNA) zu gewährleisten und nicht gentechnisch veränderte DNA (zertifizierte GVO-Lebensmittelkontrolle gekauft).

Principles

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) identifiziert Sequenzen von DNA, die in der GV-Pflanze eingefügt wurden. Im Gegensatz zu Proteinen DNA ist ein relativ stabiles Molekül, so DNA-Fragmente von hoch verarbeiteten waren isoliert werden und sind ausreichend intakt durch PCR verstärkt werden. Gentechniker nur eine kleine Anzahl von regulatorischen Sequenzen (Promotor und Terminator-Sequenzen) verwenden, um die Expression der eingefügten Gene steuern, und so diese Sequenzen sind üblich, die Mehrheit von gv-Pflanzen. Die beiden Sequenzen identifiziert in diesem Verfahren sind zwei der häufigsten regulatorischen Sequenzen, 35 s-Promoter-gen aus Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV) und Nopaline-Synthase (NOS)-Terminator-gen aus Agrobacterium Tumefaciens.

PCR bezieht sich wiederholende Zyklen, jeweils bestehend aus Vorlage Denaturierung, Grundierung Glühen und Erweiterung des geglühten Primers von Taq -DNA-Polymerase. Nachdem DNA aus der Nahrung extrahiert wird, wird ein Thermocycler verwendet, um schnell manipulieren, Temperatur, verursacht die Phasen der PCR-Zyklen.

Die denaturierenden Phase tritt ein, wenn Proben auf 94 ° C, wodurch die DNA-Stränge zu trennen sich schnell erhitzt werden. Schnelle Abkühlung auf 59 ° C ermöglicht Zündkapseln Tempern, die getrennten DNA-Stränge, dann Erhitzen auf 72 ° C für Taq -DNA-Polymerase, die Primer, vollständige Kopien von jeder DNA-Strang und Abschluss einer thermischen Zyklus zu verlängern.

Die amplifizierte DNA kann dann durch eine Agarosegel mit Elektrophorese schieden die DNA in sichtbare Bänder für die Identifizierung des Gens 35 s-Promoter und der Nein-Terminator ausgeführt werden. Verstärkte DNA in Brunnen an einem Ende des Gels, geladen mit einem gekauften laden Farbstoff, der hilft, belasten die Probe Auflösung in den umliegenden Puffer zu verhindern. Der Laden-Farbstoff bietet auch einen visuellen, also die Bewegung der DNA kann gesehen werden, während der Elektrophorese in der Farbstoff “Front.” Die Elektrophorese funktioniert mit Hilfe eines elektrischen Stromes in Kathode und Anode enden getrennt. DNA in das Gel am Ende am nächsten an der Kathodenseite der Kammer geladen wird, und die negative Ladung der DNA zieht es in die Anode Ende des Saales und der Agarose durchgezogen ist. Größere Sequenzen von DNA (erhöhte Anzahl der Basenpaare) nicht so leicht durch Agarose bewegen und werden sich trennen früh, während die kleinere Sequenzen weiter unten das Gel in Richtung Anode Ende reisen können.

Ein Färbung Prozess hilft durch die Bindung an die DNA, um Kontrast zwischen dem Hintergrund Gel und den Ufern der DNA zur besseren Visualisierung der Ergebnisse hinzufügen. Zur Verfügung mit bekannter Orten für die verschiedenen Größen von DNA-Sequenzen, die jedes Gel Test für das Vorhandensein oder Fehlen der 35 s-Promoter und Nein-Terminator-Gene analysiert werden kann.

Steuerelemente werden verwendet, um sicherzustellen, dass DNS ordnungsgemäß extrahiert wird und einen Vergleich auf Lebensmittelproben zu ermöglichen. Gekaufte Pflanze Grundierung wird jede Probe zu Nukleinsäuren üblich, alle Pflanzen hinzugefügt. Dies ermöglicht eine Qualitätskontrolle auf die DNA-Extraktion, weil jede Pflanze extrahierte DNA während der PCR mit diesem Primer ausgedehnt werden und auch auf das Gel gesehen werden, sollte nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist. Gekaufte Primer für die 35 s und Nein Gene werden als Positivkontrolle verwendet, um DNA-Bänder auf dem Gel für die genetische Veränderung zur Verfügung zu stellen. Wenn das GVO-positiv-Vorlage-Steuerelement nicht verstärken wird, gibt es ein Problem mit der PCR-Reaktion und ein GVO-negatives Ergebnis aus der Test-Nahrung nicht vertraut werden kann. Auch ist ein zertifizierter GVO-Lebensmittel gekauft und als Negativkontrolle verwendet, um anzuzeigen, wie DNA Trennung aussieht, wenn kein gentechnisch verändertes Material vorhanden ist.

Procedure

(1) Extraktion von DNA aus Lebensmittelproben

500 µL der gekauften PCR Mischung Matrix hinzu kommt jeweils die 2 Schraubverschluss-Röhrchen mit eine Transferpipette oder 200-1.000 µL einstellbarer Lautstärke Mikropipette. Pipette rauf und runter mit dem Pipettieren zwischen jeder Aliquote gleichmäßig mischen die PCR-Matrix.
Beschriften Sie ein Schraubverschluss Röhrchen “GVO-freien” und “Test”.
0,5 g zertifizierten GVO-Lebensmittel Abwiegen und steckte es in den Mörtel.
2,5 mL destilliertem Wasser hinzugeben und Schleifen mit Pistill für 2 min um einen Brei zu bilden.
Fügen Sie eine weitere 2,5 mL destilliertem Wasser und weiter Schleifen mit Stößel bis Gülle glatt genug zu pipettieren wird.
Pipettieren 50 µL Boden Gülle, der Schraubverschluss-Röhrchen mit 500 µL des PCR-Vormischung mit der Bezeichnung “non-GMO” mit 50 µL Mark auf einem abgestuften pipettieren. Rohr zu rekapitulieren.
Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,6, die Probe Essen vorzubereiten.
Pipettieren 50 µL Boden Test Lebensmittel Gülle mit dem Schraubverschluss Rohr mit der Bezeichnung “test”. Rohr zu rekapitulieren.
Wirbel der GVO-Lebensmittel und Test-Röhren PCR für 1 min und Platz Rohre im Wasserbad 95 ° C für 5 min. Wenn keine Wirbel verfügbar ist, wechseln Sie das Rohr mehrmals um zu mischen vor dem Einlegen in Wasserbad.
Rohre in einer Zentrifuge für 5 min zu platzieren. Ein solide Pellet sollten an der Unterseite des Rohres bilden. Wenn die Pellets nicht nach 5 min, Zentrifuge wieder für 2 min Intervalle bis Pellet Formen gebildet wird.
Rohre können sofort für die PCR verwendet oder für bis zu 1 Woche im Kühlschrank gelagert.

2. Einrichten von PCR-Reaktionen

PCR-Röhrchen 1 – 6 Nummer und sie initial. Die Zahlen sollten folgende Rohr-Inhalte, die in Tabelle 1aufgeführten entsprechen.
Legen Sie jedes beschriftete PCR-Röhrchen in eine Reaktionscup Halterung mit Kappen offen.
Fügen Sie mithilfe einen frischesten Tipp für jede zusätzlich 20 µL des Primers an jedem PCR-Röhrchen auf Tabelle 1 angegeben. GAP-Röhren.
Fügen Sie mithilfe einen frischen Tipp für jedes Rohr 20 µL DNA-Probe auf Tabelle 1 angegeben, um jedes PCR-Röhrchen, dass auf jeden Fall nur aus der Überstand pipette und das solide Pellet am unteren Rand der Rohre zu vermeiden.
Nachdem jede DNA-Probe in das entsprechende PCR-Röhrchen pipettiert, verwenden Sie Pipette, um DNA und Grundierung mischen, indem Sie sanft auf und ab pipettieren; rekapitulieren Sie Röhren.
PCR-Röhrchen in Thermocycler und programmieren Sie der Cycler für:
Anfängliche denaturieren: 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min.
Verstärkung: 40 Zyklen bei 94 ° C für 1 min (denaturieren), 59 ° C für 1 min (Tempern) und 72 ° C für 2 min (Erweiterung).
Letzte Erweiterung: 1 Zyklus bei 72 ° C für 10 Minuten.
Halten: 4 ° C auf unbestimmte Zeit.

3. 3 % Agarose-Gel-Vorbereitung

Verwendung von Lab oder Klebeband, sicher Klebeband von der offenen Enden der Gel-Tiefziehschiene. Stellen Sie sicher, dass Klebeband an den Rändern des Fachs zu verhindern, dass flüssige Agarose Austritt verschlossen ist.
3 g Agarose in einen Erlenmeyerkolben 250 mL oder größeren abwiegen.
Hinzugeben Sie 100 mL 1 X TAE-Puffer (aus Konzentrat hergestellt oder gekauft).
Mit einer magnetischen Heizplatte mit Stir Bar, erhitzen Sie das Becherglas bis Agarose im Puffer vollständig aufgelöst und die Lösung kocht und Wendungen deutlich. Alternativ kann eine Mikrowelle verwendet werden, indem man Becher in Ofen und Heizung für 30 s Abständen, mit einem rühren Stab mischen alle 10 s, wiederholen, bis die Mischung kocht und Wendungen deutlich.
Kehren Sie ein 50-mL-Erlenmeyerkolben in die Öffnung des 250-mL-Flasche als ein Reflux, verhindert das Verdampfen Agarose-Lösung handeln.
Agarose-Lösung auf 60 ° C abkühlen lassen, und 30-50 mL in jede versiegelte Gel-Tiefziehschiene gießen.
Legen Sie einen Gel-Kamm in das erste paar der Kerben Gel Brunnen zu erstellen.
Lassen Sie das Gel vollständig abkühlen, bevor Sie die Band und Kamm entfernen. Gel wird zu festigen und drehen von klar zu trüben, wenn fertig, ca. 10-20 min.

4. die Elektrophorese der PCR-Produkte

Legen Sie eine vorgefertigte 3 % Agarosegel auf ein Gel-Tablett oder verwenden ein Gel-Tablett, das verwendet wurde, um eine gegossene 3 % Agarose-Gel gegossen.
Schieben Sie Gel-Tiefziehschiene in der Elektrophorese-Kammer mit dem Brunnen am nächsten an der Kathode (schwarz) Ende.
Gießen Sie 1 X TAE-Puffer in der Kammer genug Puffer über die Oberkante des Gel-Tiefziehschiene 2 mm haben.
Erhalten Sie PCR-Röhrchen aus dem Thermocycler und in Reaktionscup Halter.
Mit einem frischen Pipettenspitze jeweils, 10 µL des gekauften Orange G laden Farbstoff (LD), jede Probe hinzufügen und gut verrühren.
Last 20 µl des Herrschers Molekulargewicht und 20 µL jeder Probe in das Gel in der Reihenfolge angegeben (Tabelle 2).
Laufen Sie Gelelektrophorese für 30 min bei 100 V.
Entfernen Sie Gel-Tiefziehschiene aus Kammer und Dia-Gel aus Taskleiste entfernen. Legen Sie Gel in eine Färbung Fach.
Tauchen Sie Gel in gekauften DNA-Gel Fleck für 5 min, sorgfältig schütteln Tablett um den Fleck in das Gel verteilen.
Übertragen Sie das Gel in einen Behälter waschen und spülen Sie mit Wasser aus dem Wasserhahn (40-55 ° C) für ca. 10 s.
Destain durch Waschen 3 X in warmem Leitungswasser für 6 min mit sanft schütteln für optimale Ergebnisse zu erzielen. Falls erforderlich, weiter entfärben in warmem Wasser, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist.

Röhre Nummer	Grundierung	DNA-Probe
1	20 µL Pflanze Grundierung (grün)	20 µL Non-GMO Lebensmittelkontrolle DNA
2	20 µL GVO Grundierung (rot)	20 µL Non-GMO Lebensmittelkontrolle DNA
3	20 µL Pflanze Grundierung (grün)	20 µL Test Essen DNA
4	20 µL GVO Grundierung (rot)	20 µL Test Essen DNA
5	20 µL Pflanze Grundierung (grün)	20 µL GVO Positivkontrolle DNA
6	20 µL GVO Grundierung (rot)	20 µL GVO Positivkontrolle DNA

Tabelle 1. Liste der entsprechenden Röhre zahlen, Primer und DNA-Proben.

Gut 1	Probe 1 Non-GMO-Lebensmittelkontrolle mit Pflanze Primer 20 µL.
Gut 2	2 Non-GMO-Lebensmittelkontrolle mit GVO-Primer 20 µL Probe.
Gut 3	3 Test-Essen mit Pflanze Primer 20 µL Probe.
Nun 4	4 Test-Essen mit GVO-Primer 20 µL Probe.
Gut 5	Probieren Sie 5 GVO positive DNA mit Pflanze Primer 20 µL.
Gut 6	Probieren Sie 6 GVO positive DNA mit GVO-Primer 20 µL.
Gut 7	PCR Molekulargewicht Lineal 20 µL.
Gut 8	Lassen Sie leer.

Tabelle 2. Der richtigen Reihenfolge, 20 µL des Herrschers Molekulargewicht und 20 µL jeder Probe in das Gel zu laden.

Gentechnisch veränderte Lebensmittel sind Produkte, die enthalten eine Zutat oder Zutaten, deren DNA gezielt verändert worden ist. Vorhandensein dieser Modifikationen sind mit einer Technik namens Polymerasekettenreaktion nachweisbar.

Gentechnische Veränderung von Lebensmitteln wurde ein kontroverses Thema diskutierten Gründen über Umwelt-und Arbeitsschutz. Die Fähigkeit zur Erkennung genetisch veränderte DNA in Lebensmittelproben von Interesse ermöglicht fundierte Entscheidungen über die Sicherheit und potenziellen Gefahren der Verwendung von gentechnisch veränderten Organismen oder GVO, in der Nahrung liefert.

Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR wird verwendet, um Lebensmittel DNA zu bestimmen, das Vorhandensein oder Fehlen von genetisch veränderten Sequenzen zu verstärken. Gelelektrophorese dann zieht die amplifizierte DNA durch eine Agarose-Gel-Matrix und trennt die DNA-Banden unterschiedlicher Größe, die veränderten oder unveränderten Marker entsprechen. Diese sind dann im Vergleich zu Kontrolle Bands aus Lebensmitteln bekannt, dass GVO enthalten oder bekanntermaßen Änderung frei.

Dieses Video wird die Prinzipien hinter Erkennung genetisch veränderte DNA aus der Nahrung zu veranschaulichen, Proben, wie DNA extrahieren und Markierungen verwendet bei der gentechnischen Veränderung zu verstärken, und wie das Vorhandensein oder Fehlen von GVO in Lebensmittelproben etabliert werden kann.

Polymerase-Kettenreaktion identifiziert Sequenzen von DNA, die in der genetisch veränderte Lebensmittel eingefügt wurden. DNA ist ein relativ stabiles Molekül, so dass tragfähige DNA-Fragmente für Verstärkung geeignet isoliert werden können sogar aus hoch verarbeitete Güter wie Mais-Chips oder Gemüse Burger.
Eine kleine Anzahl von regulatorischen DNA-Sequenzen werden verwendet, um den Ausdruck der eingeführten Gene steuern, so dass diese Sequenzen bei den meisten von gv-Pflanzen sind. Dieses Verfahren identifiziert zwei der am häufigsten verwendeten, das 35 s-Promoter-gen und die Nopaline-Synthase-Terminator-gen. 35 s-Sequenz ist ein starker Förderer, und wenn eine eingefügte gen zugeordnet wird Laufwerk hohe Ebenen des Ausdrucks. Der Nopaline Synthase Terminator ist im Preis inbegriffen, Transkription des eingefügten Gens am gewünschten Endpunkt zu stoppen.

PCR bezieht sich wiederholende Heizen und kühlen Zyklen in einem Thermocycler, eine Maschine, die die Temperatur des PCR Reaktionsgefäße eng kontrolliert. Heizen der Probe auf 94 ° C bewirkt, dass DNA-Stränge zu denaturieren und trennen. Schnelle Kühlung zwischen 45 und 65 °C ermöglicht Primer an, die getrennten DNA-Stränge zu Tempern. Schließlich ermöglicht die Nacherwärmung auf 72 °C das Taq Polymerase Enzym, die Grundierungen und vollständige Vervielfältigung der Zielregion zu verlängern.

Gekaufte Pflanze Grundierung wird jede Probe hinzugefügt und in Proben, die Pflanzen-DNA verstärken. GVO-positivere-Vorlagen für 35 s und Nein dienen zur Positivkontrolle für GVO. Eine zertifizierte GVO-dient als Negativkontrolle. Wenn diese Kontrollreaktionen unerwartete Bands zeigen, vertrauenswürdig nicht die Ergebnisse der Proben.

Verstärkte DNA wird durch eine Agarosegel von Elektrophorese geführt. PCR-Produkte sind mit einem Farbstoff gemischt und in Brunnen geladen. DNA ist negativ geladen und beim Laden in das Gel an der Kathode Ende der Kammer bewegt sich in Richtung der Anode Ende wenn Strom angewendet wird. Größere DNA-Fragmente können nicht einfach durch das Gel Matrix also näher an der Kathode bleibt, während kleinere Sequenzen Ende Anode, wodurch Trennung von unterschiedlich großen DNA in unterschiedliche Banden bewegen bewegen.

Nach Elektrophorese hilft Gel Färbung getrennten DNA-Bänder zu visualisieren.

Nun, da wir die Prinzipien hinter GVO-Erkennung und die Verwendung von PCR und Gelelektrophorese für GVO-Kennzeichnung kennen, werfen Sie einen Blick auf wie diese im Labor durchgeführt werden können.

Sobald die Nahrungsmittel von Interesse identifiziert wurden, kann Analyse beginnen. Um die DNA zu extrahieren, nehmen Sie zwei saubere Schraubverschluss-Röhrchen, und in jedem der diese Übertragung 500 μL der gekauften DNA-Isolierung-Reagenz, achten Sie darauf, die Mischung auf und ab zwischen Aliquote gleichmäßig das Reagenz mischen pipette. Beschriften Sie eines der Rohre “GVO-freien” und “Test”.

Als nächstes 0,5 g zertifizierten GVO-Lebensmittel wiegen Sie ab, und legen Sie in einem sauberen Mörser. 2,5 mL destilliertem Wasser hinzugeben, und Schleifen mit dem Stößel für 2 min um einen Brei zu bilden. Eine weitere 2,5 mL destilliertem Wasser dazugeben und weiter, die Gülle zu Schleifen, bis es glatt genug, um die pipette wird.

Pipette 50 μL der bekannten GVO-Gülle auf den “non-GVO” Schraubverschluss-Röhrchen mit der DNA-Isolierung-Reagenz bezeichnet. Jetzt fügen Sie 50 μL Test Lebensmittel Probe Gülle mit dem Schraubverschluss Rohr “Test” gekennzeichnet hinzu. Wirbel die beiden Röhren mit Lebensmittelproben und DNA-Reagenz für 1 min. Als nächstes legen Sie die Rohre in einem Wasserbad bei 95 ° C für 5 min. Schließlich legen Sie die Rohre in einer Zentrifuge für 5 Minuten. Bei der Untersuchung sollte ein solide Pellet am Boden des Röhrchens gebildet werden. Wenn ein Pellet nicht nach 5 min, Zentrifuge wieder für 2 min Abständen bis ein Pellet-Formen gebildet wird. Proben können jetzt sofort für die PCR verwendet, oder für bis zu 1 Woche im Kühlschrank gelagert.

Erste, Nummer sechs PCR-Röhrchen. Diese Zahlen entsprechen den Rohr-Inhalt in der Tabelle aufgeführt. Legen Sie jedes beschriftete PCR-Rohre in einem Reaktionscup Halter mit Kappen offen.

Fügen Sie mithilfe einen frischesten Tipp für jede zusätzlich 20 μL Grundierung gemäß der Tabelle zu jedem PCR-Röhrchen. Als nächstes fügen Sie 20 μL der DNA Proben gemäß der Tabelle zu jedem PCR-Röhrchen. Pipette rauf und runter um zu mischen. Achten Sie für gebeizte Proben darauf, nur von der Überstand pipette und solide Pellet am unteren Rand der Rohre zu vermeiden. Zu guter Letzt legen Sie die PCR-Röhrchen in einem Thermocycler und programmieren Sie, die Heizung und Kühlung in der Tabelle angegebene Schritten durchlaufen.

Legen Sie eine 3 % Agarose-Gel in der Elektrophorese-Kammer mit dem Brunnen an der Kathode Ende am nächsten. Fügen Sie TAE Puffer in die Kammer um 2 mm über dem Gel-Fach zu decken. Sammle die PCR-Röhrchen von der Thermocycler und legen Sie sie in einem Reaktionscup Halter. Mit einem frischen Pipettenspitze jeweils, 10 μL der gekauften DNA Farbstoff zu jeder Probe laden hinzufügen und gut verrühren.

Mit einer frischen Spitze jedes Mal, laden Sie die Brunnen der Agarose-Gel mit 20 μl des Molekulargewichts Herrscher in einen Brunnen und 20 μL jeder Probe in folgenden Vertiefungen, wie in dieser Tabelle aufgeführt. Legen Sie die Elektrophorese-Kammer bei 100 V für 30 min laufen.

Sobald das Gel, läuft, sorgfältig abgeschlossen ist trennen Sie die Gel-Kammer, entfernen Sie das Fach, und schieben Sie das Gel in einem Färbung Tablett. Tauchen Sie das Gel in gekauften 100 x Gel Fleck für 5 min schütteln die Schale vorsichtig, um den Fleck zu verteilen. Sobald gebeizt, übertragen Sie das Gel in einen Behälter waschen und mit Leitungswasser spülen für ca. 10 S. Destain durch waschen dreimal in warmem Leitungswasser für 3 min jede, jede mit sanft schütteln für optimale Ergebnisse zu erzielen. Falls erforderlich, weiter entfärben in warmem Wasser, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist.

Das Vorhandensein oder Fehlen einer 200 bp-Band in Bahn 4 gibt an, ob der Test Lebensmittel GVO enthält. Die Pflanze-Primer bestimmen, ob Pflanzen-DNA aus der Probe erfolgreich extrahiert wurde. Das GVO-Lebensmittel-Steuerelement ist ein Indikator für falsch-positive Ergebnisse, falls sie eintreten. Wenn die GVO-Lebensmittelkontrolle herauskommt als positiv, es bedeutet die PCR zu einem bestimmten Zeitpunkt kontaminiert wurde. Das GVO-positiv-Vorlage-Steuerelement ist ein Indikator für falsche negative. Wenn das GVO-positiv-Vorlage-Steuerelement nicht verstärken wird, gibt es ein Problem mit der PCR-Reaktion und ein GVO-negatives Ergebnis aus der Test-Nahrung nicht vertraut werden kann.

Gele können platziert werden, auf einem weißen oder gelben Papier zu kontrastierenden Hintergrund, um DNA-Bänder zu markieren, oder stärkerem Kontrast erreicht werden, mit einem UV-Licht-Box.

Die Möglichkeit, Lebensmittel oder Produkte für gentechnisch veränderte Zutaten zu testen ist für eine Reihe von wissenschaftlichen oder behördliche Anwendungen relevant.

Es gibt einige Hinweise, dass transgener DNA aus gentechnisch veränderten Pflanzen Introgressed in den Genomen von wilden Ernte Populationen werden kann. Zum Beispiel können Bestäuber dieser Transfer durch Düngung Wildtyp Pflanzen mit Pollen von gentechnisch veränderten Quelle erleichtern. Dies ist ein Problem, da die Auswirkungen der Ausbreitung dieser eingefügten Gene auf das Ökosystem als Ganzes nicht gut verstanden werden. PCR-Tests der Wildpopulationen kann Daten auf dem Potenzial zu verbreiten, oder erfolgreiche Eindämmung der genetischen Einsätze bereitstellen.

Fehlende Kennzeichnung oder falsche Kennzeichnung von gentechnisch veränderten Inhaltsstoffen kann ein Verbraucher Anliegen sein. Dies ist möglicherweise aufgrund des Verbrauchers Präferenz des Konsums oder mögliche Einführung von Allergenen bei der GM, obwohl letzteres umstritten ist. In einigen Ländern müssen gentechnisch veränderte Zutaten auf Lebensmittelverpackungen aufgeführt werden. Regulatorischen Gremien in solchen Ländern können PCR Test überprüfen Sie die Richtigkeit der Kennzeichnung von Lebensmitteln verwenden.

Wo die gentechnische Veränderung führte zu einer Ernte Pestizid-Resistenz, verleiht haben einige Studien über die Produktion von “Super-Unkräuter” Bedenken. Diese können im Wesentlichen, jede Pflanze, die ursprünglich nicht für Änderungen, die die Resistenz gegen Pestizide durch Mechanismen wie Introgression oder Hybridisierung erhält gezielt sein. Diese Pflanzen können dann in der Lage, mehr erfolgreich zu verbreiten, und schwerer zu steuern als solche ohne den Einsatz. PCR-Tests für die genetische Veränderung kann helfen, hervorheben und verfolgen solche potenziellen Populationen um festzustellen, ob diese Ausbreitung als problematisch erweisen könnte.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Testing für GVO-Lebensmittel beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen die Prinzipien hinter Identifizierung von gentechnisch veränderten Lebensmitteln mittels PCR, gewusst wie: extrahieren und verstärken DNA aus der Nahrung und Gewusst wie: bestimmen, ob Ihre Schnupperprobe gentechnisch verändert wurde. Danke fürs Zuschauen!

Results

Nach Entfärben, können Gele analysiert werden, indem man Test Essen Bahnen (Tabelle 3) um festzustellen, ob die DNA-Bänder für die 35 s-Promoter und Nein-Terminator-Gene in den bekannten Orten auf dem Gel vorhanden sind. Platzieren das Gel auf ein UV-Licht-Box kann helfen, erhöhter Kontrast (Abbildung 1). Alternativ können Gele auf weißem oder gelbem Papier zu einem kontrastierenden Hintergrund markieren DNA-Bänder (Abbildung 2) platziert werden.

Abbildung 1: Ein destained Gel zeigt Bands der DNA getrennt. Agarose-Gel nach Agarose-Gelelektrophorese auf UV-Licht-Box.

Abbildung 2: Diagramm der bekannten Orten für die 35 s-Promoter und Nein Terminator DNA-. Das Vorhandensein oder Fehlen einer 200 bp-Bande in Spur 5 gibt an, ob der Test Lebensmittel GVO enthält.

Spur 1: Non-GVO-Lebensmittel mit Pflanze Primer	455 bp
Bahn 2: Non-GVO-Lebensmittel mit GVO-Primer	Keine band
Bahn 3: Test-Essen mit Pflanze Primer	455 bp
Bahn 4: Test-Essen mit GVO-Primer	200 bp oder kein Band
Bahn 5: GVO-positiv-Vorlage mit Pflanze Primer	455 bp
Bahn 6: GVO-positiv-Vorlage mit GVO-Primer	200 bp
Bahn 7: PCR Molekulargewicht Herrscher	1.000, 700, 500, 200, 100 bp

Tabelle 3. PCR-Band Stichprobengrößen (Basenpaare (bp)).

Applications and Summary

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um DNA, so dass für eine breite Palette von DNA-Labortests zu verstärken. Ein Bereich des Testens jetzt möglich mit PCR ist, GVO zu identifizieren, durch die Prüfung auf Vorhandensein oder Fehlen der DNA-Sequenzen verwendet in die gentechnische Veränderung von Nahrungsmitteln. In der Regel wird eine Ernte genetisch geändert, um einen Vorteil gegen natürliche Abschreckung für optimale Erträge, z.B. Schädlinge (Abbildung 3), Krankheiten, Trockenheit (Abbildung 4). Denn der Vorteil gewonnen wird, indem man genetisches Material aus einer anderen Spezies in der Ernte pflanzeneigenen DNA, wurden mögliche Gesundheits- und Umweltrisiken mit der Verwendung von GVO festgestellt. Ein Umweltbewusstsein ist die Fähigkeit der genetisch veränderten DNA unbeabsichtigt durch Bestäubung Prozesse führen zu gentechnisch veränderten DNA-Eintritt in das Genom von Pflanzen als non-GVO verkauft werden soll ausgetauscht werden.

Abbildung 3. Larven der Colorado-Käfer, fressen Blätter einer Kartoffel.

Abbildung 4. Mais durch Dürre zerstört.

Transcript

Genetically modified foods are products which contain an ingredient or ingredients whose DNA has been specifically altered. Presence of these modifications can be detected using a technique called the polymerase chain reaction.

Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated concerns over health and environmental safety. The ability to detect genetically altered DNA in food samples of interest allows for educated decision-making about the safety and potential dangers of using genetically modified organisms, or GMO’s, in food supplies.

The polymerase chain reaction, or PCR, is used to amplify food DNA to determine the presence or absence of genetically modified sequences. Gel electrophoresis then pulls the amplified DNA through an agarose gel matrix and separates DNA bands of different sizes that correspond to modified or non-modified markers. These are then compared to control bands from foods known to contain GMO’s, or known to be modification free.

This video will illustrate the principles behind detecting genetically modified DNA from food samples, how to extract DNA and amplify markers used in the genetic modification process, and how the presence or absence of GMO’s in food samples can be established.

Polymerase chain reaction identifies sequences of DNA that have been inserted into the genetically modified food. DNA is a relatively stable molecule, so viable DNA fragments suitable for amplification can be isolated even from highly processed goods, like corn chips or vegetable burgers. A small number of regulatory DNA sequences are used to control the expression of inserted genes, so these sequences are present in the majority of GM crops. This procedure identifies two of the most commonly used, the 35S promoter gene and the nopaline synthase terminator gene. The 35S sequence is a strong promoter, and when attached to an inserted gene will drive constant, high levels of expression. The nopaline synthase terminator is included to stop transcription of the inserted gene at the desired endpoint.

PCR involves repetitive heating and cooling cycles in a thermal cycler, a machine that tightly controls the temperature of PCR reaction tubes. Heating the sample to 94 °C causes DNA strands to denature and separate. Rapid cooling to between 45 and 65 °C allows primers to anneal to the separated DNA strands. Finally, reheating to 72 °C allows the Taq polymerase enzyme to extend the primers and complete duplication of the target region.

Purchased plant primer is added to each sample, and will amplify in samples containing plant DNA. GMO positive templates for 35S and NOS are used to provide a positive control for GMOs. A certified non-GMO is used as a negative control. If any of these control reactions show unexpected bands, the results of test samples cannot be trusted.

Amplified DNA is run through an agarose gel by electrophoresis. PCR products are mixed with a dye and loaded into wells. DNA is negatively charged, and when loaded into the gel at the cathode end of the chamber will move toward the anode end when current is applied. Larger DNA fragments cannot move as easily through the gel matrix so will stay closer to the cathode, while smaller sequences move toward the anode end, resulting in separation of differently sized DNA into distinct bands.

After electrophoresis, gel staining helps visualize separated DNA bands.

Now that we are familiar with the principles behind GMO detection and the use of PCR and electrophoresis for GMO identification, let’s take a look at how this can be carried out in the laboratory.

Once the food products of interest have been identified, analysis can begin. To extract the DNA, take two clean screwcap tubes, and into each of these transfer 500 μL of purchased DNA isolation reagent, making sure to pipette the mix up and down between aliquots to evenly mix the reagent. Label one of the tubes “non-GMO”, and the other “Test”.

Next, weigh out 0.5 g of certified non-GMO food, and place into a clean mortar. Add 2.5 mL of distilled water, and grind with the pestle for 2 min to form a slurry. Add another 2.5 mL distilled water and continue grinding the slurry until it becomes smooth enough to pipette.

Pipette 50 μL of the known non-GMO slurry to the “non-GMO” labeled screwcap tube containing the DNA isolation reagent. Now add 50 μL of the test food sample slurry to the screwcap tube marked “Test”. Vortex the two tubes containing the food samples and DNA reagent for 1 min. Next, place the tubes in a water bath at 95 °C for 5 min. Finally, place the tubes in a centrifuge for 5 min. Upon examination, a solid pellet should be formed at the bottom of the tube. If a pellet is not formed after 5 min, centrifuge again for 2-min intervals until a pellet forms. Samples can now be used immediately for PCR, or stored in a refrigerator for up to 1 week.

First, number six PCR tubes. These numbers will correspond to the tube contents listed in the Table. Place each of the labeled PCR tubes in a microtube holder with caps open.

Using a fresh tip for each addition, add 20 μL primer indicated in the Table to each PCR tube. Next, add 20 μL of the DNA samples indicated in the Table to each PCR tube. Pipette up and down to mix. For pelleted samples, be sure to pipette only from the supernatant, and avoid the solid pellet at the bottom of the tubes. Finally, place the PCR tubes into a thermal cycler and program it to cycle through the heating and cooling steps indicated in the table.

Place a 3% agarose gel into the electrophoresis chamber with the wells closest to the cathode end. Add TAE buffer into the chamber to cover 2 mm above the gel tray. Collect the PCR tubes from the thermocycler and place them in a microtube holder. Using a fresh pipette tip each time, add 10 μL of purchased DNA loading dye to each sample and mix well.

Using a fresh tip each time, load the wells of the agarose gel with 20 μL of molecular weight ruler into one well, and 20 μL of each sample into subsequent wells, as indicated in this table. Set the electrophoresis chamber to run at 100 V for 30 min.

Once the gel has finished running, carefully unplug the gel chamber, remove the tray, and slide the gel into a staining tray. Immerse the gel in purchased 100x gel stain for 5 min shaking the tray gently to distribute the stain. Once stained, transfer the gel into a washing container and rinse with tap water for approximately 10 s. Destain by washing three times in warm tap water for 3 min each, each with gentle shaking for best results. If necessary, continue destaining in warm water until the desired contrast is reached.

The presence or absence of a 200 bp band in lane 4 indicates whether the test food contains GMOs. The plant primers determine whether plant DNA was successfully extracted from the sample. The non-GMO food control is an indicator of false positive results, should they occur. If the non-GMO food control comes out as positive, it means the PCR was contaminated at some point. The GMO-positive template control is an indicator of false negatives. If the GMO-positive template control does not amplify, there is a problem with the PCR reaction and a GMO-negative result from the test food can’t be trusted.

Gels can be placed on a white or yellow paper to provide contrasting background to highlight DNA bands, or increased contrast can be achieved using a UV light box.

The ability to test foodstuffs or products for genetically modified ingredients is pertinent to a number of scientific or regulatory applications.

There is some evidence that transgenic DNA from genetically modified crops can become introgressed into the genomes of wild crop populations. For example, pollinators may facilitate this transfer by fertilizing wild-type plants with pollen from a genetically modified source. This is a concern, as the impacts of the spread of these inserted genes on ecosystems as a whole are not well understood. PCR testing of wild populations can provide data on the potential spread, or successful containment, of genetic inserts.

Lack of labeling, or incorrect labeling of genetically modified ingredients can be a consumer concern. This may be due to the consumer’s preference of consumption, or potential introduction of allergens during the GM process, though the latter is controversial. In some countries, genetically modified ingredients are required to be listed on food packaging. Regulatory boards in such countries may use PCR testing to check the accuracy of food labeling.

Where the genetic modification introduced to a crop confers pesticide resistance, some studies have raised concerns about the production of “super-weeds”. Essentially, these can be any plant not initially targeted for modification that obtains the resistance to pesticide through mechanisms such as introgression or hybridization. These plants may then be able to spread more successfully, and be harder to control than those without the insert. PCR testing for genetic modification can help to highlight and track such potential populations to determine if this spread could prove problematic.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Testing for GMO Foods. You should now understand the principles behind identifying genetically modified foods using PCR, how to extract and amplify DNA from food, and how to determine if your food sample has been genetically modified. Thanks for watching!

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