Erkennen von ökologischen Mikroorganismen mit der Polymerase-Kettenreaktion und Gelelektrophorese

Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR, ist eine grundlegende biologische Technik, die allgemein zur Detektion und Identifizierung von Mikroorganismen in Boden, Wasser und anderen Umweltproben angewendet wird.

Klassisch, sind Mikroorganismen, die in Laboren mit spezialisierten Wachstumsmedien kultiviert. Viele Mikroben in der natürlichen Umwelt sind jedoch “nicht kultivierbarer” – sie haben sehr geringe Stoffwechselaktivität oder Wachstumsrate, oder weil sie sehr strenge Wachstumsanforderungen haben, die möglicherweise nicht in der Kulturschale replizierbar. Die Unterschiede in der Culturability unter den Mikroben bedeuten auch, dass, wenn Mikroorganismen aus einer ökologischen Probe kultiviert werden, könnte ihre relative Häufigkeit in der Kultur nicht ihre tatsächlichen Niveaus in der Umgebung wider.

Das Aufkommen der PCR, die speziell auch kleine Mengen DNA in eine gemischte Probe verstärken können, macht es möglich, schnell erkennen und identifizieren bestimmte Mikroben von Interesse, auch diejenigen, die nicht-kultivierbare, komplexe Sortiment von Organismen in einem ökologischen Probe vorhanden sind.

Dieses Video führt die Grundsätze der PCR. Es wird dann ein allgemeines Protokoll für die Durchführung von PCR DNA isoliert von einer ökologischen Probe um das Vorhandensein eines Organismus von Interesse diskutiert. Schließlich werden einige Anwendungen der Mikrobe PCR-basierte Identifikation erkundet werden.

Die grundlegende Prämisse der PCR ist mit wiederholte Zyklen der sequentiellen Temperaturänderungen, exponentielle Amplifikation von DNA, in der Regel mit einer Maschine, bekannt als ein Thermocycler automatisch durchlaufen die unterschiedlichen Temperaturen zu erreichen. Die DNA-Synthese erfolgt durch DNA-Polymerase Enzyme, die von Bakterien leben in heißen Quellen, wie z. B. Thermus Aquaticus oder “Taq” bezogen werden. Diese Polymerasen sind hitzestabil, so dass sie die hohen Temperaturen während PCR verwendet.

Die Zielsequenz, bekannt als der Amplifikate wird aus der DNA-Vorlage mit zwei kurzen Abschnitten von Nukleotiden, bekannt als “Primer” verstärkt. Aufgrund der hohen Spezifität der komplementäre Nukleinsäure-Bindung erlauben die Primer für die gezielte Verstärkung der sehr spezifischen Reihenfolgen von Interesse. Durch die Gestaltung von Grundierungen, die nur eine eindeutige Sequenz oder eine einzigartige Kombination von Sequenzen aus dem Organismus des Interesses, verstärken werden kann PCR verwendet werden, differentiell auf das Vorhandensein des Organismus DNA unter allen präsentieren die genetischen Materials in einer komplexen Umwelt Probe zu erkennen.

Jedem PCR-Zyklus gliedert sich in drei Phasen. Die zuerst bekannt als “Denaturierung”, befindet sich in der Regel über 92 ° C und dauert ca. 30 S. Denaturierung wird verwendet, um DNA-Moleküle in Einzelstränge, erlauben die Verstärkung Reaktion auf gehen zu brechen.

Die zweite Phase, “Glühen”, befindet sich 2 bis 3 ° C unterhalb der unteren der Schmelztemperatur der beiden Primer, in der Regel zwischen 50 bis 65 ° C, und auch dauert ca. 30 S. schmelzende Temperatur ist die Temperatur, bei der 50 % der doppelsträngigen DNA Moleküle in Einzelstränge getrennt haben, und also mit dem Glühen Schritt können die Primer binden an ihre Ziel-Sites in der DNA-Vorlage.

Die dritte Phase eines PCR-Zyklus ist “Dehnung” oder “Erweiterung”, wenn die DNA-Polymerase an den Primer-Vorlage-Duplex bindet und katalysiert die Synthese der neuen Stränge. Bei 72 ° C für die am häufigsten verwendeten PCR Polymerase, Taq, die Dauer dieser Phase hängt die Länge der Amplifikate, in der Regel 30 s pro 500 Basenpaaren. Nach jedem Zyklus die amplifizierte DNA ist wieder einmal denaturiert und dient als eine neue Vorlage führt zu einem exponentiellen Anstieg in Höhe von PCR-Produkte.

Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, können die PCR-Produkte nach Größe auf einem “Gel” Polymer Agarose, auch als Elektrophorese bezeichnet in der Regel aus gelöst werden. Ein elektrisches Feld wird über das Gel angewendet, und die negativen Ladungen in das Rückgrat der DNA-Moleküle veranlassen, gegen positive Ende des Feldes zu migrieren. Im Allgemeinen werden lineare DNA-Moleküle, die größer sind, durch die Gelmatrix Reisen länger dauern.

Nun, da Sie Verständnis der Funktionsweise von PCR schauen wie die Reaktion verwendet werden kann, um Mikroorganismen in einer ökologischen Probe zu identifizieren.

Zunächst berechnen Sie das Volumen jedes Reagens benötigt basiert auf der Anzahl der Stichproben zu bearbeitenden plus zusätzliche 10 % Pipettieren Fehler ausmachen. Eine Positivkontrolle Vorlage – enthält die Zielregion – einfließen sollten sicherstellen, dass die Reaktion läuft; sowie eine Negative Kontrolle wo keine DNA-Vorlage enthalten, um eine Kontamination in keinem der Reaktionskomponenten auszuschließen ist. Halten Sie das Taq Polymerase Enzym auf Eis, und tauen Sie den Rest der Reagenzien und die DNA-Proben bei Raumtemperatur in einer dafür vorgesehenen Laminar-Flow Hood um Kontaminationen zu vermeiden.

Sobald alle Reagenzien aufgetaut haben, bilden Sie das Reagenz “master-Mix” indem man das berechnete Volumen jedes Reagens in ein Low-Bindung Microfuge Rohr, die wodurch Abweichungen in Reagenz Mengen aufgrund der Adsorption von Molekülen auf der Rohroberfläche minimiert wird. Sanft Wirbel und Zentrifugieren jedes Reagenz vor dem hinzufügen. Sobald der Master mix ist bereit, Wirbel zu mischen und durch Zentrifugation zu sammeln.

Beschriften Sie einen 8-Röhre PCR-Streifen um eine Röhre für jede Probe, einschließlich der Kontrollen festzulegen. Die entsprechende Menge an PCR-master-Mix in jedem Röhrchen des Streifens zu verzichten. Fügen Sie jede DNA-Probe mit dem jeweiligen Rohr.

Setzen Sie die Streifen Kappe sicher auf dem Streifen Rohr und Zentrifugieren Sie kurz in einer Mini-Zentrifuge mit einem Streifen-Adapter. Dann legen Sie das Rohr in den Thermocycler, und führen Sie die Reaktion nach dem entsprechenden PCR-Programm aus.

Während die PCR durchgeführt wird, bereiten Sie eine Agarosegel für die Elektrophorese der PCR-Produkte. Wiegen Sie, einen angemessenen Betrag von Agarose-Pulver für ein Gel mit einer Konzentration, die die PCR-Produkte basierend auf ihren erwarteten Größen lösen können. Fügen Sie die Agarose in einem 125-mL-Flasche, dann das entsprechende Volumen der Gel-laufen-Puffer in die Küvette, basierend auf dem Umfang des Gels gegossen, und Wirbel zu mischen. Die Agarose-Lösung mit hoher Leistung für 1 min Mikrowelle. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie sicher, dass die Agarose vollständig aufgelöst hat, durch Schütteln der Flasche und Mikrowelle in Schritten von 30s bei Bedarf wiederholen.

Fest die Kappe auf der Flasche zu sichern, und die Agarose-Lösung auf 50 ° C durch Schütteln der Flasche unter fließendem kalten Wasser abkühlen. Sobald Sie abgekühlt, fügen Sie 1 μL der Interkalation Bromid die Agarose hinzu. Da die Interkalation Bromid potenziell krebserregend ist, achten Sie darauf, persönlichen Schutzausrüstung wie Schutzbrille, einen Laborkittel und Interkalation Bromid beständige Handschuhe tragen.

Gießen Sie die Agarose-Lösung in eine Elektrophorese Gel-Casting-Tablett, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Agarose gefangen sind. Legen Sie einen Kamm mit der erforderlichen Anzahl von Brunnen in die Lösung. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur für 20 bis 30 min. zu festigen. Sobald das Gel festgelegt ist, entfernen Sie vorsichtig den Kamm, und achten Sie nicht auf das Gel in den Prozess zu reißen.

Legen Sie die erstarrte Gel in der Elektrophorese-Kammer. Fügen Sie LB Puffer in die Kammer, bis das Gel nur untergetaucht ist. Auf ein Stück Parafilm pipette ein “vor Ort” der DNA-Leiter einer geeigneten Palette für die erwartete Größe der PCR-Produkte. Die PCR-Rohre mit den abgeschlossenen Reaktionen aus der Thermocycler abrufen. Sammeln Sie Kondensate in den PCR-Röhrchen, indem Sie kurze Zentrifugation und fügen Sie 8 μL jeder Probe auf die Parafilm hinzu. Fügen Sie 2 μl 10 x Farbstoff in jedem Fleck von PCR-Produkt, laden, so dass die letztendliche Konzentration des Farbstoffs 2 X ist.

Laden Sie die Proben und die Leiter in die dafür vorgesehenen Vertiefungen im Agarosegel, ohne dabei durch das Gel stecken. Sobald die Beladung abgeschlossen ist, setzen auf dem Deckel der Elektrophorese-Kammer, und die Elektroden an die Stromversorgung anschließen. Da DNA negativ geladen ist und in Richtung der positiven Elektrode wandert, ist darauf zu achten, dass die Brunnen sind auf der Seite näher an der negativen Elektrode. Schalten Sie die Stromversorgung an, und setzen Sie ihn auf eine Spannung für die Größe der Elektrophorese-Kammer und der Puffersystem verwendet wird. Legen Sie die Elektrophorese zu “laufen”. Kleine Bläschen an den Seiten der Kammer bewegen werden eingehalten, wenn die Elektrophorese ordnungsgemäß verläuft.

Sobald Farbstoff vorne unten das Gel weit genug fortgeschritten ist, schalten Sie die Stromversorgung. Transportieren Sie sorgfältig das Gel, ein Gel-Imager, die electrophoresed Produkte zu visualisieren. Biegen Sie mit einem Schutzschild auf die UV-Licht und visualisieren Sie die DNA-Bänder auf dem Gel. Analysieren Sie die Position der Bands zu sehen, ob sie das erwartete Muster entspricht, das das Vorhandensein der Gattung des Interesses an der Umwelt Probe anzeigt.

Nun, Sie gesehen haben, wie PCR durchgeführt wird, betrachten wir verschiedene Möglichkeiten, die es gilt, Mikroorganismen des Interesses an der Umwelt zu erkennen.

Eine Verwendung von PCR-basierten Umwelt mikrobielle Erkennung ist krankheitsverursachende Organismen wie z. B. die “Gehirn-Essen Amöbe” identifizieren Naegleria Fowleri, einem einzelligen Organismus gefunden in frisches Wasser stellen und chlorierten Becken, das Nervensystem des Menschen oft tödlich angreifen kann. Das Vorhandensein von dieser tödlichen Mikrobe in entweder Wasserproben oder Liquor von verdächtigen Patienten kann durch PCR Zündkapseln, die auf einzigartige DNA-Sequenzen im Genom die Amöbe mit ausführen getestet werden.

Eine weitere Anwendung für PCR-basierter mikrobielle Identifizierung ist das Vorhandensein pathogener Bakterien im fliegen gefangen in der Nähe von Lebensmittelbetrieben, als Teil der öffentlichen Gesundheit Überwachung und Krankheit Ausbruch Untersuchungen geprüft.

Ermittler suchten hier, das Vorhandensein von pathogenen Bakterien wie Salmonellen und Listerien, durch Bakterien aus der Oberfläche des Körpers und den Verdauungskanal fliegen zunächst zu isolieren, und dann mit artspezifischen Kulturbedingungen für diese Arten von Interesse zu bereichern. Nach dem Extrahieren von DNA aus Bakterien, die gezüchtet wurden, im Handel erhältlichen artspezifische Erkennung PCR Kits diente, um ihre Identität zu testen.

Schließlich können verschiedene Stämme von Antibiotika-resistenten pathogene Bakterien wie Staphylococcus Aureus, die große öffentliche Gesundheit darstellen, identifiziert und differenziert mit PCR.

In diesem Beispiel Forschern isoliert und kultiviert S. Aureus von klinischen Proben, dann die Bakterienkolonien DNA entnommen und PCR durchgeführt. Die Amplifikationen hier waren “Multiplex”, was bedeutet, dass mehrere Primer Sätze gezielt verschiedene einzigartige Regionen des bakteriellen Genoms in die gleiche Reaktion kombiniert wurden. Einzelnen Grundierung Sätze wurden so konzipiert, dass PCR-Produkte von DNA nur einige Stämme, aber andere nicht, führen damit in Kombination, einzigartiges Produkt Band Muster für jede Belastung beobachtet wurden.

Sie haben nur Jupiters Video auf PCR-Basis Mikroorganismus Nachweis angesehen. Wir haben uns an die Grundsätze der Polymerase-Kettenreaktion; ein Protokoll für die Durchführung von PCR DNA extrahiert aus ökologischen Mikroorganismen; und zu guter Letzt mehrere spezifische Anwendungen dieser Technik für Organismen Interesse an verschiedenen Arten von Umwelt- oder klinischen Proben zu testen. Danke fürs Zuschauen!