2.7: Erkennen von ökologischen Mikroorganismen mit der Polymerase-Kettenreaktion und Gelelektrophorese

1. die Probenahme

1. Boden mit einer Schnecke zu sammeln oder Schaufel bis zu einer bestimmten Tiefe. Wenn Boden von der Rhizosphäre (die schmale Region des Bodens rund um und von Pflanzenwurzeln und ihre damit verbundenen Mikroben beeinflusst) sammeln, nur sammeln Sie direkt von rund um die Wurzeln der Pflanzen durch schlagen der Erde aus in ein Fass Sammlung.
2. Wasserprobe durch eine sterile Plastikflasche ins Wasser eintauchen, halten Sie das Ende des DIP Stick zu sammeln.

(2) Nukleinsäuren Gewinnung und Vorbereitung

1. Organismen und Viren aus der Probe zu sammeln, und DNA und RNA extrahieren. Einzelheiten hierzu finden Sie in der Jupiter Wissenschaftsbildung video-on-Gemeinschaft Nukleinsäure-Extraktion.
2. Speichern Sie die extrahierte DNA in beschrifteten Microfuge Röhren. Wenn die DNA über Nacht oder für längere Zeit gelagert werden muss, bei-20 ° C frieren Sie ein und tauen Sie der Rohre bei Raumtemperatur, wenn Sie bereit sind für den Einsatz auf.
3. Wenn das genetische Material untersucht werden ist RNA (ob es das Genom von RNA-Viren oder transkribierten RNA des zellulären Organismen ist), führen reversen Transkription (RT) auf die Probe um komplementäre DNA (cDNA) vor der PCR zu erstellen. Einzelheiten hierzu finden Sie in der Jupiter Wissenschaftsbildung video auf RT-PCR.

(3) Polymerase-Kettenreaktion

1. Das PCR-Enzym (z.B. Taq Polymerase) auf Eis legen und andere Reagenzien (PCR-Puffer, dNTPs, Primer) in einer dafür vorgesehenen "sauber" Kapuze bei Raumtemperatur auftauen. Das Enzym ist bei-20 ° C gelagert, aber nie friert. Es ist temperaturempfindlich, und muss so gehalten werden, Cool und seine Exposition auf Umgebungstemperatur minimiert
2. Berechnen Sie das Volumen jedes Reagens benötigt, um ein "master-Mix" alle Reagenzien, die konstant unter allen Reaktionen (Tabelle 1) sind zu machen. Stellen Sie sicher, positiv (z.B. eine Vorlage bekannt, dass die Zielregion enthalten) entfallen und negativ (z.B. keine Vorlage) Kontrollen in den Berechnungen. Das Endvolumen zu pipettieren Fehler entfallen fügen Sie zusätzlichen 10 % hinzu. Grundierung Volumen abhängig von Assays für die spezifische Organismen; beziehen sich auf Fachliteratur für die entsprechenden Werte.
3. Mit einer Low-Bindung Microfuge Schlauch, der das Anhaften von Reagenz-Moleküle die Kunststoffwände minimiert wird, fügen Sie die berechneten Mengen jedes Reagens zu den master-Mix zu montieren. Sanft Wirbel und Zentrifugieren jedes Reagenz vor dem hinzufügen. Sobald der Master mix ist bereit, Vortex mischen und sammeln durch Zentrifugation
4. 8-Röhre PCR-Streifen vorzubereiten. Benennen einer Röhre für jede Probe, positive und negative Kontrollen einschließlich
5. Das entsprechende Volumen der PCR Mischung in jedem Röhrchen des Streifens zu verzichten
6. Fügen Sie das entsprechende Volumen der DNA Schablone aus der Proben, sowie 5 μL der positiven Vorlage und 5 μL der molekularen Grade Wasser als Negativkontrolle, in die jeweiligen PCR-Röhrchen.
7. Setzen Sie die Kappe fest auf dem 8-Röhre Streifen und Zentrifuge für ein paar Sekunden mit einem minicentrifuge
8. Platz 8-Röhre Streifen in einem thermocycler
9. Legen Sie das entsprechende PCR-Programm auf den Thermocycler ausgeführt. Ein typisches Programm besteht aus den folgenden
   1. Denaturierung bei 94 ° C für 3 Minuten.
   2. 30-40 Zyklen der Verstärkung: Denaturierung bei 94 ° C für 30 s, Glühen bei Grundierung-spezifische Temperatur (in der Regel zwischen 50 – 60 ° C) für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 30 s / 500 bp.
   3. Letzte Verlängerung bei 72 ° C für ca. 7-10 min.

(4) Agarose-Gel-Vorbereitung

1. Basierend auf der gewünschten Gel Volumen und Gel-Konzentration (Tabelle 2), wiegen Sie die entsprechende Menge Agarose-Pulver in einer 125-mL-Erlenmeyerkolben.
2. Fügen Sie das entsprechende Volumen der Gel-laufen-Puffer in den Kolben, und wirbeln Sie den Kolben mit der hand.
3. Erhitzen Sie die Puffer-Agarose-Mischung in der Mikrowelle bei hoher Leistung für 1 min.
4. Entfernen Sie Kolben aus der Mikrowelle und von hand schwenken Sie, um sicherzustellen, dass die Agarose aufgelöst hat. Wenn die Agarose nicht vollständig aufgelöst hat, wiederholen Sie die Mikrowelle in Schritten von 30 s.
5. Kühlen Sie nach der Sicherung fest der Kappe auf der Flasche es auf 50 ° C durch Drehen unter fließendem kalten Wasser ab.
6. Die Agarose-Mischung mit einer Micropippette EtBr vorgesehenen fügen Sie 1 μL der Interkalation Bromid (EtBr hinzu). EtBr ist ein Farbstoff, der bindet doppelsträngiger Nukleinsäuren und fluoresziert Orange mit UV-Licht beleuchtet. Beachten Sie, dass EtBr potenziell krebserregend ist, so dass persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Kittel, beständige EtBr Handschuhe) getragen werden muss.
7. Gießen Sie die geschmolzene Gel in einer Elektrophorese Gel Casting Fach. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Agarose gefangen sind. Legen Sie einen Kamm in das Gel und sicher spannen. Warten Sie ca. 20-30 min für das Gel zu verfestigen.
8. Sobald das Gel verfestigt hat, entfernen Sie den Kamm vorsichtig, ohne dass Risse in das Gel. Der Kamm schafft Brunnen in das Gel für die Verladung der Proben.

5. die Gelelektrophorese

1. Legen Sie die erstarrten Agarosegel in der Elektrophorese-Kammer.
2. Fügen Sie den entsprechenden laufenden Puffer in die Kammer, bis das Gel kaum eingetaucht ist.
3. Auf ein Stück Parafilm pipette Flecken Farbstoff Konzentrat zu laden. Auch eine DNA-Leiter einer geeigneten Palette für die erwarteten Größen der PCR-Produkte. Alternativ verwenden Sie einen neuen Satz Microfuge Röhren, eine für jede Probe.
4. Nach Abschluss die PCR rufen Sie ab, dass 8-Röhre Streifen aus der Thermocycler und Zentrifugieren Sie kurz um Kondensate zu sammeln. Fügen Sie einem entsprechenden Volumen des DNA-Produkt laden Farbstoff und Pipette rauf und runter zu mischen hinzu. Zum Beispiel ist 8 µL der Probe zu einem Endvolumen von 10 µL, mit dem Farbstoff mit 1 X 2 µL 10 x laden Farbstoff beigemischt.
5. Pipette jeder Farbstoff-Sample-Mischung in die dafür vorgesehenen Vertiefungen im Agarosegel, darauf achten, nicht zu die Brunnen zu durchstechen.
6. Schließen Sie die Elektroden an die Elektrophorese-Kammer. DNA ist negativ geladen, so dass es "" in Richtung der positiven Elektrode läuft. Daher verbinden Sie die positive Elektrode auf die gegenüberliegende Seite der Kammer, wo die Brunnen geladen wurden. Legen Sie die Stromversorgung auf eine Spannung für das Puffersystem und Größe der Kammer Gel geeignet, und es laufen. Kleine Bläschen soll an den Seiten der Kammer bewegen, wenn die Elektrophorese ordnungsgemäß verläuft sichtbar sein.
7. Sobald Farbstoff vorne unten das Gel weit genug fortgeschritten ist, schalten Sie die Stromversorgung. Vorsichtig das Gel in die Transilluminator oder visuelle Imager zu transportieren und drehen auf die UV-Licht die DNA-Bänder auf dem Gel zu visualisieren.
8. Analysieren Sie die Bandgröße und Positionen auf dem Gel. Vergleichen Sie die Band-Positionen der Proben, die positive Kontrolle, ob DNA aus dem Organismus des Interesses in der Probe (Abbildung 1) vorhanden ist.

Tabelle 1. Reagenz Bände für die PCR master Mix. * Primer Volumen variieren je nach Organismus Assay. Die Lautstärke der molekularen Grade Wasser um die 45 μL Endvolumen zu machen. Mengen von anderen Komponenten sollten nicht variieren.

Tabelle 2. DNA-Fragment Größenbereiche optimal gelöst, indem verschiedene Agarose-Gel-Prozentsätze.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine grundlegende biologische Technik, die häufig zum Nachweis und zur Identifizierung von Mikroorganismen in Boden-, Wasser- und anderen Umweltproben eingesetzt wird.

Klassischerweise werden Mikroorganismen in Laboren mit speziellen Wachstumsmedien kultiviert. Viele Mikroben in der natürlichen Umwelt sind jedoch "nicht kultivierbar" - entweder weil sie eine sehr geringe Stoffwechselaktivität oder Wachstumsrate aufweisen oder weil sie sehr strenge Wachstumsanforderungen haben, die in einer Kulturschale möglicherweise nicht repliziert werden können. Die Unterschiede in der Kultivierbarkeit zwischen Mikroben bedeuten auch, dass bei der Kultivierung von Mikroorganismen aus einer Umweltprobe ihre relative Häufigkeit in Kultur möglicherweise nicht ihre tatsächlichen Werte in der Umwelt widerspiegelt.

Das Aufkommen der PCR, mit der selbst kleine Mengen an DNA, die in einer gemischten Probe vorhanden sind, spezifisch amplifiziert werden können, ermöglicht den schnellen Nachweis und die Identifizierung spezifischer Mikroben von Interesse, auch solcher, die nicht kultivierbar sind, innerhalb des komplexen Sortiments von Organismen, die in einer Umweltprobe vorhanden sind.

In diesem Video werden die Prinzipien der PCR vorgestellt. Anschließend wird ein allgemeines Protokoll für die Durchführung von PCR an DNA diskutiert, die aus einer Umweltprobe isoliert wurde, um das Vorhandensein eines Organismus von Interesse nachzuweisen. Schließlich werden verschiedene Anwendungen der PCR-basierten Mikrobenidentifizierung untersucht.

Die Grundprämisse der PCR besteht darin, wiederholte Zyklen sequenzieller Temperaturänderungen zu verwenden, um eine exponentielle Amplifikation der DNA zu erreichen, in der Regel mit einer Maschine, die als Thermocycler bekannt ist, um die verschiedenen Temperaturen automatisch zu durchlaufen. Die DNA-Synthese erfolgt durch DNA-Polymerase-Enzyme, die aus Bakterien gewonnen werden, die in heißen Quellen wie Thermus aquaticus oder "Taq" leben. Diese Polymerasen sind hitzestabil, so dass sie den hohen Temperaturen standhalten, die bei der PCR verwendet werden.

Die Zielsequenz, das sogenannte Amplicon, wird aus dem DNA-Template mit zwei kurzen Nukleotidabschnitten, den sogenannten "Primern", amplifiziert. Aufgrund der hohen Spezifität der komplementären Nukleinsäurebindung ermöglichen die Primer die gezielte Amplifikation sehr spezifischer Sequenzen von Interesse. Durch die Entwicklung von Primern, die nur eine einzigartige Sequenz oder eine einzigartige Kombination von Sequenzen eines interessierenden Organismus amplifizieren, kann die PCR verwendet werden, um das Vorhandensein der DNA dieses Organismus unter allen genetischen Materialien, die in einer komplexen Umweltprobe vorhanden sind, unterschiedlich nachzuweisen.

Jeder PCR-Zyklus ist in drei Phasen unterteilt. Die erste, die als "Denaturierung" bekannt ist, wird normalerweise über 92 ? C und dauert ca. 30 s. Die Denaturierung wird verwendet, um DNA-Moleküle in Einzelstränge zu zerlegen, damit die Amplifikationsreaktion ablaufen kann.

Die zweite Phase, das "Glühen", wird von 2 bis 3 ? C unter dem unteren Wert der Schmelztemperatur der beiden Primer, in der Regel zwischen 50 und 65 ? C und dauert ebenfalls etwa 30 s. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der sich 50 % der doppelsträngigen DNA-Moleküle in Einzelstränge getrennt haben, und so ermöglicht der Annealing-Schritt den Primern, an ihre Zielstellen im DNA-Template zu binden.

Die dritte Phase eines PCR-Zyklus ist die "Elongation" oder "Extension", wenn die DNA-Polymerase an den Primer-Template-Duplex bindet und die Synthese der neuen Stränge katalysiert. Auf 72 ? C für die am häufigsten verwendete PCR-Polymerase, Taq, hängt die Dauer dieser Phase von der Länge des Amplikons ab, in der Regel 30 s pro 500 Basenpaare. Nach jedem Zyklus wird die amplifizierte DNA erneut denaturiert und dient als neue Vorlage, was zu einem exponentiellen Anstieg der Menge an PCR-Produkten führt.

Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, können die PCR-Produkte auf einem "Gel", das normalerweise aus dem Polymer Agarose besteht, nach Größe aufgelöst werden, ein Prozess, der als Elektrophorese bekannt ist. Ein elektrisches Feld wird über das Gel angelegt, und die negativen Ladungen im Rückgrat der DNA-Moleküle bewirken, dass sie zum positiven Ende des Feldes wandern. Im Allgemeinen brauchen lineare DNA-Moleküle, die größer sind, länger, um durch die Gelmatrix zu wandern.

Nachdem Sie nun verstanden haben, wie die PCR funktioniert, werfen wir einen Blick darauf, wie die Reaktion zur Identifizierung von Mikroorganismen in einer Umweltprobe verwendet werden kann.

Berechnen Sie zunächst das Volumen jedes benötigten Reagenzes basierend auf der Anzahl der zu verarbeitenden Proben zuzüglich zusätzlicher 10 %, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Eine Positivkontrollschablone, die die Zielregion enthält, sollte beigefügt werden, um sicherzustellen, dass die Reaktion funktioniert. sowie eine Negativkontrolle, bei der kein DNA-Template enthalten ist, um eine Kontamination in einer der Reaktionskomponenten auszuschließen. Bewahren Sie das Taq-Polymerase-Enzym auf Eis auf und tauen Sie den Rest der Reagenzien und die DNA-Proben bei Raumtemperatur an einer dafür vorgesehenen Laminar-Flow-Haube auf, um eine Kontamination zu vermeiden.

Sobald alle Reagenzien aufgetaut sind, bilden Sie den "Mastermix" des Reagenzes, indem Sie das berechnete Volumen jedes Reagenzes in ein Mikrofugenröhrchen mit geringer Bindung geben, wodurch Diskrepanzen in den Reagenzienmengen aufgrund der Adsorption von Molekülen an der Röhrchenoberfläche minimiert werden. Jedes Reagenz vor der Zugabe vorsichtig vortexen und zentrifugieren. Sobald der Mastermix vorbereitet ist, wird der Wirbel zum Mischen und Sammeln durch Zentrifugation vortexen.

Beschriften Sie einen PCR-Streifen mit 8 Röhrchen, um ein Röhrchen für jede Probe, einschließlich der Kontrollen, zu bestimmen. Geben Sie die entsprechende Menge PCR-Mastermix in jedes Röhrchen des Streifens. Geben Sie dann jede DNA-Probe in das jeweilige Röhrchen.

Setzen Sie die Streifenkappe fest auf das Streifenröhrchen und zentrifugieren Sie kurz in einer Mini-Zentrifuge mit einem Streifenadapter. Legen Sie dann das Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie die Reaktion gemäß dem entsprechenden PCR-Programm durch.

Während der PCR wird ein Agarose-Gel für die Elektrophorese der PCR-Produkte vorbereitet. Wiegen Sie eine angemessene Menge Agarosepulver für ein Gel mit einer Konzentration ab, die die PCR-Produkte basierend auf ihren erwarteten Größen auflösen kann. Geben Sie die Agarose in einen 125-ml-Kolben, geben Sie dann das entsprechende Volumen des Gel-Laufpuffers in den Kolben, basierend auf dem Volumen des Gels, und schwenken Sie sie, um sie zu mischen. Die Agaroselösung 1 Minute lang bei hoher Leistung in die Mikrowelle stellen. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie, ob sich die Agarose vollständig aufgelöst hat, indem Sie den Kolben schwenken, und wiederholen Sie das Mikrowellenmahlen bei Bedarf in 30-s-Schritten.

Befestigen Sie die Kappe fest auf dem Kolben und kühlen Sie die Agaroselösung auf 50 μm ab. C durch Schwenken des Kolbens unter fließendem kaltem Wasser. Nach dem Abkühlen 1 ? L von Ethidiumbromid an die Agarose. Da Ethidiumbromid potenziell krebserregend ist, tragen Sie unbedingt persönliche Schutzausrüstung wie Schutzbrille, einen Laborkittel und Ethidiumbromid-beständige Handschuhe.

Gießen Sie die Agaroselösung in eine Elektrophorese-Gel-Gießschale und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in der Agarose eingeschlossen sind. Legen Sie einen Kamm mit der erforderlichen Anzahl von Vertiefungen in die Lösung. Lassen Sie das Gel 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, damit es fest wird. Sobald das Gel fest ist, entfernen Sie vorsichtig den Kamm und achten Sie darauf, dass das Gel dabei nicht zerreißt.

Geben Sie das erstarrte Gel in die Elektrophoresekammer. Geben Sie LB-Puffer in die Kammer, bis das Gel gerade untergetaucht ist. Pipettieren Sie auf ein Stück Parafilm einen "Fleck" DNA-Leiter in einem Bereich, der für die erwartete Größe der PCR-Produkte geeignet ist. Entnehmen Sie die PCR-Röhrchen mit den abgeschlossenen Reaktionen aus dem Thermocycler. Sammeln Sie Kondensate in den PCR-Röhrchen durch kurze Zentrifugation und fügen Sie 8 ? L jeder Probe auf den Parafilm. Addieren Sie 2 ? L von 10x Ladefarbstoff in jede Stelle des PCR-Produkts, so dass die Endkonzentration des Farbstoffs 2x beträgt.

Laden Sie die Proben und die Leiter in die dafür vorgesehenen Vertiefungen im Agarosegel, wobei Sie darauf achten, dass Sie nicht durch das Gel stechen. Sobald die Beladung abgeschlossen ist, setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer und schließen Sie die Elektroden an die Stromversorgung an. Da die DNA negativ geladen ist und zur positiven Elektrode wandert, stellen Sie sicher, dass sich die Vertiefungen auf der Seite befinden, die näher an der negativen Elektrode liegt. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie es auf eine Spannung ein, die der Größe der Elektrophoresekammer und des verwendeten Puffersystems entspricht. Stellen Sie die Elektrophorese auf "Run". Kleine Blasen, die sich an den Seiten der Kammer nach oben bewegen, werden beobachtet, wenn die Elektrophorese ordnungsgemäß verläuft.

Sobald die Farbstofffront weit genug nach unten vorgedrungen ist, schalte die Stromversorgung aus. Transportieren Sie das Gel vorsichtig zu einem Gel-Imager, um die elektrophoresierten Produkte zu visualisieren. Schalten Sie mit einem Schutzschild das UV-Licht ein und visualisieren Sie die DNA-Banden auf dem Gel. Analysieren Sie die Position der Banden, um festzustellen, ob sie mit dem erwarteten Muster übereinstimmt, das auf das Vorhandensein der interessierenden Spezies in der Umweltprobe hinweist.

Nachdem Sie nun gesehen haben, wie PCR durchgeführt wird, schauen wir uns verschiedene Möglichkeiten an, wie sie zum Nachweis von Mikroorganismen von Interesse in der Umwelt eingesetzt wird.

Eine Anwendung des PCR-basierten mikrobiellen Nachweises in der Umwelt besteht darin, krankheitserregende Organismen wie die "gehirnfressende Amöbe" Naegleria fowleri zu identifizieren, einen einzelligen Organismus, der in Süßwasserkörpern und ungechlorten Becken vorkommt und das menschliche Nervensystem angreifen kann, oft tödlich. Das Vorhandensein dieser tödlichen Mikrobe in Wasserproben oder in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Verdacht kann durch PCR mit Primern getestet werden, die auf einzigartige DNA-Sequenzen im Genom der Amöbe abzielen.

Eine weitere Anwendung für die PCR-basierte mikrobielle Identifizierung ist die Untersuchung auf das Vorhandensein pathogener Bakterien in Fliegen, die in der Nähe von Lebensmittelbetrieben gefangen werden, im Rahmen der Überwachung der öffentlichen Gesundheit und der Untersuchung von Krankheitsausbrüchen.

Hier suchten die Forscher nach dem Vorhandensein von pathogenen Bakterien wie Salmonellen und Listerien, indem sie zunächst Bakterien sowohl von der Körperoberfläche als auch vom Verdauungskanal von Fliegen isolierten und dann artspezifische Kulturbedingungen verwendeten, um diese interessierenden Arten anzureichern. Nach der Extraktion von DNA aus kultivierten Bakterien wurden kommerziell erhältliche speziesspezifische Nachweis-PCR-Kits verwendet, um ihre Identität zu testen.

Schließlich können verschiedene Stämme antibiotikaresistenter pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus, die ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit darstellen, mittels PCR identifiziert und unterschieden werden.

In diesem Beispiel isolierten und kultivierten die Forscher S. aureus aus klinischen Proben, extrahierten dann DNA aus den Bakterienkolonien und führten eine PCR durch. Die Amplifikationsreaktionen wurden hier "gemultiplext", was bedeutet, dass mehrere Primer-Sets, die auf verschiedene einzigartige Regionen des bakteriellen Genoms abzielen, in derselben Reaktion kombiniert wurden. Individuelle Primer-Sets wurden so konzipiert, dass PCR-Produkte nur aus der DNA einiger Stämme resultieren, andere jedoch nicht, so dass in Kombination für jeden Stamm einzigartige Produktbandenmuster beobachtet wurden.

Sie haben gerade das Video von JoVE über den PCR-basierten Nachweis von Mikroorganismen gesehen. Wir haben uns die Prinzipien hinter der Polymerase-Kettenreaktion angesehen. ein Protokoll für die Durchführung der PCR an DNA, die aus Umweltmikroorganismen extrahiert wurde; und schließlich mehrere spezifische Anwendungen dieser Technik, um in verschiedenen Arten von Umwelt- oder klinischen Proben auf Organismen von Interesse zu testen. Danke fürs Zuschauen!