Die Analyse der physiologischen E-Selectin-vermittelte Leukozyten-Rolling auf mikrovaskuläre Endothel

Dieses Video zeigt die Analyse der parallelen Plattendurchflusskammer, um die Faktoren zu untersuchen, die das Rollen von Leukozyten auf Endothelzelloberflächen auslösen. Endothelzell-Monoschichten werden mit dem proinflammatorischen Zytokin IL one beta stimuliert, um die S-Selektin-Expression hochzuregulieren. Die parallele Plattenströmungskammer wird dann über die Endothelzellen gelegt und S-Selektin-positive Leukozyten werden über die Monoschicht infundiert.

Die zellulären Wechselwirkungen in der Kammer sind also mit einer schieren Belastung verbunden, die der bei der postkapillären Leukozytenadhäsion ähnelt. Rollierende Ereignisse werden mithilfe von NIS-Elementen erfasst und aufgelistet und auf E-Select-Unabhängigkeit getestet. Hallo, ich bin George Weis im Labor von Dr. Charles de Nitro in der Abteilung für Dermatologie am Brigman Women's Hospital der Harvard Medical School.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse der Rolle von E-Selektin, E-Selektin-Liganden bei der Adhäsion menschlicher Leukozyten an menschliche Knochenmark-Endothelzellen unter physiologischen Blutflussbedingungen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Rolle von Zelloberflächenmolekülen zu untersuchen, die die Adhäsion von weißen Blutkörperchen oder metastasierenden Krebszellen an Endothelzellen initiieren, die die innere Oberfläche von Blutgefäßen auskleiden. Dieses adhäsive Ereignis zeichnet sich durch ein Rollverhalten aus, wie wenn eine Bowlingkugel eine Bahn hinunterrollt.

Also lasst uns loslegen. Der erste Schritt in diesem Verfahren ist die Vorbereitung der Endothelzellen, die die Flusskammer auskleiden werden. Dieses Protokoll verwendet H-B-M-E-C 60-Zellen, die aus menschlichem Knochenmark gewonnen werden.

Kulturschalen für Mikrogefäße sollten mit Fibronektin vorbeschichtet werden, um diese 35-Milliliter-Gewebekulturschalen mit PBS zu inkubieren, die 20 Mikrogramm Fibronektin pro Monat enthalten. Diese können über Nacht bei vier Grad Celsius oder drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Suspendieren Sie H-B-M-E-C 60 Zellen in Medium 1 99 und säen Sie 10 bis fünfte Zellen pro Schale, züchten Sie die Kulturen auf über 90% Konfluenz.

Dies wird etwa zwei Tage dauern, um das Wachstumsmedium hochzuregulieren, auszuwählen und zu exprimieren, das Wachstumsmedium zu aspirieren und frisches Medium mit 50 Nanogramm pro mill IL hinzuzufügen, ein Beta-Inkubat für vier bis sechs Stunden. Die Zellmonoschichten sind nun bereit für den Durchflusskammer-Assay. Zusätzliche Platten mit H-B-M-E-C 60-Zellen können mit IL one beta stimuliert und mit neutralisierendem Anti-Human-E-Selektin-Antikörper bei 20 Mikrogramm pro Monat für eine Stunde bei 37 Grad Celsius behandelt werden.

Dies steuert die funktionelle Expression von e-Selektin. Bereiten Sie als Nächstes die e-Selektin-positiven Leukozyten vor. Dabei handelt es sich um KG one und humane hämatopoetische Vorläuferzellen.

Diese werden in Suspension zu Konfluenz gezüchtet oder tendieren zu den sechs Zellen pro Monat in RPMI 1640. Die KG one A-Zellen können direkt aus der Kultur pipettiert und auf einem Hämozytometer gezählt werden. Die Reanimation suspendiert die Zellen bei 10 bis sechs Zellen pro Mil in HBSS mit 10 Millimolar Hep oder HH-Puffer, der zwei Millimolare Calciumchlorid enthält.

Lagern Sie die Zellen auf Eis, bis sie untersucht werden. Die nächsten Schritte umfassen die Vorbereitung des Mikroskops, der Parallelplatten-Durchflusskammer und der Spritzenpumpe. Schalten Sie für den Assay das Mikroskop und die Spritzenpumpe ein.

Wählen Sie das 10-fach-Objektiv am Mikroskop aus. Legen Sie ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen in den Halter und füllen Sie es mit HH-Puffer mit zwei Millimolaren Calciumchlorid. Legen Sie dann fünf Milliliter Reagenzgläser aus Kunststoff in die Halterung darunter.

Geben Sie anschließend eine 60-Milliliter-Spritze in die Spritzenpumpe. Vergewissern Sie sich, dass sowohl der Kolben als auch der Körper der Spritze fest sitzen. Befestigen Sie einen Drei-Wege-Absperrhahn am Ende der 60-Mil-Spritze und dann eine Fünf-Mil-Spritze am Drei-Wege-Absperrhahn.

Platzieren Sie die Parallelströmungskammerapparatur auf dem Mikroskoptisch, mit dem Eingangsrohr auf der rechten Seite, dem Ausgangsrohr auf der linken Seite und der Vakuumröhre auf der Rückseite. Nachdem der Schlauch an das Vakuum angeschlossen wurde, öffnen Sie das Luftventil, damit die Parallelplattenvorrichtung am Tisch haften kann. Dadurch wird geprüft, ob die Vakuumschürze an der Durchflusskammer luftdicht ist.

Wenn die Dichtung bestätigt ist, schalten Sie das Luftventil aus. Befestigen Sie nun die Ausgangsschlauchleitung an dem Dreiwege-Absperrhahn, der bereits mit der Spritze verbunden ist. Die Apparatur kann nun über die H-B-M-E-C 60 Zellen gelegt werden.

Schalten Sie das Vakuum ein, senken Sie das Durchflusskammergerät vorsichtig auf die Platte ab und lassen Sie das Gerät nach unten saugen. Es sollten keine Geräusche von entweichender Luft zu hören sein, und an dieser Stelle müssen Sie möglicherweise Druck auf die Kammer ausüben, um die Gummidichtung zusammenzudrücken. Sobald das Vakuum hergestellt ist, setzen Sie das Eingangsrohr in das konische 50-Milliliter-Rohr ein.

Öffnen Sie den Dreiwege-Absperrhahn zur 60-mil-Spritze und versetzen Sie die Pumpe in den Pumpenmodus, um Luft aus den Leitungen zu entfernen, ohne die Zellen auf der Platte anzuheben. Verwenden Sie die Spritzenpumpe mit zwei mil pro Minute, um den Ansaugschlauch zu füllen. Stellen Sie dann schnell auf 0,5 mils pro Minute ein.

Kurz bevor die Flüssigkeit das Gerät erreicht, ist es wichtig, das Setup sorgfältig zu grundieren und Luftblasen zu vermeiden, die die Monoschicht von der Platte abheben. Sobald die Flüssigkeit in die 60-mil-Spritze gelangt, werden die Durchflusskammer und die Spritzenpumpe angesaugt. Sichern Sie nun den Durchfluss in der Kammer mit einem Stück Klebeband über jeder der Eingangs-, Ausgangs- und Vakuumleitungen.

Dadurch wird sichergestellt, dass das Sichtfeld bei der Visualisierung und Erfassung der Daten konstant bleibt. Die Strömungskammer ist nun einsatzbereit. Diese Schritte sollten für jeden Zelleingabelauf und für jede neue Platte wiederholt werden.

Um fortlaufende Ereignisse der Lucas-Website zu erfassen, öffnen Sie NIS-Elemente auf dem Desktop, und drücken Sie auf das Wiedergabesymbol, um ein Livebild anzuzeigen. Die automatische Belichtung ermöglicht es Ihnen, die Platte zu sehen und das Bild zu fokussieren. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop richtig auf die Zellmonoschicht fokussiert ist, indem Sie den Fokus manuell am Mikroskop einstellen.

Sobald das Bild scharf ist, setzen Sie die Belichtung auf ein Bild pro Sekunde zurück und passen Sie das Licht am Mikroskop an. Das Bild sollte auf dem Computer erscheinen und im Mikroskop nicht mehr sichtbar sein. Das Lichthistogramm kann dann angepasst werden. Um die Hintergrundbelichtung zu entfernen oder die Klarheit der Zellen zu verbessern, klicken Sie auf zwei mal zwei Bins oder Live-Bin, um ein Bild zu erhalten, das sich ideal für die Aufnahme von Filmen eignet.

Klicken Sie in der Menüleiste auf das Makro und wählen Sie rechts zum Port, wählen Sie Port com drei und öffnen Sie es. Dadurch wird der Anschluss geöffnet, um sich mit der Spritzenpumpe zu koordinieren. Die Durchflusskammer ist nun bereit für die Infusion mit KG one A-Zellen, pipettieren Sie eine mil KG one A S-Suspension in das fünf mil Reagenzglas in der Nähe der Eingangsschlauchleitung.

Platzieren Sie dann die Eingangsleitung an der Unterseite des Reagenzglases. Gehen Sie zur Menüleiste und klicken Sie auf Aufnahme und Zeitrafferaufnahme. Wählen Sie das Protokoll mit einer Dauer von 210 Sekunden aus.

Dies ist die Länge des Programms zum Walzen auf H-B-M-E-C 60 Zellen. Jede Phase ist so programmiert, dass sie für die Dauer des Pumpenprotokolls jede Sekunde ein Bild aufnimmt. Es ist auch so eingerichtet, dass es einen Befehl über den Comm Three Port sendet, um die Pumpe zu starten.

Stellen Sie die Spritzenpumpe in den Programmmodus, der die manuelle Programmierung bestimmter Durchflussraten ermöglicht. Dies bestimmt das schiere Stressniveau in der Kammer und diktiert die Wechselwirkungen zwischen KG und einer A-Zelle über die H-B-M-E-C 60-Zellen. Die Einstellungen für diese Interaktionen sind 4,2 Dines pro Quadratzentimeter für 45 Sekunden.

Punkt drei Dines pro Quadratzentimeter für 60 Sekunden und Step Aways erhöht sich alle 15 Sekunden auf maximal 4,2 Dines pro Quadratzentimeter. Das Mikroskop und der Computer sind nun bereit, Zeitrafferaufnahmen zu machen. Drücken Sie auf dem Computer auf Start Ausführen, um mit der Datenerfassung zu beginnen, während das Programm ausgeführt wird.

Achten Sie darauf, dass das Rohr mit KG one A-Zellen mit Medien gefüllt ist, um den Eingangsausgangsschlauch mit Medium gefüllt zu halten und das Eindringen von Luftblasen in das System zu verhindern. Wird der Zeitraffer unterbrochen, stoppt die Pumpe nicht von selbst und muss zurückgesetzt werden. Drücken Sie Abbrechen, um zum Live-Bild zurückzukehren.

Eine unstimulierte Endothelzell-Monoschicht dient als Negativkontrolle für dieses Experiment. Zu diesem Zweck infundieren Sie KG one A-Leukozyten in die Flow-Kammer über unbehandelten H-B-M-E-C 60-Zellen, um die Unabhängigkeit zu kontrollieren, stimulieren Sie die Monoschicht der Endothelzellen mit IL one beta und infundieren Sie die Leukozyten über diese Zellen, um die ekte Unabhängigkeit weiter zu kontrollieren. Behandeln Sie H-B-M-E-C 60-Zellen mit IL one beta und dann mit Anti-Human-S-Selektin-Antikörper.

Analysieren Sie dann die Leukozytenrollereignisse auf diesen Zellen. Das Zellrollen wird nicht nur durch das S-Selektin bestimmt, sondern auch durch die Slicsäurereste auf der Zelloberfläche der Leukozyten. Um dies zu zeigen, verdauen Sie die KG one A-Zellen mit 0,1 Einheiten pro mil Neuraminidase für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Analysieren Sie dann die Rollereignisse über stimulierte H-B-M-E-C 60-Zellen. Glykoproteine auf der Leukozytenoberfläche sind auch wichtig für das Zellrollen. Dies kann demonstriert werden, indem die KG one A-Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 0,2 Einheiten pro mil Bromabahn behandelt und dann in die Durchflusskammer infundiert werden.

Nachdem die Zeitsequenz erfasst wurde, sind die Daten für die Analyse bereit. Speichern Sie die Daten und gehen Sie auf die Registerkarte "Messen" in der Menüleiste und wählen Sie den definierten Schwellenwert aus. Verschieben Sie die Balken so, dass die gewünschten Zellen rot eingefärbt sind, wählen Sie alle Bilder aus und dann okay, die gesamte Zeitraffersequenz sollte nun mit sichtbaren roten rollenden Zellen geändert werden.

Gehen Sie zu Messung, und wählen Sie Einschränkungen aus. Auf diese Weise kann der Benutzer Schwellenwertobjekte ausschließen, die keine rollenden Zellen darstellen. Dabei handelt es sich in erster Linie um den Hintergrund, der durch den H-B-M-E-C 60-Monolayer-Auswahlbereich erzeugt wird und Minimal- und Maximalwerte eingibt, die ideal für die rollenden Leukozyten sind.

Wiederholen Sie diesen Schritt für Dehnung und Zirkularität: Wählen Sie Maß aus, und wählen Sie dann Binär mit Einschränkungen erstellen aus. Die gleichen Restriktionswerte, die im vorherigen Schritt eingestellt wurden, werden nun verwendet, um die NIS-Elemente-Software für die Erkennung von rollenden Leukozyten auf der Endothelzell-Monoschicht zu optimieren. Gehen Sie zurück zu Messen, wählen Sie Felddaten aus und wählen Sie dann Daten zurücksetzen aus.

Schließen Sie das Menü, kehren Sie zum Messen zurück und wählen Sie Scanfeld, öffnen Sie die Messfelddaten und wählen Sie Anzahl oder Objekte. Wählen Sie dann alle Felder aus und exportieren Sie die Daten nach Microsoft Excel. Wählen Sie abschließend Daten löschen aus.

NIS elements ist nun bereit für weitere Datenerfassung. Diese repräsentativen Daten zeigen, wie Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen auf physiologischen Stress reagieren, und testen insbesondere die Rolle des adhäsiven Liganden. E selectin.

Ein robustes Leukozytenrollen tritt auf, wenn Endothelzellen mit IL one beta vorstimuliert werden. Vergleicht man dieses Ergebnis mit der unstimulierten Kontrolle, so wird deutlich, dass das Zellrollen von der Zytokinstimulation abhängt. Durch die Behandlung der H-B-M-E-C 60 Zellen mit IL one beta und anschließend mit anti-humanen E-Selektin-Antikörpern wird deutlich, dass das Zellrollen spezifisch von E-Selektin abhängt.

Dieser Assay kann auch zur Prüfung anderer Parameter verwendet werden. Werden beispielsweise stimulierte Zellen mit einer Sase oder mit Brolin vorbehandelt, sind die Ergebnisse weniger robust. Diese Daten unterstreichen die Bedeutung von terminalen Zlicsäureresten sowie von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche.

Für die Aktivität des S-Selektin-Liganden haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie e-Selektin-basierte adhäsive Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen unter Bedingungen analysieren können, die Kräfte nachahmen, die in einem postkapillären Venial vorhanden sind, der Region des Kreislaufsystems, in der Leukozyten das Blut verlassen und in das Gewebe gelangen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den geeigneten blockierenden Antikörper oder die enzymatische Behandlungskontrolle zu verwenden, um die Notwendigkeit des jeweiligen Selektins und seines Liganden in diesem Assay-System zu validieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.