Die Analyse der physiologischen E-Selectin-vermittelte Leukozyten-Rolling auf mikrovaskuläre Endothel

Dieses Video demonstriert die Analyse mittels einer Parallelplatten-Flusskammer zur Untersuchung der Faktoren, die das Wälzen von Leukozyten auf Endothelzelloberflächen auslösen. Einschichtig wachsende Endothelzellen werden mit dem proinflammatorischen Zytokin IL-1β stimuliert, um die Expression von S-Selektin zu erhöhen. Anschließend wird die Parallelplatten-Flusskammer über die Endothelzellen platziert, und S-Selektin-positive Leukozyten werden über die Zellschicht infundiert.

Die zellulären Wechselwirkungen in der Kammer werden somit einer Scherbelastung ausgesetzt, die der in postkapillären Venolen ähnelt, wo Leukozyten adhärieren. Rollereignisse werden mithilfe von NIS-Elementen erfasst und quantifiziert sowie auf E-Selektin-Unabhängigkeit getestet. Hallo, ich bin George Weis im Labor von Dr. Charles de Nitro in der Abteilung für Dermatologie am Brigman Women's Hospital der Harvard Medical School.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung der Rolle von E-Selectin und E-Selectin-Liganden bei der Adhäsion menschlicher Leukozyten an menschliche Knochenmarkendothelzellen unter physiologischen Blutströmungsbedingungen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Funktion von Oberflächenmolekülen der Zelle zu erforschen, die die Adhäsion von weißen Blutkörperchen oder metastasierenden Krebszellen an Endothelzellen – welche die innere Oberfläche der Blutgefäße auskleiden – einleiten. Dieses adhesive Ereignis zeichnet sich durch ein Rollverhalten aus, ähnlich wie eine Bowlingkugel, die eine Bahn hinabrollt.

Beginnen wir also. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die endothelialen Zellen vorzubereiten, die die Durchflusskammer auskleiden werden. Dieses Protokoll verwendet H-B-M-E-C 60-Zellen, die aus menschlichem Knochenmark stammen.

Kulturschalen für Mikrovaskulatur sollten zur Vorbereitung mit Fibronectin beschichtet werden, indem 35-Milliliter-Zellkulturschalen mit PBS, der 20 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin enthält, inkubiert werden. Die Inkubation kann entweder über Nacht bei vier Grad Celsius oder für drei Stunden bei 37 Grad Celsius erfolgen. H-B-M-E-C-60-Zellen in Medium 199 suspendieren und mit 105 Zellen pro Schale ansäen; die Kulturen bis zu einer Konfluenz von über 90 % auswachsen lassen.

Dies dauert etwa zwei Tage, um die Expression von E-Selectin hochzuregulieren. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium und geben Sie frisches Medium mit 50 Nanogramm pro Milliliter IL-1β hinzu. Inkubieren Sie für vier bis sechs Stunden. Die Zellmonolagen sind nun bereit für den Durchflusskammer-Assay. Zusätzliche Platten mit H-B-M-E-C-60-Zellen können mit IL-1β stimuliert und mit einer neutralisierenden anti-humanen E-Selectin-Antikörperlösung bei 20 Mikrogramm pro Milliliter für eine Stunde bei 37 Grad Celsius behandelt werden.

Dies dient der Kontrolle der funktionellen Expression von E-Selectin. Bereiten Sie anschließend die E-Selectin-positiven Leukozyten vor. Dabei handelt es sich um KG1a, humane hämatopoetische Vorläuferzellen.

Sie werden in Suspension bis zur Konfluenz gezüchtet oder bis zu sechs Zellen pro Milliliter in RPMI 1640. Die KG-eins-A-Zellen können direkt aus der Kultur entnommen und auf einem Hämozytometer gezählt werden. Resuspendieren Sie die Zellen bei 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in HBSS mit 10 Millimolar Hepes- oder HH-Puffer, der 2 Millimolar Calciumchlorid enthält.

Bewahren Sie die Zellen auf Eis auf, bis sie einem Assay unterzogen werden. Die nächsten Schritte beinhalten die Vorbereitung des Mikroskops, der Parallelplatten-Flusskammer und der Spritzenpumpe. Schalten Sie für den Assay das Mikroskop und die Spritzenpumpe ein.

Wählen Sie das 10×-Objektiv am Mikroskop aus. Stellen Sie einen 50-Milliliter-Kegelrohr in den Halter und füllen Sie es mit HH-Puffer mit zwei Millimolar Calciumchlorid. Danach stellen Sie 5-Milliliter-Kunststoffteströhrchen in den darunterliegenden Halter.

Als Nächstes setzen Sie eine 60-Milliliter-Spritze in die Spritzenpumpe ein. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Kolben als auch der Zylinder der Spritze fest sitzen. Befestigen Sie einen Dreiweghahn am Ende der 60-Milliliter-Spritze und anschließend eine 5-Milliliter-Spritze am Dreiweghahn.

Stellen Sie die Vorrichtung für die Parallelstromkammer auf den Mikroskoptisch mit dem Zulaufschlauch rechts, dem Auslaufschlauch links und dem Vakuumschlauch hinten. Nachdem der Schlauch mit dem Vakuum verbunden wurde, öffnen Sie das Luftventil, damit die Parallelplattenvorrichtung am Tisch haftet. Dadurch wird überprüft, ob der Vakuumdichtungsrand an der Durchflusskammer luftdicht ist.

Wenn die Abdichtung bestätigt ist, schalten Sie das Luftventil aus. Verbinden Sie nun die Ausgangsschlauchleitung mit dem Dreiweghahn, der bereits mit der Spritze verbunden ist. Die Vorrichtung ist nun bereit, über die H-B-M-E-C 60-Zellen platziert zu werden.

Schalten Sie das Vakuum ein, senken Sie die Flusskammer vorsichtig auf die Platte ab, und lassen Sie die Apparatur ansaugen. Es sollte kein Geräusch von entweichender Luft zu hören sein; an dieser Stelle müssen Sie möglicherweise Druck auf die Kammer ausüben, um die Gummidichtung zu komprimieren. Sobald das Vakuum hergestellt ist, platzieren Sie das Zulaufrohr in den 50-Milliliter-Konischkolben.

Öffnen Sie den Dreifachhahn zur 60-mL-Spritze und schalten Sie die Pumpe in den Pumpmodus, um Luft aus den Leitungen zu entfernen, ohne die Zellen auf der Platte anzuheben. Füllen Sie das Ansaugrohr mit der Spritzenpumpe, die auf zwei mL pro Minute eingestellt ist. Stellen Sie dann schnell auf 0,5 mL pro Minute um.

Kurz bevor die Flüssigkeit das Gerät erreicht, ist es entscheidend, die Apparatur sorgfältig zu spülen und Luftblasen zu vermeiden, da diese die Monoschicht von der Platte anheben können. Sobald die Flüssigkeit in die 60-mil-Spritze strömt, sind die Durchflusskammer und die Spritzenpumpe gespült. Befestigen Sie nun die Durchflusskammer mit einem Stück Klebeband über jeder der Zuleitungen – Zufuhr, Auslass und Vakuum – am Mikroskoptisch.

Dadurch bleibt das Sichtfeld konstant, während die Visualisierung und Datenerfassung erfolgt. Die Durchflusskammer ist nun betriebsbereit. Diese Schritte sollten für jeden Zellinput-Lauf und für jede neue Platte wiederholt werden.

Um die Rollereignisse an der Lucas-Plattform aufzuzeichnen, öffnen Sie NIS Elements auf dem Desktop und klicken Sie auf das Wiedergabesymbol, um ein Live-Bild zu erhalten. Die automatische Belichtung ermöglicht es Ihnen, die Platte zu sehen und das Bild zu fokussieren. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop korrekt auf die Zellmonolayer fokussiert ist, indem Sie den Fokus manuell am Mikroskop justieren.

Sobald das Bild scharf gestellt ist, stellen Sie die Belichtung auf einen Bildrahmen pro Sekunde zurück und justieren Sie das Licht am Mikroskop. Das Bild sollte nun auf dem Computer erscheinen und im Mikroskop nicht mehr sichtbar sein. Anschließend kann das Licht-Histogramm angepasst werden, um Hintergrundbelichtung zu entfernen oder die Zellklarheit zu verbessern. Klicken Sie auf Zwei-mal-zwei-Binning oder Live-Binning, um ein Bild zu erhalten, das ideal für die Aufnahme eines Films ist.

Klicken Sie auf Makro in der Menüleiste und wählen Sie rechts den Port com drei aus und öffnen Sie ihn. Dadurch wird der Port geöffnet, um ihn mit der Spritzenpumpe zu synchronisieren. Die Durchflusskammer ist nun bereit, mit KG-eins-A-Zellen infundiert zu werden. Pipettieren Sie ein Milliliter der KG-eins-A-S-Zellsuspension in das fünf-Milliliter-Reagenzglas in der Nähe der Zuleitungsleitung.

Bringen Sie dann die Eingangsleitung an das untere Ende des Reagenzglases an. Gehen Sie zur Menüleiste und klicken Sie auf Erfassung und Zeitraffer-Aufnahme. Wählen Sie das Protokoll mit einer Dauer von 210 Sekunden aus.

Dies ist die Dauer des Programms zum Rollen auf H-B-M-E-C 60-Zellen. Jede Phase ist so programmiert, dass während der gesamten Pumpprotokolldauer jede Sekunde ein Bild aufgenommen wird. Außerdem ist es so eingerichtet, dass ein Befehl über den Kommunikationsport drei gesendet wird, um die Pumpe zu starten.

Stellen Sie die Spritzenpumpe in den Programmiermodus, der eine manuelle Programmierung bestimmter Flussraten ermöglicht. Dies bestimmt die Scherspannungslevel in der Kammer und steuert die Wechselwirkungen zwischen KG1A-Zellen und H-B-M-E-C-60-Zellen. Die Einstellungen für diese Wechselwirkungen betragen 4,2 Dynen pro Quadratzentimeter für 45 Sekunden.

Punkt drei dines pro Quadratzentimeter für 60 Sekunden und schrittweise Erhöhungen alle 15 Sekunden bis zu einem Maximum von 4,2 dines pro Quadratzentimeter. Das Mikroskop und der Computer sind nun bereit, Zeitrafferaufnahmen aufzuzeichnen. Drücken Sie am Computer auf „Startlauf“, um mit der Datenerfassung zu beginnen, während das Programm ausgeführt wird.

Stellen Sie sicher, dass Sie Medium in das Röhrchen mit KG-eins-A-Zellen geben, um die Ein- und Auslassschläuche vollständig mit Medium zu füllen und zu verhindern, dass Luftblasen in das System gelangen. Wenn die Zeitrafferaufnahme unterbrochen wird, stoppt die Pumpe nicht automatisch und muss zurückgesetzt werden. Drücken Sie Abbrechen, um zum Live-Bild zurückzukehren.

Eine unbehandelte Endothelzellschicht dient als Negativkontrolle für dieses Experiment. Dazu werden KG1a-Leukozyten über unbehandelte HBMEC-60-Zellen in die Durchflusskammer gegeben, um die E-Selektin-Unabhängigkeit zu kontrollieren. Die Endothelzellschicht wird mit IL-1β stimuliert, und die Leukozyten werden über diese Zellen infundiert, um die Eekt-Unabhängigkeit weiter zu überprüfen. HBMEC-60-Zellen werden mit IL-1β und anschließend mit einem anti-humanen S-Selektin-Antikörper behandelt.

Danach analysieren Sie die Leukozyten-Rollereignisse an diesen Zellen. Das Zellrollen wird nicht nur durch S-Selektin bestimmt, sondern auch durch Sialinsäurereste auf der Oberfläche der Leukozyten. Um dies zu zeigen, inkubieren Sie die KG1a-Zellen eine Stunde lang bei 37 °C mit 0,1 Einheiten pro ml Neuraminidase.

Danach analysieren Sie die Wälzbewegungen über stimulierte H-B-M-E-C 60-Zellen. Glykoproteine auf der Oberfläche von Leukozyten sind ebenfalls wichtig für das Wälzen der Zellen. Dies kann gezeigt werden, indem die KG-eins-A-Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 0,2 Einheiten pro Milliliter Bromelain behandelt und anschließend in die Durchflusskammer infundiert werden.

Nachdem die Zeitsequenz aufgezeichnet wurde, stehen die Daten zur Analyse bereit. Speichern Sie die Daten, wechseln Sie zum Reiter „Measure“ in der Menüleiste und wählen Sie „Defined Threshold“. Verschieben Sie die Schieberegler, sodass die gewünschten Zellen rot eingefärbt werden, wählen Sie alle Bilder aus und bestätigen Sie mit „Okay“. Die gesamte Zeitrafferaufnahme sollte nun angepasst sein, wobei die beweglichen Zellen in Rot sichtbar sind.

Wechseln Sie zu „Messen“ und wählen Sie Einschränkungen aus. Dadurch kann der Benutzer Schwellenobjekte ausschließen, die keine rollenden Zellen darstellen. Dies betrifft hauptsächlich Hintergrundsignale, die durch die H-B-M-E-C-60-Einschicht-Monolayer-Auswahl erzeugt werden. Geben Sie minimale und maximale Werte ein, die sich als ideal für rollende Leukozyten erwiesen haben.

Wiederholen Sie diesen Schritt für die Verlängerung und Rundheit. Wählen Sie „Messen“ und dann „Binärbild erstellen“ mithilfe von Einschränkungen. Dieselben Einschränkungswerte, die im vorherigen Schritt festgelegt wurden, werden nun verwendet, um die NIS-Elemente-Software zur Erkennung von rollenden Leukozyten auf der endothelialen Zellmonolage zu optimieren. Gehen Sie zurück zu „Messen“, wählen Sie „Felddaten“ und dann „Daten zurücksetzen“.

Schließen Sie das Menü, kehren Sie zur Messung zurück und wählen Sie das Scan-Feld aus, öffnen Sie die Messfelddaten und wählen Sie die Anzahl oder Objekte aus. Wählen Sie dann alle Felder aus und exportieren Sie die Daten nach Microsoft Excel. Wählen Sie abschließend „Daten löschen“ aus.

NIS-Elemente sind nun bereit für die Erfassung weiterer Daten. Diese repräsentativen Daten zeigen, wie die Interaktionen zwischen Leukozyten und Endothelzellen auf physiologische Scherkräfte reagieren, wobei insbesondere die Rolle des adhäsiven Liganden E-Selectin untersucht wird.

Ein stabiles Rollen der Leukozyten tritt auf, wenn endotheliale Zellen vorab mit IL-1β stimuliert werden. Beim Vergleich dieses Ergebnisses mit der unstimulierten Kontrolle wird deutlich, dass das Zellrollen von der Zytokinstimulation abhängt. Durch die Behandlung der H-B-M-E-C-60-Zellen mit IL-1β und anschließend mit einem anti-humanen E-Selectin-Antikörper wird klar, dass das Zellrollen spezifisch von E-Selectin abhängt.

Dieser Test kann auch zur Untersuchung anderer Parameter verwendet werden. Wenn beispielsweise stimulierte Zellen vorab mit einer Sase oder mit Brolin behandelt werden, fallen die Ergebnisse weniger deutlich aus. Diese Daten unterstreichen die Bedeutung terminaler Sialinsäurereste sowie von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche.

Für die S-Selektin-Ligand-Aktivität haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man e-Selektin-vermittelte adhesive Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen unter Bedingungen analysiert, die den Kräften in einer postkapillären Venule nachempfunden sind – dem Bereich des Kreislaufsystems, in dem Leukozyten das Blut verlassen und in das Gewebe eintreten. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die entsprechende blockierende Antikörperbehandlung oder enzymatische Kontrollbehandlung zu verwenden, um die Notwendigkeit des jeweiligen Selektins und seines Liganden in diesem Assay-System zu überprüfen. Damit ist der Vorgang abgeschlossen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.