3.4: Kalibrierkurven

1. machen die Standards: Verdünnungsreihen

1. Machen Sie eine konzentrierte Stammlösung der Norm. Das Mittel ist in der Regel genau abgewogen, und dann quantitativ in einem volumetrischen Kolben übertragen. Fügen Sie einige Lösungsmittel hinzu, mischen Sie, so dass die Probe auflöst, dann füllen Sie in die Zeile mit dem entsprechenden Lösungsmittel.
2. Durchführen Sie Verdünnungsreihen. Nehmen eine andere volumetrischen Kolben und pipette die Höhe der Standard für die Verdünnung benötigt dann füllen Sie in die Zeile mit Lösungsmittel und mischen. Eine zehnfache Verdünnung ist in der Regel gemacht, also für eine volumetrische 10 mL-Flasche, 1 mL der vorherigen Verdünnung zugeben.
3. Weiterhin Bedarf für weitere Verdünnungen, Pipettieren von der vorherigen Lösung um es zu machen, die nächste Probe verdünnen. Für eine gute Kalibrationskurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

2. führen Sie die Proben für die Eichkurve und das unbekannte

1. Laufen Sie die Proben mit der UV-Vis Spektralphotometer, die instrumentelle Reaktion benötigt für die Eichkurve zu bestimmen.
2. Den Meßwert mit der ersten Probe. Es ist eine gute Idee, die Proben in zufälliger Reihenfolge (d. h. nicht höchsten bis zur niedrigsten zum höchsten oder niedrigsten) laufen, für den Fall, dass systematische Fehler vorliegen. Um eine Schätzung des Rauschens zu erhalten, wiederholen Sie der Lesung zu jeder Probe 3 – 5 X.
3. Die zusätzliche standard Proben, Wiederholung der Messungen für jede Probe eine Schätzung der Lärm zu laufen. Notieren Sie die Daten später zu einem Grundstück.
4. Führen Sie die unbekannten Proben. Verwenden Sie als ähnliche Bedingungen zu den Standards wie möglich laufen. So, die Probenmatrix oder Puffer sollte identisch sein, der pH-Wert sollte identisch sein und die Konzentration sollte im Bereich der Normen ausgeführt werden.

3. machen die Kalibrierkurve

1. Erfassen Sie die Daten in eine Tabelle und verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten gegen Konzentration zeichnen. Wenn mindestens dreifacher Messungen für jeden Punkt aufgenommen wurden, können Fehlerindikatoren der Standardabweichung dieser Messungen, die Fehler der einzelnen Punkte zu schätzen geplottet werden. Für einige Kurven müssen die Daten mit einer Achse als ein Protokoll zu einer Linie dargestellt werden. Die Gleichung, die die Eichkurve regelt ist im Allgemeinen vor der Zeit, bekannt ein Log-Plot verwendet wird, wenn es gibt ein Protokoll in der Gleichung.
2. Die Eichkurve zu untersuchen. Sieht es linear? Es muss einen Teil, der nicht-linearen sieht (d. h. erreicht die Grenze der instrumentalen Antwort)? Um zu überprüfen, passen alle Daten, um eine lineare Regression mit der Software. Wenn der Bestimmungskoeffizient (R²) nicht hoch ist, entfernen Sie einige der Punkte am Anfang oder Ende der Kurve, die nicht angezeigt werden, passen die Linie und die lineare Regression wieder durchführen. Es geht nicht um Punkte in der Mitte zu entfernen, nur weil sie eine großen Fehler-Bar. Entscheiden Sie aus dieser Analyse, welcher Teil der Kurve linear ist.
3. Die Ausgabe des linearen sollte eine Gleichung für die Format-y = Mx + b, wo m ist die Steigung und b der y-Achsenabschnitt. Die Einheiten für die Neigung sind die y-Achse Einheit/Konzentration, in diesem Beispiel (Abbildung 1) Absorption/μM. Für den y-Achsenabschnitt werden die y-Achse Einheiten. Es ergibt sich ein Bestimmungskoeffizient (R²). Je höher die R² je besser die Passform; eine perfekte Passform verleiht ein R² 1. Das Programm kann auch eine Schätzung des Fehlers auf die Piste und das Abfangen können.

4. Ergebnisse: Kalibrierkurve des Absorption des blauen Farbstoff #1

1. Die Eichkurve für Absorption des blauen Farbstoff #1 (bei 631 nm) wird unten (Abbildung 1) angezeigt. Die Antwort ist linear von 0 bis 10 µM. oben, dass Konzentration das Signal auf Stufe beginnt ab weil die Antwort aus den linearen Bereich der UV-Vis Spektralphotometer ist.
2. Berechnen Sie die LOD. Von der Piste die Eichkurve, die Detailgenauigkeit ist 3*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve der Lärm wurde erreicht, indem man eine Standardabweichung von wiederholten Messungen und 0,021 war. Das LOD wäre 3*0.021/.109=0.58 µM.
3. Berechnung der LOQ. Das LOQ ist 10*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve LOQ ist 10*0.021/.109 = 1,93 µM.
4. Berechnen Sie die Konzentration des unbekannten. Verwenden Sie die Gleichung der Linie um die Konzentration der unbekannten Probe zu berechnen. Die Eichkurve gilt nur, wenn das unbekannte in den linearen Bereich der Standardproben fällt. Wenn die Messwerte zu hoch sind, kann die Verdünnung erforderlich sein. In diesem Beispiel wurde die unbekannte Sportgetränk 1:1 verdünnt. Die Extinktion war 0,243 und dies entspricht einer Konzentration von 2,02 µM. Damit die Endkonzentration von blauer Farbstoff #1 in der in der Sport-Getränk war 4,04 µM.

Abbildung 1: Kalibrierkurven für UV-Vis Absorption des blauen Farbstoff. Links: die Absorption der verschiedenen Konzentrationen von blauen Farbstoff #1 gemessen wurde. Die Antworten einpendeln nach 10 µM bei die Extinktion über 1. Die Fehlerbalken sind durch wiederholte Messungen der gleichen Probe und Standardabweichungen. Recht: Die lineare Teil der Kalibrierkurve ist mit einer Linie fit y = 0.109 * X + 0,0286. Unbekannten Daten werden in schwarz angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kalibrierkurven werden verwendet, um die instrumentelle Reaktion auf einen Analyten zu verstehen und die Konzentration des Analyten in einer Probe vorherzusagen.

Eine Kalibrierungskurve wird erstellt, indem zunächst ein Satz von Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen des Analyten hergestellt wird. Das Ansprechverhalten des Geräts wird für jedes Gerät gemessen und im Vergleich zur Konzentration der Standardlösung aufgetragen. Der lineare Teil dieses Diagramms kann dann verwendet werden, um die Konzentration einer Probe des Analyten vorherzusagen, indem seine Reaktion auf die Konzentration korreliert wird.

In diesem Video werden Kalibrierkurven und deren Verwendung vorgestellt, indem die Erstellung eines Satzes von Standards und die anschließende Analyse einer Probe mit unbekannter Konzentration demonstriert wird.

Zur Erstellung der Kalibrierkurve wird ein Satz von Standardlösungen verwendet. Diese Lösungen bestehen aus einem Bereich von Konzentrationen, die die ungefähre Konzentration des Analyten umfassen.

Standardlösungen werden oft mit einer seriellen Verdünnung hergestellt. Eine serielle Verdünnung wird durchgeführt, indem zunächst eine Stammlösung des Analyten hergestellt wird. Die Stammlösung wird dann um eine bekannte Menge, oft eine Größenordnung, verdünnt. Die neue Lösung wird dann auf die gleiche Weise verdünnt und so weiter. Das Ergebnis ist eine Reihe von Lösungen mit Konzentrationen, die sich über mehrere Größenordnungen erstrecken.

Die Kalibrierkurve ist ein Diagramm des instrumentellen Signals im Vergleich zur Konzentration. Der Plot der Standards sollte linear sein und kann mit der Gleichung y=mx+b angepasst werden. Die nichtlinearen Teile des Diagramms sollten verworfen werden, da diese Konzentrationsbereiche außerhalb der Linearitätsgrenze liegen.

Die Gleichung der am besten angepassten Linie kann dann verwendet werden, um die Konzentration der Probe zu bestimmen, indem das Instrumentensignal zur Korrelation mit der Konzentration verwendet wird. Proben mit Messungen, die außerhalb des linearen Bereichs des Diagramms liegen, müssen verdünnt werden, um im linearen Bereich zu liegen.

Die Nachweisgrenze des Gerätes, also die niedrigste Messung, die statistisch über dem Rauschen bestimmt werden kann, kann ebenfalls aus der Kalibrierkurve berechnet werden. Eine leere Probe wird mehrfach gemessen. Die Nachweisgrenze ist im Allgemeinen definiert als das durchschnittliche Leersignal plus das 3-fache seiner Standardabweichung.

Schließlich kann auch die Quantifizierungsgrenze berechnet werden. Die Quantifizierungsgrenze ist die geringste Menge an Analyt, die genau quantifiziert werden kann. Dies wird als 10 Standardabweichungen über dem Leersignal berechnet.

Nachdem Sie nun die Grundlagen einer Kalibrierkurve kennengelernt haben, sehen wir uns an, wie Sie eine Kalibrierkurve vorbereiten und im Labor verwenden.

Bereiten Sie zunächst eine konzentrierte Stammlösung des Standards vor. Wiegen Sie den Standard genau und geben Sie ihn in einen Messkolben. Fügen Sie eine kleine Menge Lösungsmittel hinzu und mischen Sie so, dass sich die Probe auflöst. Füllen Sie dann bis zur Leitung mit Lösungsmittel. Es ist wichtig, das gleiche Lösungsmittel wie die Probe zu verwenden.

Zur Herstellung der Standards pipettieren Sie die erforderliche Menge in den Messkolben. Füllen Sie dann den Kolben bis zur Leitung mit Lösungsmittel und mischen Sie.

Fahren Sie mit der Herstellung der Standards fort, indem Sie aus der Stammlösung pipetieren und verdünnen. Für eine gute Kalibrierkurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

Führen Sie nun Proben mit dem Analysegerät, in diesem Fall einem UV-Vis-Spektralphotometer, durch, um die für die Kalibrierkurve erforderliche instrumentelle Reaktion zu bestimmen.

Nehmen wir die Messung des ersten Standards. Führen Sie die Standards in zufälliger Reihenfolge aus, falls systematische Fehler auftreten. Messen Sie jeden Standard 3-5x, um eine Schätzung des Geräuschpegels zu erhalten.

Messen Sie die restlichen Standards und wiederholen Sie die Messungen für jeden Standards. Zeichnen Sie alle Daten auf.

Führen Sie abschließend das Beispiel aus. Verwenden Sie die gleiche Probenmatrix und die gleichen Messbedingungen wie für die Standards. Stellen Sie sicher, dass sich die Probe innerhalb des Bereichs der Standards und der Grenzen des Geräts befindet.

Um die Kalibrierkurve zu erstellen, verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten als Signal vs. Konzentration darzustellen. Verwenden Sie die Standardabweichung der wiederholten Messungen für jeden Datenpunkt, um Fehlerbalken zu erstellen.

Entfernen Sie Teile der Kurve, die nicht linear sind, führen Sie dann eine lineare Regression durch und bestimmen Sie die am besten angepasste Linie. Das Ergebnis sollte eine Gleichung in der Form y = m x + b sein. Ein R2-Wert nahe 1 deutet auf eine gute Anpassung hin.

Dies ist die Kalibrierkurve für den blauen Farbstoff #1, gemessen bei 631 nm. Das Ansprechverhalten liegt linear zwischen 0 und 15 mM.

Berechnen Sie die Konzentration der Probe anhand der Gleichung der am besten angepassten Linie. Die Extinktion für die Probe betrug 0,141 und entsprach einer Konzentration von 6,02 mM.

Nachdem Sie nun gesehen haben, wie eine Kalibrierkurve mit einem UV-Vis-Spektralphotometer verwendet werden kann, werfen wir einen Blick auf einige andere nützliche Anwendungen.

Kalibrierkurven werden häufig bei elektrochemischen Anwendungen verwendet, da das Elektrodensignal auf die Konzentration der Ionen in der Lösung kalibriert werden muss. In diesem Beispiel wurden Daten für eine ionenselektive Elektrode für Fluorid gesammelt.

Die Konzentrationsdaten müssen auf der logarithmischen Skala aufgetragen werden, um eine Linie zu erhalten. Diese Kalibrierkurve kann verwendet werden, um die Konzentration von Fluorid in einer Lösung, wie z. B. Zahnpasta oder Trinkwasser, zu messen.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Trenn- und Analysetechnik, die in der analytischen Chemie stark eingesetzt wird. Bei der HPLC werden die Bestandteile eines Gemisches basierend auf der Zeit getrennt, die die Moleküle benötigen, um die Länge der Chromatographiesäule zurückzulegen. Diese Zeit variiert in Abhängigkeit von einer Reihe chemischer Eigenschaften der Moleküle.

Die Elution der Moleküle wird mit einem Detektor gemessen, woraufhin ein Chromatogramm erstellt wird. Die Peakfläche kann mit einer einfachen Kalibrierkurve einer Reihe von Standardlösungen mit der Konzentration korreliert werden, wie in diesem Beispiel beliebter Sodazutaten.

In einigen Fällen, in denen die Lösungsmatrix die Messung des gelösten Stoffes beeinträchtigt, kann eine klassische Kalibrierkurve ungenau sein. In diesen Fällen wird eine modifizierte Kalibrierkurve erstellt. Zu diesem Zweck wird der Probe eine Reihe von Standardlösungsvolumina zugesetzt. Das Signal-zu-Konzentrationsdiagramm wird erstellt, wobei der x-Achsenabschnitt gleich der ursprünglichen Konzentration der Probenlösung ist. Weitere Informationen zu dieser Technik finden Sie im JoVE-Video zur wissenschaftlichen Bildung, "Die Methode der Standardaddition".

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Kalibrierkurve gesehen. Sie sollten nun verstehen, wo die Kalibrierkurve verwendet wird, wie sie erstellt wird und wie Sie sie zur Berechnung der Konzentrationen von Proben verwenden.

Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!