3.3: Standard-Additionsverfahren

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. 100 ppm Al^{3 +} Standardlösung: auflösen 0,9151 g Aluminium Nitrat (Al (Nr.₃)₃•9H₂O) in eine volumetrische 1-L-Flasche mit VE-Wasser.
2. 8HQ Lösung in 1 M Essigsäure (2 % wt/Vol): eine volumetrische 100 mL-Flasche 2,0 g 8-Hydroxychinolin hinzufügen.
3. Sorgfältig fügen Sie 5,74 mL Eisessig in den 100-mL-Kolben, dann bis zur Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Dies ermöglicht das 8-Hydroxychinolin in wässrigen Phase aufzulösen.
4. 1 M NH₄⁺/NH₃ Puffer (pH ~ 8): eine 100-mL-Flasche 20 g Ammoniumacetat (NH₄OAc) hinzufügen.
5. Diese 100-mL-Flasche 7 mL 30 % Ammonium Hydroxid hinzu, und bis zur Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Auf diese Weise neutralisieren die Säure in der 8HQ-Lösung kombiniert.
6. Anderen Reagenzien enthalten wasserfreiem Natriumsulfat (Na₂SO₄) und Chloroform (Spec Klasse).

2. Vorbereitung der Proben

1. Bereiten Sie eine 1,00 ppm standard Al^{3 +} Lösung durch Zugabe von 1,0 mL 100 ppm Lager Al^{3 +} Lösung mit einer Pipette in ein 100 mL volumetrischen Kolben.
2. Legen Sie sechs 125 mL separatory Trichter auf die Ringe, die auf einem großen Ring-Stand befindet sich in der Haube sind. Sie sollte wie folgt beschriftet: BL, 0, 1, 2, 3, 4. sicherstellen, dass alle Gläser ist absolut sauber, da es schwierig ist, quantitative Ergebnisse zu erzielen, wenn kleine Perlen aus Chloroform an den Wänden der Glaswaren bleiben.
3. Die fünf separatory Trichter mit der Bezeichnung 0, 1, 2, 3, 25,00 mL der unbekannten Al^{3 +} Lösung hinzufügen & 4. In diesem Beispiel ist die unbekannte Konzentration 0,110 ppm.
4. Fügen Sie 0, 1.00, 2.00, 3.00 und 4,00 mL 1,00-ppm Al^{3 +} Standardlösung hinzu, bzw. die 5 Trichter mit einer 1-mL-Pipette.
5. Bereiten Sie eine leere indem 25,00 mL destilliertem Wasser zu den separatory Trichter mit der Bezeichnung Bl.
6. Fügen Sie 1,0 mL der Lösung mit einer Pipette 8-Hydroxychinolin hinzu, jede der sechs Lösungen.
7. 3,0 mL Pufferlösung mit einer Pipette zu jedem der sechs Lösungen hinzugeben.
8. Jede Lösung zweimal mit 10 mL Chloroform, schüttelt energisch für 1 min jedes Mal zu extrahieren. Denken Sie daran, den separatory Trichter zum Druckaufbau lösen gelegentlich entlüften. (Hinweis: eine gute Extraktion findet nur statt, wenn es eine Menge von flüssig-flüssig Kontakt zwischen den Phasen gibt).
9. Das Chloroform in einem sauberen, trockenen 100 mL gekennzeichneten Becherglas zu sammeln. Chloroform hat eine Dichte von in der Nähe von 1,5 g/cm³, so dass die untere Schicht ist. Es darf keine Spur von gelber Farbe links in der wässrigen Phase nach eine vollständige Extraktion.
10. Die kombinierte Chloroform Auszug aus jedem Becherglas in ihre jeweiligen volumetrische 25-mL-Flasche zu übertragen und bis zur Markierung mit Chloroform verdünnen. Achten Sie darauf, Stopper in jedem volumetrischen Kolben Chloroform aus verdampfen zu platzieren.
11. Fügen Sie ~ 1 g wasserfreies Natriumsulfat (Na₂SO₄) zu jedem der sechs 100-mL-Becher aus Schritt 2,9. Das Natriumsulfat hilft jede Spur von Wasser zu entfernen, die möglicherweise in der Chloroform-Extrakt.
12. Übertragen Sie die Lösungen zurück zu ihren respektierten Becher. Schwenken Sie vorsichtig um Austrocknung von Wasser in der Probe zu erleichtern.
13. Die Chloroform-Extrakte in eine Quarz Fluorimeter Zelle Dekantieren (Hinweis: Chloroform löst eine Kunststoff-Polystyrol-Zelle).

3. Auswahl der Erregung Wellenlänge

Bestimmen Sie die Anregung und Emission Wellenlängen durch Ausführen von Scans, dann einfach lesen Sie ab und zeichnen Sie der Fluoreszenzintensität aller Proben auf diese Werte auf. Die Anregung und Emission Bandbreiten sind voreingestellt, bei 5 nm. Der Komplex nimmt im nahen UV, so die Erregung Wellenlänge sollte etwa 385 nm. Zunächst, überwachen die Fluoreszenz bei 500 nm im Bereich Emission.

1. Auf die Fluorimeter stellen Sie sicher, dass sowohl die inneren und äußeren Lüfter in die Fluorimeter vor Einschalten der Xenon-Lampe eingeschaltet sind. Die Xenon-Lampe sehr heiß und benötigt ständige Kühlung.
2. Schalten Sie die Hochspannung (HV) an den PMT-Detektor auf 400 V.
3. Öffnen der Rollläden.
4. Die Daten-Übernahme-Programm auf dem Computer zu öffnen, hier ist es "100nmFluorScan".
5. Legen Sie die "Sample + 2 mL hinzugefügt" (2) Lösung in die Quarz-Zelle, für die Bestimmung der besten Anregung und Emission Wellenlängen zu verwenden.
6. Mit der Emissionswellenlänge anfänglich bei 500 nm, einen Erregung Scan von 335-435 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 2 nm/s laufen.
7. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Fluoreszenz Erregung Wellenlänge (EXλ_max), und legen Sie das Gerät auf diesen Wert.

4. Auswahl der Emissionswellenlänge

1. Legen Sie die Emissionswellenlänge Fluorimeter auf 450 nm.
2. Die Emission Wellenlängenbereich um einen 100 nm Scan von 450-550 nm eingestellt.
3. Um den Scan zu starten, klicken Sie die Schaltfläche "Start Test" auf dem Programm zur gleichen Zeit drücken die Schaltfläche "START" auf der Vorderseite der Fluorimeter.
4. Bestimmen Sie aus dem daraus resultierenden Fluoreszenz-Plot die maximale Fluoreszenz Emissionswellenlänge (EMλ_max) , und legen Sie das Gerät auf diesen Wert (Abbildung 2).

Abbildung 2. Bestimmung der optimalen EXλ_max und EMλ_Max. Wellenlängen.

5. Messung der Fluoreszenz der Proben

1. Alle Proben werden in EMλ_max und EXλ_maxausgeführt. Scans sind nicht für jede Probe, sondern nur der Fluoreszenz-Wert bei diesen Bedingungen erforderlich. Beginnend mit der am meisten verdünnten Probe (leer), Ort in einer Quarz-Zelle und dann im Instrument. Die fluoreszente Intensität in Lab Notebook aufzeichnen.
2. Wiederholen Sie für alle anderen Proben.
3. Denken Sie daran, dass die Relative Intensität der jeweiligen Lösung vor dem Erstellen des Diagramms Kalibrierung die leere Relative Intensität subtrahiert werden muss.

6. erstellen Standard Zusatz-Grundstück

1. Plot der Fluoreszenzintensität vs. µg von Al^{3 +} hinzugefügt.
2. Bestimmen Sie den kleinste-Quadrate-Wert der daraus resultierende Handlung, und zeichnen Sie die Steigung und Achsenabschnitt.
3. Bestimmen der µg von Al^{3 +} in der unbekannten Probe aus der Gleichung µg von Al^{3 +} = -b/m
4. Wissend, dass die unbekannte Aluminium ein Volumen von 25,0 mL hinzugefügt, um jede Probe hatte, bestimmen Sie die Konzentration von Aluminium in das unbekannte.

Die Methode der Standardaddition ist eine quantitative Analysetechnik, die verwendet wird, um Matrixeffekte zu minimieren, die die Messsignale des Analyten beeinträchtigen.

Unbekannte Komponentenkonzentrationen werden oft durch eine Reihe von Analysetechniken wie Lichtspektroskopie, Massenspektrometrie und Elektrochemie aufgeklärt. Die Messung kann jedoch durch andere Komponenten in der Probe beeinflusst werden, die als Matrix bezeichnet werden, und die versehentliche Reduzierung oder Verstärkung des Signals verursachen, die als Matrixeffekte bezeichnet werden. Diese Effekte können die Ergebnisse verzerren und zu erheblichen Fehlern bei der Analyse führen.

Die Methode der Standardaddition kann verwendet werden, um Matrixeffekte auf Messsignale zu minimieren. Dies geschieht durch Zugabe präziser Volumina einer bekannten Analytlösung zur Probe.

In diesem Video werden die Grundlagen der Methode zur Addition von Standards vorgestellt und gezeigt, wie die Technik im Labor mit Hilfe einer Fluoreszenzmessung durchgeführt wird.

Matrixeffekte können in komplexen Proben auftreten, in denen eine Reihe anderer Moleküle mit dem Analyten interagieren. Dies kann zum Beispiel der Fall sein, wenn Moleküle an den Analyten binden oder mit ihm agglomerieren und dadurch dessen Fluoreszenzfähigkeit verändern. Oder die Matrix kann die Ionenstärke der Gesamtlösung verändern, wodurch sich bestimmte Eigenschaften des Analyten ändern.

Um diese Effekte unter Verwendung der Methode der Standardaddition zu mildern, wird ein Bereich von Volumina einer Analyt-Standardlösung zu gleichen Volumina der Probe hinzugefügt. Die Lösungsvolumina werden dann mit Lösungsmittel angeglichen.

Anschließend wird das Signal für die Proben mit und ohne Standardzugabe gemessen. Die Daten werden als Intensität im Verhältnis zur Menge des Standards, der der Probe hinzugefügt wurde, dargestellt und nicht als klassische Kalibrierungskurve. Die tatsächliche Konzentration des Analyten in einem gegebenen Kolben wird durch die folgende Gleichung definiert. Die instrumentelle Reaktion entspricht einigen Konstanten mal der Konzentration des Analyten. Die resultierende Gleichung hat die lineare Form y=mx+b. Wenn also das Diagramm auf Null-Absorption extrapoliert wird, ist der Schnittpunkt gleich der unbekannten Konzentration der Probe.

Das Signaldiagramm muss über den bedenklichen Konzentrationsbereich linear sein. Außerdem sollte die Interferenz nicht variieren, wenn sich das Verhältnis von Analyt zu Probenmatrix ändert. Schließlich sollte die Matrix selbst keine Messsignale erzeugen.

Im folgenden Experiment wird Aluminium, eine nicht fluoreszierende Spezies, untersucht, indem es mit 8-Hydroxychinolin oder 8HQ reagiert wird, um den fluoreszierenden ALQ3-Komplex zu bilden.

Die Fluoreszenz des Aluminiumkomplexes in einem organischen Lösungsmittel wird gemessen und dann mit der Konzentration der ursprünglichen Aluminiumlösung in Beziehung gesetzt. Dieser Ansatz ist bei der Analyse von Metallionen üblich.

Nachdem nun die Grundlagen der Methode der Standardaddition umrissen und die Grundlagen des Experiments erklärt wurden, führen wir die Technik im Labor durch.

Bereiten Sie zuerst die 100-ppm-Aluminium-Stammlösung in Wasser vor und verwenden Sie sie dann, um eine 1-ppm-Standardlösung herzustellen.

Geben Sie anschließend 2 g 8-Hydroxychinolin oder 8HQ in einen 100-ml-Messkolben.

Fügen Sie vorsichtig 5,74 ml Eisessig hinzu und verdünnen Sie sie dann mit entionisiertem Wasser bis zur 100-ml-Marke. Dieser Schritt ermöglicht es dem 8HQ, sich in der wässrigen Phase aufzulösen.

Bereiten Sie als Nächstes den Puffer vor, indem Sie 20 g Ammoniumacetat und 7 ml 30 % Ammoniumhydroxid in eine mit 100 ml gekennzeichnete Flasche geben und verdünnen. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Indikatorstab. Dieser Puffer hilft, die Säure in der 8HQ-Lösung zu neutralisieren, wenn er kombiniert wird.

Zu den weiteren benötigten Reagenzien gehören wasserfreies Natriumsulfat und Chloroform in spektrophotometrischer Qualität.

Bereiten Sie nun die Proben vor, in diesem Fall durch Extraktion der wässrigen Probe in die organische Phase mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion. Platzieren Sie sechs 125-ml-Scheidetrichter auf Ringständeringen in der Haube. Stellen Sie sicher, dass alle Glaswaren peinlich sauber sind, da schmutzige Glaswaren die Ergebnisse verzerren. Beschriften Sie die Trichter nacheinander mit "leer", "0", "1", "2", "3" und "4".

Geben Sie mit einer Pipette 25 ml der unbekannten Aluminiumlösung in jeden der fünf Scheidetrichter, die mit "0" bis "4" gekennzeichnet sind. Bereiten Sie den Rohling vor, indem Sie 25 ml entionisiertes Wasser in den Trichter mit der Bezeichnung "Rohling" geben.

Geben Sie als Nächstes 1, 2, 3 und 4 ml der 1-ppm-Standardlösung in die entsprechenden nummerierten Trichter. Fügen Sie dem leeren oder 0-Trichter keine Standardlösung hinzu.

Geben Sie jeweils 1 mL der 8HQ-Lösung und 3 mL Pufferlösung in jeden der 6 Trichter.

Eine Flüssig-Flüssig-Extraktion wird durchgeführt, indem jedem Kolben 10 ml Chloroform zugesetzt werden. Schütteln Sie den Trichter kräftig und entlüften Sie ihn gelegentlich, um den Druckaufbau abzubauen. Setzen Sie den Trichter wieder in den Ring ein und lassen Sie die Flüssigkeitsschichten sich trennen.

Sammeln Sie anschließend die Chloroformphase in einem sauberen, trockenen und beschrifteten 100-ml-Becherglas. Da Chloroform eine höhere Dichte als Wasser hat, ist es die untere Schicht im Trichter.

Den Chloroform-Extrakt in einen 25-ml-Messkolben überführen und jeden Kolben verschließen, um eine Verdunstung zu verhindern.

Führen Sie eine zweite Flüssig-Flüssig-Extraktion mit der verbleibenden wässrigen Lösung durch, indem Sie jedem Trichter 10 ml Chloroform hinzufügen. Schütteln Sie den Trichter wie zuvor, um den verbleibenden Analyten in die Chloroformphase zu überführen. In der oberen wässrigen Phase sollte keine gelbe Farbe mehr vorhanden sein.

Die zweite Extraktion wird für jeden Trichter wiederholt und dann die Chloroformphasen in den entsprechenden beschrifteten Bechern gesammelt. Das gesammelte Chloroform wird in die entsprechenden Messkolben gefüllt und bis zur Marke mit frischem Chloroform verdünnt.

Um Spuren von Wasser zu entfernen, geben Sie etwa 1 g wasserfreies Natriumsulfat in jedes der sechs 100-ml-Becher. Übertragen Sie die Lösungen zurück in ihre jeweiligen Becher und schwenken Sie, um die Dehydrierung der Probe zu erleichtern.

Dekantieren Sie den Chloroform-Extrakt in eine Quarzfluorimeterzelle.

Stellen Sie das Fluorimeter gemäß den Anweisungen des Herstellers auf und stellen Sie die Spannung auf 400 V ein. Öffnen Sie anschließend das Datenerfassungsprogramm auf dem Computer.

Verwenden Sie Probe 2, um die besten Anregungs- und Emissionswellenlängen zu bestimmen. Stellen Sie die Emissionswellenlänge auf 500 nm ein, und führen Sie einen Anregungscan von 335 bis 435 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 2 nm/s durch.

Bestimmen Sie aus dem Fluoreszenzdiagramm die maximale Wellenlänge für die Anregung. Stellen Sie das Gerät auf diesen Wert der Anregungswellenlänge ein, in diesem Fall 399 nm.

Bestimmen Sie als Nächstes die Emissionswellenlänge, indem Sie einen Scan von 450-550 nm durchführen. Bestimmen Sie aus dem resultierenden Fluoreszenzdiagramm die maximale Wellenlänge und stellen Sie die Emissionswellenlänge ein, in diesem Fall 520 nm.

Messen Sie jede Probe, einschließlich des Rohstreifens, bei der ausgewählten Anregungs- und Emissionswellenlänge. Zeichnen Sie jeden Messwert der Fluoreszenzintensität auf.

Subtrahieren Sie die gemessene Fluoreszenz der Blindprobe von jeder der anderen 5 Proben.

Plotten Sie die Fluoreszenzintensität jeder der fünf Proben im Vergleich zur Menge an Aluminium, die der Probe zugesetzt wurde. Bestimmen Sie den Wert der kleinsten Quadrate des resultierenden Diagramms, und zeichnen Sie die Steigung und den Schnittpunkt auf.

Das Diagramm der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Menge des zugesetzten Aluminiums ergab eine Linie des kleinsten Quadrats, wie gezeigt. Über diese Linie kann dann die Menge an Aluminium in der Probe berechnet werden. Da die Menge der unbekannten Zugabe 25 mL betrug, wird der ermittelte Wert von 2,916 μg durch 25 ml dividiert. Dies ergibt ein Endergebnis von 0,117 μg/ml oder 0,117 ppm. Das liegt recht nahe am bekannten Wert von 0,110 ppm.

Schauen wir uns nun einige andere Analysetechniken an, die aufgrund von Matrixeffekten zu verzerrten Ergebnissen führen können.

Die Atomabsorptionsspektroskopie ist eine analytische Methode, die die Absorption von Licht durch einen Zielanalyten in der Gasphase misst. Für die meisten Proben kann eine einfache Kalibrierkurve, die die Absorption mit der Probenkonzentration in Beziehung setzt, als zuverlässige Methode zur Quantifizierung einer unbekannten Konzentration dienen.

Diese Technik kann jedoch an Genauigkeit verlieren, wenn andere Komponenten des Gemisches mit dem Zielanalyten interagieren und die Absorption unterdrücken oder verstärken. In diesem Fall kann die Standardadditionsmethode verwendet werden, um die Auswirkungen dieser Wechselwirkungen zu berücksichtigen, insbesondere bei Proben, bei denen die Matrix vor der Analyse nicht entfernt werden kann.

Die Kalibrierung des Messgeräts spielt eine entscheidende Rolle für die Genauigkeit einer Messung. Die Methode der Standardaddition wird häufig verwendet, um die Kalibrierung von Instrumenten wie ICP-MS zu unterstützen. ICP-MS ist eine Vergleichsmethode, d.h. die Messung einer unbekannten Probe basiert auf der Messung eines chemischen Standards.

Daher kann die Unsicherheit einer Messung eines Unbekannten nicht besser sein als die Unsicherheit der Kalibrierung. Die Methode der Standardaddition kann daher verwendet werden, um eine Kalibrierkurve zu erstellen, die genauer ist als die Standardmethode und Matrixwechselwirkungen in der Probe berücksichtigt.

Viele biologische Moleküle werden mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Die HPLC ist eine Technik, die komplexe Gemische auf der Grundlage von Moleküleigenschaften wie Polarität, Ladung und Größe trennt und analysiert. Der Zeitpunkt, zu dem der Analyt die Säule verlässt, ermöglicht es dem Benutzer, jede Komponente im Gemisch zu identifizieren.

Biologische Moleküle können oft in einem Gemisch interagieren und werden stark von der Matrix beeinflusst, in der sie suspendiert sind. Häufig wird die Methode der Standardaddition verwendet, um eine Kalibrierkurve zu erstellen, die diese Auswirkungen berücksichtigt.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Methode der Standardaddition gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie Sie die Technik ausführen, um Matrixeffekte in der Stichprobenanalyse zu berücksichtigen.

Danke fürs Zuschauen!