Extraktion von DNA aus Bakterienkolonien

(1) Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion

1. Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.
2. Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Agitieren Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker für 15 min. Fügen Sie 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, die Mischung dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur von 60-65 ° C für 60 min inkubieren.
3. Gleichmäßig verteilen die Probe unter separaten 50-mL-Tuben und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand aus den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.
4. Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, etwa 200 mL, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.
5. Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.
6. Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (Verhältnis Mischung aus 25:24:1) hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.
7. Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.
8. Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. Die Menge an DNA wird aus der 260 nm Lesung geschätzt. Eine Extinktion Lektüre von 1,0 entspricht 50 µg DNA pro mL Lösung. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.
9. Die Reinheit der DNA dürfte sich aus dem Verhältnis der Lesung bei 260 nm, bei 280 nm. Einen Wert > 1.7 zeigt relativ reines DNA. Der theoretische Maximalwert ist 2.0.