2.6: Extraktion von DNA aus Bakterienkolonien

(1) Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion

1. Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.
2. Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Agitieren Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker für 15 min. Fügen Sie 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, die Mischung dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur von 60-65 ° C für 60 min inkubieren.
3. Gleichmäßig verteilen die Probe unter separaten 50-mL-Tuben und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand aus den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.
4. Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, etwa 200 mL, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.
5. Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.
6. Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (Verhältnis Mischung aus 25:24:1) hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.
7. Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.
8. Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. Die Menge an DNA wird aus der 260 nm Lesung geschätzt. Eine Extinktion Lektüre von 1,0 entspricht 50 µg DNA pro mL Lösung. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.
9. Die Reinheit der DNA dürfte sich aus dem Verhältnis der Lesung bei 260 nm, bei 280 nm. Einen Wert > 1.7 zeigt relativ reines DNA. Der theoretische Maximalwert ist 2.0.

Die DNA-Extraktion in Bakteriengemeinschaften ist ein Prozess, bei dem DNA von mehreren Bakterienarten innerhalb einer Gemeinschaft während eines einzigen Extraktionsverfahrens gewonnen wird.

Traditionelle Analysen von mikrobiellen Gemeinschaften im Boden beinhalten in der Regel kulturelle Assays, bei denen Verdünnungs- und Plattierungsmethoden auf verschiedenen selektiven Medien verwendet werden. Viele Bakterien wachsen jedoch unter Laborbedingungen oder auf den ausgewählten Wachstumsmedien schlecht, was bedeutet, dass sie übersehen oder stark unterrepräsentiert sein können.

In jüngster Zeit hat die Extraktion von Gemeinschafts-DNA aus Bodenbakterienproben eine umfassendere Probenahme von Bakteriengemeinschaften ermöglicht. Es wird angenommen, dass dieser nicht-kulturbasierte Ansatz repräsentativer für die tatsächlich vorhandenen Gemeinschaften ist als traditionelle kulturbasierte Methoden.

In diesem Video wird eine Nicht-Kulturmethode zur Extraktion von DNA aus Bakteriengemeinschaften demonstriert, wie die Qualität und Quantität der extrahierten DNA überprüft werden kann und wie diese DNA zur Untersuchung der bakteriellen Vielfalt verwendet werden kann.

Die DNA-Extraktion aus dem Boden kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Bei der Fraktionierungsmethode werden die Zellen zunächst von der Bodenmatrix getrennt, bevor das Erbgut extrahiert wird. Die Probe wird dann aufeinanderfolgenden Zyklen des Mischens und der langsamen Zentrifugation unterzogen, um intakte Zellen in einem Pellet zu sammeln.

Lysozyme werden dann zu den Zellen hinzugefügt, und die Suspension wird inkubiert. Lysozyme sind Enzyme, die bakterielle Zellwände aufbrechen. Sobald die Zellwandstruktur beeinträchtigt ist, kann die DNA für die Reinigung freigegeben werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine zweite Methode der DNA-Extraktion in der Gemeinschaft, die In-situ-Methode, eine höhere DNA-Konzentration ergibt.

Hier wird eine Masse Erde mit einem gleichwertigen Volumen an Tris-EDTA-Extraktionspuffer und Glasperlen kombiniert und aggressiv gemischt, um die Trennung der Zellen von den Bodenpartikeln zu erleichtern. Dann wird ein Detergens hinzugefügt, in der Regel Natriumdodecylsulfat oder SDS, und die Probe wird weiter gemischt, um die Lyse der Zellen und die Freisetzung ihres Inhalts, einschließlich der DNA, zu fördern.

Anschließend wird eine Inkubation bei hoher Temperatur durchgeführt, um alle verbleibenden Bakterienzellen zu lysieren. Die Proben werden zentrifugiert, und es wird eine Polyethylenglykol-Extraktion und Inkubation an dem Überstand durchgeführt, um die DNA auszufällen, die dann zu einem Pellet zentrifugiert wird.

Die DNA wird in TE-Puffer und Kaliumacetat resuspendiert, um die DNA von Proteinen und Polysacchariden weiter zu waschen, dann wird eine Zentrifugation durchgeführt, um diese unerwünschten Bestandteile zu pelletieren. Der wässrige Überstand, der die DNA enthält, wird entfernt und einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Isopropanol-Fällung unterzogen, um die DNA weiter zu reinigen und zu konzentrieren. Nach einer zweistündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird die DNA zentrifugiert und zur Lagerung bis zur Analyse in TE-Puffer resuspendiert.

Nachdem wir nun mit den Konzepten und Prozessen hinter der DNA-Extraktion in der Bakteriengemeinschaft vertraut sind, werfen wir einen Blick darauf, wie sie im Labor durchgeführt wird.

Um den Vorgang zu beginnen, wiegen Sie 100 g gesiebte Erde ab. Geben Sie dies in ein Polypropylengefäß und fügen Sie 100 ml Extraktionspuffer hinzu, der aus Tris-Puffer besteht, der mit EDTA angereichert ist, um die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix zu fördern, und dann von Hand schütteln.

Wiegen Sie anschließend 100 g Glasperlen ab und geben Sie diese in das Mischgefäß. Die Probe wird 5 Minuten lang mit einem Perlschlaggerät oder einem mechanischen Schüttler am Handgelenk gerührt. Fügen Sie der Mischung 10 ml 20% Natriumdodecylsulfat oder SDS hinzu und rühren Sie dann eine weitere Minute lang. Inkubieren Sie die Probe 60 Minuten lang bei hoher Temperatur.

Verteilen Sie die Probe gleichmäßig auf separate 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 6.000 x g. Den Überstand aus den Röhrchen in einen sterilen Behälter überführen. Wiederholen Sie anschließend die Extraktion auf dem Bodenpellet wie zuvor beschrieben mit einem frischen Volumen Extraktionspuffer.

Geben Sie anschließend das Gesamtvolumen des verarbeiteten Überstands in ein sauberes 50-ml-Röhrchen, das zur Hälfte mit einer Lösung aus 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid gefüllt ist. Die Flaschen zum Mischen mehrmals von Hand umdrehen und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten, um die DNA zu pelletieren.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig aus dem Zentrifugenröhrchen, wobei das teilweise gereinigte Nukleinsäurepellet zurückbleibt. Fügen Sie 20 ml TE-Puffer und 1,5 ml einer 7,5 M Kaliumacetatlösung hinzu, um das Pellet zu resuspendieren, und wirbeln Sie es dann vortexen. Legen Sie die Suspension für 5 Minuten auf Eis. Zentrifugieren bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ? C zur Ausfällung von Proteinen und Polysacchariden.

Geben Sie dann eine RNAse und Proteinase K in die Probe, mischen Sie sie vorsichtig von Hand und lassen Sie sie einen Moment ruhen. Geben Sie ein äquivalentes Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol in die zu extrahierende Suspension und mischen Sie vorsichtig von Hand. Zentrifugieren Sie das Präparat für 10 min bei 13.000 x g. Nehmen Sie das Gefäß vorsichtig aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.

Die untere, schwerere Schicht besteht aus dem Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol und den extrahierten Rückständen, und die oberste Schicht ist die wässrige Schicht und enthält die DNA. Geben Sie die wässrige Phase in ein steriles Gefäß, fügen Sie ein äquivalentes Volumen Isopropanol hinzu und invertieren Sie vorsichtig, um die DNA-Fällung einzuleiten. Inkubieren Sie die Suspension 2 h lang bei Raumtemperatur. Pelletieren Sie die gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 30 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, da die pelletierte DNA am Boden des Gefäßes sichtbar sein kann oder nicht, und resuspendieren Sie dann in 1 ml TE-Puffer.

Messen Sie mit einem Spektralphotometer oder einem DNA/RNA-Quantifizierungsfluorimeter den aus der Probe extrahierten DNA-Gehalt. DNA/RNA-Fluorimeter geben DNA-Werte in Einheiten von Nanogramm pro Milliliter aus. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Suspension mit Wasser in molekularer Qualität auf 1 bis 10 oder 1 bis 100.

Sobald die DNA aus einer Bakteriengemeinschaft gewonnen wurde, kann diese auf verschiedene Weise genutzt werden. Einige dieser Anwendungen werden hier untersucht.

Spektrofotografische Analysen der DNA, die aus der Gemeinschafts-DNA extrahiert wird, können Aufschluss über die Anzahl der Bakterienzellen geben, die in einer bestimmten Bodenprobe vorhanden sind. Die geschätzte Menge an DNA in ng pro ml Lösung kann mit dem Gesamtvolumen der in Lösung extrahierten DNA in Beziehung gesetzt werden, um die Gesamtmenge an DNA pro g Boden zu erhalten. Wenn man den theoretischen Wert der DNA pro Zelle kennt, kann die Gesamtzahl der Zellen pro g Boden berechnet werden.

Für gezieltere Anwendungen kann DNA, die aus Bakteriengemeinschaften extrahiert wurde, einer PCR unterzogen werden, um festzustellen, ob eine bestimmte Spezies in der Gemeinschaft vorhanden ist. So können Wissenschaftler beispielsweise herausfinden, ob Bodenproben bestimmte Krankheitserreger wie Clostridium perfringens oder Bacillus anthracis enthalten.

Um ein umfassenderes Verständnis der in einer Gemeinschaft vorhandenen Bakterien zu erhalten, können DNA-Proben einer "omischen" und bioinformatischen Charakterisierung unterzogen werden, die eine tiefere Analyse der ursprünglichen Bakterien in der Probe ermöglicht. ? Omics? Beschreibt eine Reihe von Technologien, die Rollen, Beziehungen und Wirkungen von Molekülen in Organismen oder Gemeinschaften untersuchen. Dazu gehört auch die Erforschung von Genen und ihrer Funktion, oder ? Genomik?, und ? Proteomik?, die Erforschung von Proteinen und ihrer Rolle. Zum Beispiel die Sequenzierung von 16S? RNA aus den Proben kann eine metagenomische Bestimmung bestimmter Spezies innerhalb der Gemeinschaft ermöglichen, was eine detailliertere Abschätzung der Diversität ermöglicht. Dieser Ansatz kann den Wissenschaftlern ein besseres Verständnis für die Artenzusammensetzung einer Gemeinschaft und die Rollen vermitteln, die sie möglicherweise einnehmen.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die DNA-Extraktion von Bakteriengemeinschaften gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie man DNA aus einer Bakteriengemeinschaft extrahiert, wie man die Qualität dieser DNA überprüft und wie diese DNA für Untersuchungen der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft verwendet werden kann. Danke fürs Zuschauen!