Name: Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer hämatopoetischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus und deren Elektroporation zur Untersuchung von Mastzellen und Basophilen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Harvesting Knochenmark aus Oberschenkel-und Schienbein <ol><li> Der erste Schritt des Verfahrens ist es, dem Knochenmark aus dem Oberschenkel-und Schienbein einer 6 Ernte - bis 12-Wochen alten Maus (wir sind mit BALB / c-Mäusen, aber Sie können diesen Vorgang mit jeder Maus-Stamm zu tun). Um zu beginnen, euthanize der Maus durch CO 2-Inhalation (wird nicht angezeigt). Ernte Oberschenkelknochen und Schienbein von den Hinterbeinen eines jeden. Dann, mit einer Rasierklinge geschnitten jedem Ende der Oberschenkel auf die Hüft-und Kniegelenke zu entfernen und bis auf die Knochen freizulegen. </li><li> In ähnlicher Weise geschnitten jedem Ende der Tibia, die Knie-und Sprunggelenk angrenzenden Regionen zu entfernen und bis auf die Knochen freizulegen. </li><li> Nehmen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel und füllen es mit RPMI mit 10% FBS, Penicillin, Streptomycin und beta-Mercaptoethanol (BME = 100 uM) ergänzt. Mit Pinzette, halten Sie die Knochen über eine Petrischale mit RPMI-Medien. Legen Sie die Nadel der Spritze in das eine Ende des Knochens und drücken Sie den Kolben zu spülen, das Knochenmark. Die Kanüle kann auf und ab bewegt im Inneren der Knochen zu spülen verbleibende Knochenmark werden. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für alle die Knochen, und fahren Sie dann mit Gründung der Kulturen. </li></ol> Gründung Kulturen <ol><li> Zum Aufbau der Knochenmark-Kulturen, die Pipette gespült Knochenmark nach oben und unten mehrmals zum Aufbrechen der Gewebe in einer Zellsuspension. </li><li> Legen Sie einen 70-Mikron-Filter auf einem 50 mL konischen Rohr, und fügen Sie die Zellsuspension auf den Filter. </li><li> Spülen Sie die Petrischale einmal mit RPMI, fügen Sie dann die zu den 70-Mikron-Filter zu spülen. </li><li> Mit dem Gummi Ende einer 1 mL Spritzenkolben, schleifen das Knochenmark Stücke übrigen auf der 70-Mikron-Filter. </li><li> Waschen Sie den Filter einmal mit RPMI. </li><li> Nach dem Waschen der Filter, Zentrifugen der Zellsuspension bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Zellpellet durch Resuspendieren in PBS. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Wir in der Regel erhalten ~ 90 Millionen Zellen von einer Maus die Knochen (zwei Oberschenkelknochen sowie zwei tibiae). Nach Auszählung der Zellen, Zentrifuge sie wieder bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge RPMI und aliquoten sie in Zellkulturflaschen mit RPMI genug, so dass die Endkonzentration 1 Million Zellen pro ml ist. </li><li> Add Zytokine auf die Entwicklung Ihres Zelltyp von Interesse zu fördern. In diesem Fall ist das Zytokin Interleukin-3 (IL-3 = 10 ng / mL) zugegeben, um die Entwicklung von Basophilen und Mastzellen zu fördern. Zum Erwerb Basophile, für 10 Tage bebrüten. Für Mastzellen, für 5 Wochen bebrüten. Bei der Generierung von Mastzellen, die Medien und IL-3 sollte einmal pro Woche gewechselt werden. </li><li> Hier ist ein Blick darauf, wie Mastzellen sollten unmittelbar nach der Beschichtung auftreten. Dieses Bild zeigt die Differenzierung der Mast Knochenmarkzellen in Basophilen und Mastzellen 10 Tage nach der Zugabe von Interleukin-3. </li><li> Sobald die gewünschten Zelltyp erhalten, mit der Elektroporation Schritt fort. </li></ol> Elektroporation Cells <ol><li> Zu Beginn der Elektroporation Schritt bestimmen die Anzahl der Zellen in der Kulturflasche. </li><li> Cells sind typischerweise bei einer Dichte von 10 Millionen pro ml elektroporiert, so übertragen die erforderliche Zellzahl auf konische Röhrchen und zentrifugieren bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Nach dem Zentrifugieren absaugen Medien, waschen Sie die Zellen mit 1X PBS, und Zentrifuge wieder bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie das PBS und fügen Bio-Rad Gene Pulser Elektroporation Puffer, um eine Zellsuspension von 10 Millionen Zellen pro ml zu machen. </li><li> Nach dem Resuspendieren der Zellen, fügen Sie die gewünschten Plasmid-DNA in einer Endkonzentration von 10 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter. </li><li> Aliquot 150 Mikroliter der Zellsuspension in die Vertiefungen Ihrer Wahl auf eine 96-Well Platte Elektroporation. </li><li> Legen Sie die Elektroporation Platte in der MXcell Platte Kammer und den Deckel schließen. </li><li> Vor der Transfektion von Mastzellen, muss eine Elektroporation Protokoll in die MXcell es sei denn, mit einem vorgegebenen oder gespeicherte Protokoll programmiert werden. Durch Optimierung Experimenten haben wir herausgefunden, dass die höchste Transfektionseffizienz von Mastzellen kommen mit Rechteckimpuls-Protokolle. Wir werden die Elektroporation Bedingungen auf der Platte zu variieren, um 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms und 350V/10ms Rechteckimpulse bei 2000uF und 1000 Ohm zu liefern. Sobald das Protokoll festgelegt wurde und geladen auf das Gerät, drücken Sie &quot;Pulse&quot;, um die Zellen elektroporieren. </li><li> Nach der Elektroporation abgeschlossen ist, übertragen Sie die Zellen einer Gewebekultur Platte. Wir typischerweise Transfer je 150 Mikroliter Elektroporation Probe auf ein gut in einer 48-well Zellkultur-Platte mit 300 Mikroliter RPMI (ergänzt mit 10% FCS, Penicillin, Streptomycin und beta-Mercaptoethanol) mit 10 Nanogramm pro ml Interleukin-3. Die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C, dann analysiert 24 Stunden später für die Expression und Unterdrückung. </li></ol> Transfection Ergebnisse Die Fluoreszenz-Mikroskopie Bild der Zellen nach erfolgreicher Elektroporation mit 20 Mikrogramm pro ml GFP-Plasmid ist in dem Video zu sehen. Mit dem MXcell Elektroporationssystem Transfektionseffizienz von ca. 30% erzielt werden kann. Das System ermöglicht Ihnen, die Bedingungen zu Ihrem Transfektionseffizienz zu maximieren variieren, dabei jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen.

Da immer mehr genomische Information entsteht und neue Werkzeuge wie siRNA entwickelt werden, hat die Verwendung von physiologisch relevanten Zellen immer mehr an Bedeutung für unser Verständnis der Krankheit Wege, Protein-Protein-Interaktionen und Signaltransduktion weiter. Primäre Zellen werden direkt von Geweben oder Flüssigkeiten gewonnen und in vitro kultiviert. Diese Zellen können in eine Reihe von Möglichkeiten, unter anderem durch die Einführung von exogenen genetischen Materials verändert werden. Es wird immer offensichtlicher, dass der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primäre Zellen einzuschleusen Elektroporation ist. Elektroporation macht Zellen in elektrische Impulse um vorübergehend erhöhen die Durchlässigkeit der Zellmembran, wodurch exogene Nukleinsäuren in die Zelle eindringen. Diese Methode der Transfektion optimiert, um die Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen / Leitungen und somit können an Mastzellen transfizieren werden sowie alle anderen Knochenmark stammende Zellen unterzubringen. Außerdem, im Gegensatz viral-vermittelte Transfektion, Elektroporation ist nicht Grenzen für die Größe der transfizierten DNA, noch erfordert umfangreiche Vorbereitungen. Im Gegensatz zu Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation kann weniger toxisch sein und nicht in endosomalen Abfangen der transfizierten Nukleinsäure führen. Bio-Rad hat die MXcell Elektroporation, das speziell für diese Zellen entwickelt. die MXcell können Sie variieren, um Ihre Transfektionseffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Um die Transfektionseffizienz zu optimieren und Zelltod, eine Vielzahl von Elektroporation Parameter einschließlich Spannung, können Kapazität, Widerstand, und Pulslänge eingestellt und bewertet werden.

<table><tbody><tr><td>Genpulser-MXcell-Elektroporationsystem</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationspuffer für Genpulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

die herstellung von primären hämatopoetischen zellkulturen aus knochenmark der maus für die elektroporation

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Es wird immer deutlicher, dass die Elektroporation der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primären Zellen einzuführen. Die Gene Pulser MXcell Elektroporation und Gene Pulser Elektroporation Puffer wurden speziell entwickelt, um Nukleinsäuren in Säugerzellen und schwer zu transfizieren Zellen, wie Primär-und Stammzellen cells.This Video transfizieren demonstriert, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren , und dann bereiten sie für die Elektroporation in den MXcell System. Wir beginnen mit der Isolierung von Ober-und Unterschenkels. Knochenmark aus beiden Ober-und Unterschenkels werden dann geerntet und Kulturen etabliert. Cultured Knochenmarkzellen werden dann transfiziert und analysiert.

Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Es wird immer deutlicher, dass die Elektroporation der effektivste Weg ist, um Plasmid-DNA oder siRNA in Primärzellen einzubringen. Der Gene Pulser ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Gewinnung der Femora und Tibiae von Mäusen. Nach Entfernung der Hüft-, Knie- und Sprunggelenke wird das Knochenmark durch Injektion von RPMI-Medium in das offene Ende des Knochens isoliert. Nach der Herstellung einer Einzelzell-Suspension werden die Knochenmarkzellen zu Mastzellen differenziert, in 96-Well-Elektroporationsplatten gefüllt und anschließend transfiziert.Unter Verwendung des Genpuls- oder MX-Zellelektroporationssystems. Mit Rechteckwellen-Pulsprotokollen können Transfektionseffizienzen von etwa 30 % erzielt werden. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, Knochenmark aus dem Femur und der Tibia eines sechs bis zwölf Wochen alten Mäuses zu gewinnen.Beginnen Sie damit, die Maus durch Inhalation von CO2 zu euthanasieren, und entnehmen Sie den Femur und die Tibia der Hinterbeine jeder Maus. Schneiden Sie anschließend mit dem Rasiermesser beide Enden des Femurs ab, um die Hüft- und Kniegelenke zu entfernen und das Mark auf ähnliche Weise freizulegen. Schneiden Sie beide Enden der Tibia ab, um die angrenzenden Bereiche von Knie und Sprunggelenk zu entfernen und das Mark freizulegen.Nehmen Sie als Nächstes eine Spritze mit einer Nadel der Stärke 26,5 und geben Sie RPMI, das mit 10 % FBS, Penicillin, Streptomycin, Beamer, Capta-Ethanol und L-Glutamin ergänzt wurde, hinzu. Halten Sie mithilfe einer Pinzette den Knochen über eine Petrischale, die RPMI-Medium enthält. Führen Sie die Nadel der Spritze in eines der beiden Enden des Knochens ein und drücken Sie den Kolben zusammen, um das Knochenmark auszuspülen.Die Spritzennadel kann innerhalb des Knochens auf und ab bewegt werden, um das verbleibende Mark auszuspülen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Knochen und fahren Sie anschließend mit der Einrichtung der Kulturen fort. Um die Knochenmarkkulturen anzulegen, pipettieren Sie das ausgespülte Knochenmark mehrmals auf und ab, um das Gewebe in eine Zellsuspension aufzulösen.Platzieren Sie dann einen 70-Mikron-Filter auf einem 50-Milliliter-Konischgefäß und geben Sie die Zellsuspension auf den Filter. Spülen Sie anschließend die Petrischale einmal mit RPMI aus und geben Sie die Spülflüssigkeit auf den 70-Mikron-Filter. Zerkleinern Sie mithilfe des gummierten Endes eines 1-Milliliter-Spritzenstößels die auf dem 70-Mikron-Filter verbliebenen Knochenmarkstücke.Spülen Sie den Filter nach dem Waschen des Filters einmal mit RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten bei 1200 U/min. Waschen Sie das Zellpellet, indem Sie es in PBS resuspendieren.Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Typischerweise erhalten wir etwa 90 Millionen Zellen aus den Knochen einer Maus, zwei Femora und zwei Tibiae. Nach der Zellzählung zentrifugieren Sie die Zellen erneut mit 1200 U/min für fünf Minuten.Suspendieren Sie die Zellen in einer kleinen Menge RPMI und aliquotieren Sie sie in Zellkulturflaschen, die so viel RPMI enthalten, dass die endgültige Konzentration 1 Million Zellen pro Milliliter beträgt. Fügen Sie anschließend Zytokine hinzu, um die Differenzierung Ihres gewünschten Zelltyps zu fördern. In diesem Fall wird das Zytokin Interleukin-3 hinzugefügt, um die Entwicklung von Basophilen und Mastzellen zu unterstützen. Für die Gewinnung von Basophilen erfolgt eine Inkubation über 10 Tage, für Mastzellen eine Inkubation über fünf Wochen.Das Medium und IL-3 sollten einmal wöchentlich gewechselt werden. Hier sehen Sie, wie Knochenmarkzellen unmittelbar nach der Aussaat aussehen sollten. Diese Aufnahme zeigt die Differenzierung von Knochenmarkzellen in Basophile und Mastzellen 10 Tage nach Zugabe von Interleukin-3.Nachdem der gewünschte Zelltyp erhalten wurde, fahren Sie mit dem Elektroporationschritt fort. Beginnen Sie den Elektroporationschritt, indem Sie die Anzahl der Zellen in der Kultur bestimmen. Zellen aus Kolben werden typischerweise mit einer Dichte von 10 Millionen pro Milliliter elektroporiert.Überführen Sie die erforderliche Zellanzahl in kegelförmige Röhrchen und zentrifugieren Sie diese bei 1200 U/min für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation saugen Sie das Medium ab, waschen die Zellen mit einem Mal PBS und zentrifugieren erneut bei 1200 U/min für fünf Minuten. Danach saugen Sie den PBS ab und geben BioRad Gene Pulser Elektroporationspuffer hinzu, um eine Zellsuspension mit 10 Millionen Zellen pro Milliliter herzustellen.Nachdem die Zellen resuspendiert wurden, die gewünschte Plasmid-DNA in einer Endkonzentration von 10 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Die Zellsuspension vorsichtig mischen und 150 Mikroliter der Zellsuspension in die gewünschten Vertiefungen einer 96-Loch-Elektroporationsplatte pipettieren. Danach die Elektroporationsplatte in die MXL-Plattenkammer einsetzen und den Deckel vor der Transfektion von Knochenmarkzellen und der Elektroporation schließen.Das Protokoll muss in das MXL programmiert werden, es sei denn, ein voreingestelltes oder gespeichertes Protokoll wird verwendet. Durch Optimierungsexperimente haben wir festgestellt, dass die höchsten Transfektionseffizienzen von Knochenmarkzellen bei Verwendung von Rechteckwellen-Puls-Protokollen erreicht werden. Wir werden die Elektroporationsbedingungen auf der Platte variieren, um Rechteckwellenpulse mit 2000 Mikrosekunden bei eintausend Ohm zu erzeugen. Sobald das Protokoll festgelegt und auf das Gerät geladen wurde, drücken Sie „Puls“, um die Zellen nach der Elektroporation zu behandeln. Danach überführen Sie die Zellen in eine Zellkulturplatte.Wir überführen normalerweise jede 150-Mikroliter-Elektroporationsprobe in eine Vertiefung einer 48-Loch-Gewebekulturplatte, die 300 Mikroliter RPMI mit 10 Nanogramm pro Milliliter enthält. Interleukin-drei-Zellen werden über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert und 24 Stunden später auf Expression und Suppression analysiert. Dies ist ein fluoreszenzmikroskopisches Bild der Zellen.Nach erfolgreicher Elektroporation unter Verwendung von 20 Mikrogramm pro Milliliter GFP-Plasmid mit dem MX-Zell-Elektroporationsystem können Transfektionseffizienzen von etwa 30 % erzielt werden. Das System ermöglicht es Ihnen, die Bedingungen zu variieren, um die Transfektionseffizienz zu maximieren, während die Zellviabilität erhalten bleibt. Das MX-Zell-System ist besonders nützlich für primäre Säugetierzellen wie diese murinen hämatopoetischen Zellen.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Knochenmarkzellen von Mäusen isoliert und differenzierte Mastzellen mit dem MX-Zellelektroporationssystem transfiziert. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Verfahren zeigt, wie die Gene Pulser MXcell Elektroporation System nutzen, um schnell und einfach identifizieren die besten Bedingungen für die Elektroporation embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) oder andere Primärzellen. Überlegungen zur Fehlerbehebung sind auch in den zugehörigen Video diskutiert.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Hier wird ein Protokoll zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Analyse hämatopoetischer Stammzellkulturen der Maus unter Verwendung von ex vivo Polyvinylalkohol-basierter Expansion sowie Methoden zur genetischen Manipulation dieser Zellen durch lentivirale Transduktion und Elektroporation vorgestellt.

Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Lernen Sie die Isolierung primärer hämatopoetischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus und deren Elektroporation zur Untersuchung von Mastzellen und Basophilen.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Weitere Videos entdecken