Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte des Assays zur neuralen Induktion im Hühnerembryo. Zunächst wird das Wirtsembryo in eine neue Kultur ausplantiert, das Spenderembryo wird in Salzlösung ausplantiert und der Hensonsche Knoten mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert. Der Hensonsche Knoten wird aus dem Spenderembryo ausgeschnitten und in das Wirtsembryo transplantiert.

Das Wirtsembryo wird 24 Stunden lang kultiviert, fixiert und zur Photooxidation unter schwacher Fluoreszenz bearbeitet. Mit DAB. Das Embryo wird anschließend für die In-situ-Hybridisierung mit einem neuronalen Marker aufbereitet.

Hallo, ich bin Delphine aus dem Labor Fennell am Zentrum für Umwelt- und Genomische Medizin der Texas A&M University in Houston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung von Neuralinduktionsassays im Wangenembryo. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Wirkung von Antiepileptika auf die neuralinduzierenden Eigenschaften des Hänsechens zu untersuchen.

Beginnen wir also. Für den Neuralinduktions-Assay müssen Eier vorbereitet werden. Diese Eier sollten 13 Stunden lang in einem feuchten Inkubator liegend inkubiert werden, bis sie den Hamburger-und-Hamilton-Stadium drei plus oder HH drei plus erreicht haben.

Bereiten Sie anschließend das Wirts-Embryo mithilfe der neuen Kulturmethode vor, die zuvor bereits gezeigt wurde. In JoVE bedecken Sie die Oberfläche des Wirts-Embryos mit 200 Mikroliter Salzlösung. Dies erleichtert die spätere Übertragung und Positionierung des Spendertransplantats.

Schließlich die Montage mit einer umgedrehten Falcon-Kulturschale mit 35 mm abdecken. Um das Spenderembryo zu exponieren, das Ei öffnen, indem man mit der Pinzette auf die Schale klopft. Die obere Hälfte der Schale entfernen und entsorgen.

Entfernen Sie das dicke Eiweiß mit einer Pinzette und kippen Sie die Dottersackhülle mit einer groben Pinzette, sodass das Embryo nach oben zeigt. Nach dem Entfernen des Eiweißes schneiden Sie mit einer feinen Schere ein Quadrat aus der Dottersackhülle um das Embryo herum aus. Heben Sie das Embryo mit einem Löffel vom Dottersack ab und legen Sie es in eine Schale, die PBS enthält.

Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um das Spenderembryo vom Eigelb und der Area lucida zu lösen. Sobald es gelöst ist, überführen Sie das Spenderembryo in eine mit PBS gefüllte Schale mit SIL-Schutz, um das Transplantat zu markieren und zu verpflanzen. Ziehen Sie mithilfe eines Mikroelektrodenziehers 50-Mikroliter-Glasmikrokapi­llarpipetten unter dem Mikroskop.

Schneiden Sie die Spitze der Mikropipette mit feiner Pinzette ab. Legen Sie die Mikropipette in eine mit einem Streifen Modelliermasse ausgelegte Petrischale. Bereiten Sie anschließend die Farbstofflösung vor, die verwendet wird, um das Transplantat vor der Transplantation zu markieren.

Zunächst stellen Sie einen Farbstoffstamm in einem Milliliter absolutem Ethanol bei 0,5 % her. Dieser Stamm kann bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln gelagert werden. Anschließend geben Sie in einem auf 45 Grad Celsius eingestellten Heizblock 10 Mikroliter vorgewärmten Farbstoffstamm zu 90 Mikrolitern 0,3-molarer Saccharose. Diese Temperatur ist notwendig, um eine Ausfällung des Farbstoffs und die Bildung unlöslicher Kristalle zu verhindern.

Die Lösung kurz für fünf bis 10 Sekunden in einer Mini-SPECT-Zentrifuge wirbeln. Die DAI-Lösung ist nun gebrauchsfertig, wobei mit Insektennadeln der Donorembryo auf der Unterseite der mit Silikon abgedichteten Schale mit der dorsalen Seite nach oben befestigt wird. Sobald der Embryo fixiert ist, die Mikropipette durch Anlegen sanften Drucks mit D-Auge nachfüllen.

Unter Verwendung einer Aspiratorröhrenanordnung. Geben Sie eine kleine Portion DAI auf den Hensonschen Knoten. Wiederholen Sie dies, und stellen Sie sicher, dass der gesamte Hensonsche Knoten anschließend markiert ist.

Unter Verwendung einer Mikrokapi­llarpipette oder eines mikrochirurgischen Messers wird der Hensonsche Knoten präpariert; die dorsale Seite des Knotens kann von der ventralen Seite unterschieden werden, da sie eine Furche bildet, während die ventrale Seite des Knotens flach ist. Falls erforderlich, markieren Sie die dorsale Seite des Transplantats mit Karminpulver. Dies gewährleistet, dass das Transplantat in korrekter dorsoventraler Orientierung positioniert wird.

Überführen Sie mit einer 10-Mikroliter-Gilson-Pipette das Transplantat unter Verwendung einer Mikrokapillarpipette in das Wirts-Embryo. Bringen Sie das Transplantat nahe an den area lucida-Bereich, eine opake Grenzregion auf Höhe des Hensonschen Knotens des Wirts-Embryos. Anschließend erzeugen Sie mit einer Mikrokapillarpipette oder einem mikrochirurgischen Messer einen kleinen Einschnitt von 80 bis 100 Mikrometern in diesem Bereich.

Lucita-Bereich opake Grenze auf der Ebene des Hensonschen Knotens des Wirtsembryos. Unter Verwendung einer Mikrokapi­llarpipette oder eines mikrochirurgischen Messers. Positionieren Sie das Transplantat so, dass die ventrale Seite zu Ihnen zeigt und das hintere Ende parallel zur entsprechenden Region im Wirtsembryo O liegt. Sobald es richtig positioniert ist, entfernen Sie die Salzlösung vom Wirtsembryo, wobei sichergestellt werden muss, dass das Transplantat weiterhin in unmittelbarer Nähe zur Wirtsstelle bleibt, und führen Sie den Wirtsembryo anschließend gemäß unserer früheren Einreichung für eine Neue Kultur über 18 bis 22 Stunden weiter.

Nach 24 Stunden Kultivierung wird das Embryo aus dem Inkubator entnommen und in einer Zigarrenschale fixiert. P-B-S-P-B-S wird entfernt und durch 4 % Paraformaldehyd ersetzt. Anschließend wird das Embryo 24 Stunden lang fixiert.

Entsorgen Sie das Fixiermittel in einem geeigneten Behälter für gefährliche Abfälle und geben Sie PBS in die Fixierschale. Entfernen Sie die Insektennadeln mit einer Pinzette, nachdem die Nadeln entfernt wurden. Verwenden Sie eine stumpfe Pasteurpipette, um das Embryo in ein Szintillationsfläschchen mit PBS zu überführen.

Spülen Sie das Embryo zweimal mit PBS je fünf Minuten und danach einmal fünf Minuten mit Twist-Puffer. Überführen Sie das Embryo in eine Glasobjektträgermulde mit 0,1 Milliliter Tris-Puffer. Ersetzen Sie die Tris-Pufferlösung durch 0,1 Milliliter DAB-Lösung. Entsorgen Sie die Einmalpipettenspitze in einen Eimer mit einer Bleichmittel-Lösung.

Um DAB zu desinfizieren, bringen Sie einen Deckgläser auf einem Vertiefungsröhrchen unter der FEI-Fluorescein-Isothiocyanat-Fluoreszenzfokussierung an. Das Objektiv des Mikroskops auf den Zellspendern erscheint fluoreszierend rot und wird der FEI-Fluoreszenz ausgesetzt, bis alle fluoreszierenden roten Zellen braun geworden sind. Dies geschieht dadurch, dass der Farbstoff durch Bestrahlung mit der FEI-Anregungswellenlänge in unlösliche braune Kristalle photochemisch umgewandelt wird.

4 88 Nanometer in Gegenwart von DAB. Dieser Prozess dauert zwischen 20 Minuten und zwei Stunden. Nach Abschluss der Photooxidationsreaktion entfernen Sie die Deckglas mit feinen Pinzetten.

Überführen Sie das Embryo in ein 20 Milliliter fassendes Szintillationsfläschchen, das PBTW oder PBS mit 0,1 % Tween 20 enthält. Deaktivieren Sie abschließend DAB von der Deckenfolie und der Glasvertiefung, indem Sie das Präparat in einer Bleichlösung inkubieren, um das Embryo zur Visualisierung aufzubereiten.

Fahren Sie mit der In-situ-Hybridisierung fort und inkubieren Sie das Embryo nur mit DIG-markiertem Sondenmaterial. Beginnen Sie anschließend wie in JoVE Video zwei beschrieben mit der Fotografie und der Schnittführung. Hier sehen Sie ein Beispiel für einen Neuralinduktions-Assay.

Anfangs wird das Transplantat an der Grenze zwischen dem Bereich lucita und dem Bereich alpaca des Wirtsembryos positioniert. Sowohl Spender- als auch Wirtsembryonen befinden sich im Stadium drei plus. Nach neun Stunden in Kultur beginnt das Transplantat zu differenzieren und induziert das, was wie ein verkleinertes Kopfstadium acht minus erscheint.

Nach 24 Stunden in Kultur ist die neuronale Induktion nach der Fixierung abgeschlossen. Der Embryo wird zur Photooxidation verarbeitet. Zunächst ist zu erkennen, dass sich die vom Spender stammenden, mit Farbstoff markierten Augenzellen proliferiert haben und ein Miniatur-Noor bilden, wie hier in Rot dargestellt.

Nach der Photooxidation erscheinen diese Zellen braun. Anschließend wird das Embryo mittels Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung für den Neuralmarker aufgearbeitet. O otx zwei wurde im Labor von Dr. Bonelli entwickelt.

Es wird gezeigt, dass das Spendertransplantat die Expression von OTX zwei in geweben des Wirts induziert. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man einen neuralen Induktionsassay im Wangenembryo durchführt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, jegliche Flüssigkeit im Bereich um das Transplantat herum nach der Transplantation mit einer Pipette zu entfernen.

Dies gewährleistet, dass das Transplantat sicher positioniert ist und sich während der Kultur nicht vom Wirts-Embryo entfernt. Das war's. Vielen Dank. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.