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Grundlagen der Zucht und Entwöhnung

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Fundamentals of Breeding and Weaning

5.2: Basic Care Procedures

5.14: Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest

35,458 Views

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13:54 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Kay Stewart, RVT, RLATG, Anus; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. University of Notre Dame, IN

Für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung jedes Jahr werden Millionen von Mäusen und Ratten gezüchtet. Weltweit gibt es mehrere große kommerzielle Zuchtanlagen, dass Lieferung Mäuse, Forschungslabors, aber viele Einrichtungen wählen, auch Mäuse und Ratten im Haus, Kosten zu senken und Recherchemöglichkeiten zu züchten. Bei der Zucht in der Tierhaltung, sind Forscher in der Lage zu manipulieren die Genetik der Tiere, die Schwangerschaften, die Bedürfnisse der Forschung, und arbeiten mit Embryonen und Neugeborenen nach Bedarf Zeit.

Mäuse und Ratten können in einer Vielzahl von Systemen und Methoden gezüchtet werden. Technische Verfahren, wie die Verwendung von vaginale Zytologie, Visualisierung von den vaginalen Bereich und Beobachtung der copulator Stecker, wurden entwickelt, um mit der Synchronisation der Zucht zu unterstützen, um die Forschungsanforderungen entsprechen. Diese Handschrift ist eine Übersicht über die wesentlichen Grundlagen von Maus und Ratte Zucht und technische Verfahren verwendet. Ausführlichere Beschreibungen der komplexen Zucht Regelungen und die vollständige Beschreibung der Methoden für die vaginale Zytologie, gibt es in der Liste der Verweise.

Principles

Gängigen Sorten und Bestände

Mäuse und Ratten werden häufig als fremd-Aktien, Inzucht-Sorten und Hybriden Sorten gezüchtet. Outbred Tiere haben ähnliche Eigenschaften, aber nicht genetisch identisch sind. Sie werden nach dem Zufallsprinzip gezüchtet, um Heterozygotie oder genetische Varianz zu erhalten. Im Gegensatz dazu Inzucht Tiere haben mit mindestens 20 Generationen von Bruder-Schwester oder Eltern-Kind-Paarung gekreuzt worden und sind genetisch homozygot. Zu guter Letzt sind hybride Tiere Nachkommen der Verpaarung von zwei Inzucht Stämme.

Faktoren, die die Zucht Verhalten

Es gibt viele Faktoren, die die Zucht von Mäusen und Ratten beeinflussen können. Die Kraft der weiblichen Züchter hängt weitgehend von der Ebene der Inzucht. Tiere, die fremd-sind viel widerstandsfähiger und stärker, damit sie größer und stärker Würfe produzieren. Einige häufig verwendete Stämme, wie die Maus C57BL/6 Anzeigen aggressive Verhaltensweisen, die Zucht beeinträchtigen können. Bei der Zucht einer aggressive Belastung, sollten alle Würfe genau beobachtet werden. Tiere aus einem Wurf mit aggressiven Welpen sollten nicht zur Zucht eingesetzt werden. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Beleuchtung Schwankungen können dazu führen, dass Rückgänge in der Zucht Effizienz. Lärm und Vibrationen innerhalb der Zucht Räume haben auch gezeigt, um schädliche Wirkungen haben. Kontrolle dieser Variablen innerhalb der Zuchtstätte wird einige Effekte minimieren. ¹ Tiere mit genetischer Veränderungen neigen dazu, weniger robust und fruchtbar, und einige der Mutationen verursachen Tödlichkeit der Welpen vor oder kurz nach der Geburt.

Reproduktion-Systeme

Reproduktion-Systeme sind für Mäuse und Ratten ähnlich. Häufig verwendeten Systeme sind monogam Verpaarung eine Hündin gezüchtet, um eine männliche oder polygame Verpaarung von zwei oder mehr Weibchen zu einem Männchen gezüchtet. Die weibliche Maus und Ratte sind polyestrous und durchlaufen eine postpartum Östrus ca. 20-24 h nach der Entbindung. Während postpartum Östrus kann das Weibchen einen Wurf vorstellen. Für Stämme von Mäusen oder Ratten, die eine kurze Zucht Lebensdauer aufgrund einer genetischen Mutation haben, ist es üblich, das Männchen in den Käfig mit dem weiblichen zu verlassen, so dass sie sofort ein weiterer Wurf vorstellen kann. Dieses intensive Zucht-Schema kann anstrengend für das Weibchen sein, da sie ständig laktierenden und trächtigen ist. Einem intensiven Schema beinhaltet die Trennung des Weibchens, sobald sie sichtbar schwanger ist; Sie wird nicht an die männlichen Käfig zurückgegeben, bis ihren Wurf abgesetzt worden. Dieses System ist viel weniger anspruchsvoll auf das Weibchen.

Zucht für Zwecke der Genmanipulation

Gentechnisch veränderte Tiere (GEAs) sind entweder Knockout-Tiere, die gehabt haben Gene entfernt von ihrem Genom oder transgener Tiere, die Gene von einer anderen Art in ihr Genom hinzugefügt wurden. Die GEAs sind dann als eine Inzucht Sorte gezüchtet und sind oft mit anderen GEAs erstelle ich eine komplexe, genetisch manipulierten Tier für sehr konkrete Forschungsprojekte gezüchtet. Komplexe Zucht Systeme werden verwendet, um Stämme mit einige Gene entfernt und andere hinzugefügt zu erstellen. Tiermodelle für viele gen-bezogene Störungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Alzheimer-Krankheit, Krebs, Schlaganfall und andere Erkrankungen des Blutes, Diabetes und Retina pigmentosa-Have durch gentechnische Veränderung von Tieren entwickelt worden.

Die meisten Zucht-Systeme können auf Mendelian Genetik auf den Genotyp Vorhersagen verlassen. Wenn eine Wildtyp-Maus mit einer Maus mit einem veränderten Gens (ein heterozygot) gezüchtet wird, wäre die erwarteten Ergebnisse 50 % Wildtyp Tiere und 50 % heterozygote. Eine Wildtyp-Maus gekreuzt mit einer Maus mit zwei veränderten Genen (einer homozygoten) führt alle Nachkommen als heterozygote. Wenn zwei heterozygote Tiere überschritten werden, sollten alle drei Genotypen in folgende Prozentsätze vorhanden sein: Wildtyp 25 %, 50 % heterozygote und 25 % homozygoten. Es ist aus diesen Erwartungen, dass embryonale Lethal Gene nachgewiesen werden können (zB., gibt es keine homozygoten Nachkommen produziert).

Abbildung 1: Mögliche Paarungen und Ergebnisse anhand der Mendelschen Genetik. Wildtyp-Tiere sind nicht gentechnisch verändert und werden als bezeichnet (+ / +). Heterozygote Tiere haben eine Kopie des veränderten Gens und werden als bezeichnet (-/ +); homozygote Tiere haben beide Kopien eines Gens verändert und werden als bezeichnet (- / -).

Millionen von Mäusen und Ratten sind für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung jährlich gezüchtet, und viele Institutionen wählen Sie dazu im eigenen Haus, Kosten zu senken und Recherchemöglichkeiten. Die Vorteile der hauseigenen Zucht sind, (1) Forscher sind in der Lage zu manipulieren, die Genetik der Tiere durch selektive Zucht (2) sie können Zeit Schwangerschaften Forschungsbedarf zu erfüllen, und (3) sie können arbeiten mit Embryonen und Neugeborenen nach Bedarf. Um eine erfolgreiche Zucht-System einzurichten, sollte man jedoch das Nagetier Estrous Zyklus verstehen. Darüber hinaus sollten sie haben Kenntnisse über die verschiedenen Paarung Regelungen, die Faktoren, die Nager Zucht Verhalten und die Entwöhnung Überlegungen… alle von denen in dieser video-Präsentation diskutiert werden.

Beginnen wir mit der Überprüfung des Nagetier Estrous Zyklus. Weibliche Ratten und Mäuse sind polyestrous, was bedeutet, dass sie mehr als einen Östrus Zyklus in einem Jahr oder eine Brutsaison haben. Jeder Zyklus dauert 4-5 Tage und kann in 4 Stufen unterteilt werden: Metestrus, Diestrus, Proestrus und Brunst. Östrus ist die ovulatory Phase, was bedeutet, dass wenn das Weibchen in die Proestrus oder die Phase der Brunst ist, sie bereit ist, zu begreifen.

Eine Möglichkeit zum Bestimmen der Estrous Zyklus-Phase ist durch Sichtprüfung. Manuell zurückhalten Sie das Tier am Schwanz und mit den Vorderpfoten auf einen Käfig Deckel ruht, und überprüfen Sie sorgfältig die Größe der Vaginalöffnung und dem umgebenden Gewebe. Während der Phase der Proestrus die vaginale Öffnung ist breit und zeichnet sich durch Schwellung des umgebenden Gewebes, das in der Farbe rosa und sehr feucht ist. Oft gibt es Falten oder Rillen an den dorsalen und ventralen Rändern der Öffnung. Während der Brunst sind die Schwellungen rund um die vaginale Öffnung reduziert wird und das Gewebe nicht so feucht und rosa. Während die Metestrus die vaginale Öffnung ist minimal und es gibt vernachlässigbar Schwellung. Während Diestrus es gibt keine Schwellung der Gewebe um den vaginalen Bereich und die Öffnung ist klein oder geschlossen.

Eine weitere, genauere Ansatz zur Bestimmung der Estrous Zyklus-Phase ist vaginale Zytologie zu welcher Zelle entweder Lavage oder swabbing Proben sammeln. Legen Sie für Lavage eine Latex-Glühbirne am Ende eine sterile 200 Mikroliter-Spitze und rund 100 Mikroliter sterile doppelt destilliertes Wasser in die Pipette erarbeiten. Als nächstes heben Sie die Maus aus dem Käfig heraus und legen sie auf Draht-Bar-Käfig-Spitze mit ihrem Endstück in Richtung zu Ihnen. Fest greifen Sie das Heck und erheben Sie der Hinterhand der Maus zu, so dass nur die Vorderpfoten den Deckel greifen. Stecken Sie das Ende der gefüllte Spitze bei der Eröffnung des vaginalen Kanals, ohne die Öffnung einzudringen. Drücken Sie vorsichtig die Birne, ca. 25-50 Mikroliter des Wassers auf die vaginale Öffnung zu vertreiben. Die Flüssigkeit wird spontan in den Kanal ohne Tipp einfügen Aspirieren. Lassen Sie langsam den Druck auf die Birne und die Flüssigkeit wird wieder in der Spitze zurückziehen. Wiederholen Sie die 4 – 5 Mal mit dem gleichen Tipp, Birne und Flüssigkeit, um eine ausreichende Anzahl von Zellen in einer einzigen Probe zu erhalten. Legen Sie die Flüssigkeit auf Glasobjektträger und ermöglichen den Abstrich, trocken bei Raumtemperatur. Nach dem trocknen diese estrous Abstriche können zur späteren Verwendung gespeichert werden, oder sie können sofort mit der Wright Giemsa Fleck, das ist ein Schritt-Schandfleck und tut nicht erfordern Fixierung gefärbt. Die Folie wird in den Fleck für 45 bis 60 Sekunden platziert.

Auf der anderen Seite, schrubben, nass einen 2 mm Baumwolle Spitze Applikator mit Kochsalzlösung. Legen Sie die Spitze des Applikators in die Scheide der zurückhaltende Maus und leicht zu drehen und Rollen der Spitze gegen die Scheidenwand. Dann entfernen Sie den Tupfer vorsichtig und übertragen Sie die Zellen auf einen trockenen Objektträger durch Walzen den Tupfer auf die Folie. Dieses Verfahren gilt als stressig und kann Schäden verursachen, wenn Sie nicht mit richtigen Zurückhaltung und mit der richtigen Größe Wattestäbchen sanft, durchgeführt. Wie Lavage, sobald die Folie trocken ist, es kann auch gebeizt mit den Wright Giemsa Fleck. Anschluss an Färbung, die Folien können unter dem Mikroskop untersucht werden.

Wenn das Weibchen in Proestrus ist, sind die Zellen als Cluster Runde, wohlgeformt, kernhaltige epitheliale Zellen mit einem Zellkern, die dunkler als das Zytoplasma Flecken gesehen. Wenn sie in Brunst Phase ist, sind die meisten der Zellen verhornten Plattenepithel Epithelzellen, die einen Zellkern fehlt. Sie sind eckig im Aussehen und in dichten Büscheln. Wenn das Weibchen in Metestrus ist, sind die Zellen in der Regel weißen Blutkörperchen, speziell Neutrophilen, mit einigen verhornten Plattenepithel Epithelzellen vorhanden. Während Diestrus sind die Zellen normalerweise weiße Blutkörperchen mit dem Auftreten von ein paar kernhaltigen Epithelzellen.

Jetzt haben Sie ein Verständnis für die Nager Estrous Zyklus, lasst uns diskutieren wie man Set-up Paarung. Erste Schritt ist die Bestimmung des Geschlechts, die durch den Vergleich der anogenitalen Entfernungen erfolgt. Bei Frauen ist der Abstand zwischen den Anus und die äußeren Genitalien kürzer als bei den Männchen. Basierend auf Forschungsbedarf und die Belastung Zucht Effizienz, kann die Verknüpfungsplan monogam–sein, wo ein Weibchen ist, ein Männchen gezüchtet oder polygame–, wo zwei oder mehr Weibchen zu einem Männchen gezüchtet werden.

In Bezug auf Zeitpunkt, zumal das Nagetier Estrous Zyklus kurz nur 4-5 Tage kann lange-One einrichten Paarung nach dem Zufallsprinzip. Oder sie können einrichten “timed Paarung”, einhergehende Einführung weiblich an der Paarung Käfig, wenn sie zum Zeitpunkt der maximalen Empfänglichkeit und Fruchtbarkeit ist-das ist während der Proestrus oder die Phase der Brunst. In beiden Fällen sollte die Paarung am Ende eines Tages eingerichtet werden wie Nagetiere nachtaktiv sind und neigen dazu, in der Nacht zu Paaren. Am nächsten Morgen, ist das Weibchen ein copulator Stecker – eine weißliche Masse, bestehend aus Scheidenflüssigkeit und Samen, die weiterhin für 12-24 Stunden nach dem Koitus untersucht. Wenn der copulator Stecker nicht visuell ersichtlich ist, vorsichtig Einlegen einer stumpfen Sondenspitze die vaginale Öffnung. Das Vorhandensein eines copulator Steckers wird die Weiterentwicklung der Sonde innerhalb 0,5 cm von der Scheidenöffnung behindern. Im Falle einer zufälligen Paarung dauert copulator Stecker aussehen häufig drei Tage. Das Vorhandensein eines Steckers bestätigt, dass die Paarung nicht garantiert, dass die Frau schwanger ist.

Sobald ein copulator Stecker beobachtet wird, sollte das Weibchen für Anzeichen einer Schwangerschaft wie Gewichtszunahme überwacht werden. Wenn das angeschlossene Weibchen schwanger ist, dann der Tag der Stecker wurde gefunden embryonalen Tag Null oder E0 und am nächste Tag als des ersten Tages der Trächtigkeit oder E1, und so weiter bis hin zur Entbindung gilt-d. h. der Geburt-das ist zwischen 19 bis 21 Tagen. Ca. 20-24 Stunden post Partum, weiblichen Ratten und Mäuse eine Brunst zu unterziehen und wieder begreifen können.

In einem intensiven Zucht-Regelung, die für Tiere mit einer kurzen Zucht Lebensdauer aufgrund einer genetischen Mutation häufig verwendet wird, sind die männlichen Tiere im Käfig mit den Weibchen und Jungtiere, überlassen, so dass das Weibchen sofort einem anderen Wurf vorstellen kann. Dieses Schema kann anstrengend für das Weibchen sein, da sie ständig laktierenden und trächtigen ist. Im Gegenteil, das Schema nicht Intensive Zucht beinhaltet das Weibchen zu trennen, sobald sie sichtbar schwanger ist und nicht wieder ihr das Männchen Käfig bis ihren Wurf abgesetzt worden, so dass dies eine weniger anspruchsvolle Zucht Schema.

Es gibt viele Faktoren, die die Zucht von Mäusen und Ratten beeinflussen können. Betrachten wir einige von ihnen, die häufiger aufgetaucht. Die Kraft der weiblichen Züchter hängt weitgehend von der Ebene der Inzucht. Tiere, die outbred sind viel mehr robust und kräftig, damit sie größer und stärker Würfe produzieren. Ein weiterer Faktor, der Zucht Leistung beeinflussen können ist aggressives Verhalten. Einige häufig verwendete Stämme wie C57BL/6 Mäusen haben eine Tendenz, Aggression, zeigen die Zucht stören können. Bei der Zucht einer aggressive Belastung, sollten alle Würfe genau beobachtet werden. Tiere aus einem Wurf mit aggressiven Welpen sollten nicht zur Zucht eingesetzt werden. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Beleuchtung Schwankungen können dazu führen, dass Rückgänge in der Zucht Effizienz. Lärm und Vibrationen innerhalb der Zucht Räume haben auch gezeigt, um schädliche Wirkungen haben. Tiere mit genetischer Veränderungen neigen dazu, weniger robust und fruchtbar, und einige der Mutationen verursachen Tödlichkeit der Welpen vor oder kurz nach der Geburt.

Jetzt betrachten wir kurz wie man Welpen dieser Labor-Tiere zu entwöhnen. Die Zeit zum Starten Entwöhnung unterscheidet sich mit der Zucht. Im Falle einer nicht-Intensive Zucht, können der junge am Alter von 21-28 Tagen abgesetzt. Aber bei intensiven Zucht, die Welpen pro Wurf nicht anwesend, als die nächste Wurf in geboren am Tag 20 gegen die älteren Welpen entwöhnt sind. Da Nagetiere Paarung im Alter von 8 Wochen beginnen können, werden männliche und weibliche Welpen bei der Entwöhnung getrennt. Wann immer möglich, sollten neu entwöhnte Jungtiere nicht einzeln untergebracht werden.

Wenn ein Wurf nur ein Welpe eines bestimmten Geschlechts enthält, sollte versucht, dieser Welpe mit Welpen des gleichen Geschlechts aus einem anderen Wurf Haus. Die möglichen Wohnmöglichkeiten für die Entwöhnung der Welpen sind in der Handschrift unten aufgeführt. Absetzer Mäuse und Ratten sollte täglich kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass sie gedeihen. Für die Versorgung mit Lebensmitteln sollte eine kleine Menge an Nahrung, ein Pellet per Mausklick, für den ersten 7-10 Tagen mit Beikost in den Käfig-Spitze auf dem Boden platziert werden. Das fördert die Tiere für den Übergang, Nagetier Chow als ihre alleinige Nahrungsquelle. Für die Wasserversorgung sollte eine Flasche hinzugefügt werden, auch wenn die Tiere auf Gestellen mit automatischer Bewässerung untergebracht sind. Dies ist um Austrocknung zu verhindern.

Zu guter Letzt Mal sehen, wie Wissenschaftler den hauseigenen Zucht Ansatz zu ihrem Vorteil nutzen. Eines der häufigsten Anwendungen der Paarung Einrichtung soll Mäuse mit veränderten Genotyp entwickeln. Um eine Genfunktion untersuchen, stören die Forscher oft seinen genetischen Code. Aber diese Tiere wie Menschen sind diploid und so haben zwei Kopien des gleichen Gens. Daher um das gen vollständig zu stören, die veränderten Mäusen gezüchtet werden, um ein Tier mit beide Kopien dysfunktionalen, mit anderen Worten ein homozygot Knockout zu produzieren. Mäuse mit einer Kopie dysfunktional sind heterozygot genannt oder Hets.

Ein weiterer Vorteil der hauseigenen Paarung Einrichtung testet die Wirkung der pränatalen Exposition, Verbindungen zu testen. Zum Beispiel hier zur Verfügung gestellten Forscher trächtige Weibchen einer flüssigen Diät alkoholhaltige von E7, E13. Dann auf E13, seziert die trächtige Weibchen, fetale Gehirn erhalten und in dünnen Schnitten geschnitten. Zu guter Letzt ergab Färbung der Folien, dass pränatale Alkohol Exposition Zelltod im neuronalen Gewebe erhöht.

Schließlich ermöglicht die eigene Zucht auch für das Studium der Post Schwangerschaft Störungen wie postpartale Depression. In dieser Studie zog Wissenschaftler zunächst den Wurf von der Staumauer in der laktierenden Zeit. Dann wieder 60 Minuten später die Welpen bis zum Staudamm eingeführt. Und um Stress in der Frau auslösen, hinzu kommt eine neuartige männlichen Eindringling den Käfig. Dann beobachteten die Forscher den Damm für mütterliche Aggression, die angreifen und beißen der Eindringling männlichen umfasst sowie für verschiedene mütterliche Fürsorge Verhaltensweisen wie Welpen Pflege und Krankenpflege. Die gewonnenen Daten ergeben, dass Stress eine signifikante Wirkung auf postpartum mütterliche Aggression und Pflege hat.

Sie haben nur Jupiters Video auf Grundlagen der Zucht und Entwöhnung, Mäuse und Ratten im Labor beobachtet. Sie sollten nun ein besseres Verständnis des Nagetier Östrus Zyklus und auch wissen, wie man die Zyklus-Bühne zu bestimmen und wie Sie es verwenden, um Setup erfolgreiche Paarung Systeme. Wir überprüft auch die Faktoren, die die Zucht-Verhalten beeinflussen können und erklärt, wie und wann man Mäuse und Ratten zu entwöhnen Welpen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Procedure

1. Informationen erforderlich, wenn Tiere Paarung umfasst Stamm/Lager des Tieres, die Nutzung der richtigen Nomenklatur, Geburtsdaten der Züchter männliche und weibliche und dem Einstellungsdatum. Genaue Protokollierung ist zwingend mit Brutkolonien.

(2) Geschlechtsbestimmung von Mäusen und Ratten erfolgt durch den Vergleich der anogenitalen Entfernungen. Bei Frauen ist der Abstand zwischen den Anus und die äußeren Genitalien kürzer als bei Männern. Das Vorhandensein von einer scrotal Sac bei männlichen Tieren ist ein weiterer Sex-Indikator.

(3) auswählen und Einrichten der Verknüpfungsplan

Hinweis: Es gibt zwei Paarung Systeme, die verwendet werden können.

Proestrus/Brunst zeitlich Paarung: Diese Methode beruht auf Gemüsemesser Weibchen mit Männchen zum Zeitpunkt der maximalen Empfänglichkeit und Fruchtbarkeit.
1. Estrous Zyklus muss überwacht werden, bei den Weibchen, entweder durch Sichtprüfung der externen Genitalien für Änderungen, die bezeichnend für Proestrus und estrous sind, oder durch Zytologie von Vaginalsekret (siehe unten).
2. Wenn ein Weibchen in Proestrus oder Östrus fest entschlossen ist, sie mit einem Mann am Ende des Tages, paart sich wie Paaren sich die Tiere in der Regel in der Nacht.
3. Am nächsten Morgen wird das Weibchen auf ein copulator Stecker (siehe unten) untersucht. Wenn keine Steckdose vorhanden ist, kann das Weibchen mit den männlichen während des Tages und überprüft nach einem copulator Stecker am Ende des Tages bleiben. Alternativ, wenn feststeht, dass sie nicht mehr in Proestrus oder Brunst ist, wird sie aus dem Käfig Zucht entfernt.
Random zeitlich Paarung: Diese Methode basiert auf der Tatsache der Estrous Zyklus von Nagetieren ist sehr kurz, 4-5 Tage lang.
1. Für diese Methode Verpaarungen können jederzeit eingerichtet werden, und die Weibchen sind dann für copulator Stecker jeden Morgen und Abend bis ein Stecker beobachtet wird überprüft.
2. Ein Weibchen paart sich mit einem Mann am Abend.
3. Sie wird auf einem copulator Stecker am Anfang und Ende eines jeden Tages bis ein Stecker beobachtet wird geprüft. Häufig dauert es 3 oder mehr Tage für einen Stecker gesehen werden, wenn Sie diese Methode verwenden.

(4) Vorhersage Schwangerschaft

Da Abtasten der Welpen schwierig bis später während der Schwangerschaft, um Tag 10-12, wurden kommerzielle Ultraschallsysteme für Nager entwickelt; Allerdings haben nur wenige Tierversuche Einrichtungen dieser Technologie. Daher sind Visualisierung der copulator Stecker, Beobachtung von vaginalen Änderungen oder vaginale Zytologie häufig verwendet, um zu unterstützen mit der Vorhersage der wenn ein Weibchen einen Wurf (siehe unten) konzipiert wurde. Keines dieser Verfahren sind jedoch in der Lage, die Schwangerschaft zu bestätigen. Sobald ein copulator Stecker beobachtet wird, sollte das Weibchen auf Anzeichen einer Schwangerschaft, wie Gewichtszunahme überwacht werden.

5. Bestimmung der Phase des Estrous Zyklus

Visuelle Inspektion
Hinweis: Zur zeitgesteuerten Paarung von Mäusen und Ratten, visueller Beobachtung der Vagina für Änderungen, die bezeichnend für Proestrus und Brunst sind ist die schnellste Methode zur Bestimmung der Estrous Zyklus-Phase, und es erfordert keine spezielle Ausrüstung.
1. Bei der Bewertung des Estrous Zyklus mit der visuellen Methode ist es wichtig, die Sichtprüfung in der gleichen Gegend in Bezug auf Beleuchtung, durchzuführen, wie die Lichtquelle kann die wahrgenommene des vaginalen Gewebe Farbe und Auswertung erschweren. Zum Beispiel die violette Farbton gegossen von LED-Leuchten visuelle Erkennung wird dadurch erschwert.
2. Um die Phase des Estrous Zyklus durch visuelle Beobachtung zu bewerten, muss jede Maus manuell durch den Schweif mit den Vorderpfoten ruht auf einem Käfig Deckel zurückgehalten werden.
3. Die vaginale Öffnung jedes Weibchen wird anhand der Zustand des Gewebes rund um den vaginalen Bereich und die Größe der vaginalen Öffnung. ²
  1. Während Proestrus die vaginale Öffnung ist breit und zeichnet sich durch Schwellung des umgebenden Gewebes. Das Gewebe ist in der Farbe rosa und sehr feucht. Oft gibt es Falten oder Rillen an den dorsalen und ventralen Rändern der Öffnung.
  2. Während der Brunst die Schwellung des Gewebes rund um die vaginale Öffnung wird reduziert und das Gewebe sind nicht so feucht und rosa.
  3. Während Metestrus die vaginale Öffnung ist minimal und es ist vernachlässigbar Schwellung.
  4. Während Diestrus es gibt keine Schwellung der Gewebe um den vaginalen Bereich, und die vaginale Öffnung ist klein und geschlossen.
Vaginale Zytologie
Wie Mäuse und Ratten polyestrous sind, ist die Brunst-Zyklus-Länge sehr kurz, reicht von 4 bis 5 Tagen. Manchmal ist es notwendig, alle vier Phasen des estrous zu identifizieren: Proestrus, Brunst, Metestrus und Diestrus. Vaginale Zytologie ist eine sehr präzise Methode, um diese Phasen zu bestimmen. Es gibt auch zwei Methoden der Probenentnahme: die nicht-invasive Methode der vaginalen Lavage und die invasive Methode der vaginalen Kanal zu schrubben.
1. Vaginale lavage
  1. Benötigten Materialien sind sterile 200 µl Pipetten Spitzen, Latex Lampen, sterile doppelt destilliertes Wasser (DdH₂0) und Glas-Objektträger zu reinigen.
  2. Legen Sie eine Latex-Glühbirne am Ende eine sterile 200 µl Spitze. Ca. 100 µl steriler DdH₂O in der Pipette aufstellen.
  3. Heben Sie die Maus aus dem Käfig, und legen Sie sie auf Draht-Bar-Käfig-Spitze mit ihrem Endstück in Richtung zu Ihnen.
  4. Fest greifen Sie das Heck und erhöhen Sie die Hinterhand der Maus. Die Maus wird jetzt nur die Vorderpfoten greifen den Deckel haben.
  5. Wenn die Maus uriniert, warten Sie, bis Wasserlassen stoppt. Sollte Urin am Eingang zu den vaginalen Kanal gelassen, die Öffnung mit einem kleinen Spritzer von DdH₂O. Änderung der Spitze, die zum Spülen verwendet wurde gespült werden.
  6. Stecken Sie das Ende der DdH₂O-gefüllte Spitze bei der Eröffnung des vaginalen Kanals, ohne die Öffnung einzudringen.
  7. Drücken Sie vorsichtig die Birne, eine Viertel bis die Hälfte des Volumens des Wassers zu vertreiben (~ 25-50 µl) bei der Eröffnung des vaginalen Kanals. Die Flüssigkeit wird spontan in den Kanal ohne Tipp einfügen Aspirieren. Lassen Sie langsam den Druck auf die Glühbirne. Die Flüssigkeit wird wieder in der Spitze zurückziehen.
  8. Vermeiden Sie Freigabe Druck zu schnell um Aspiration von Flüssigkeit in der Lampe zu verhindern. Zu diesem Zweck kann ein gefilterte Tipp hilfreich sein.
  9. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 4-5 Mal mit dem gleichen Tipp, Birne und Flüssigkeit, um eine ausreichende Anzahl von Zellen in einer einzigen Probe zu erhalten.
  10. Legen Sie die Flüssigkeit auf Glasobjektträger und ermöglichen den Abstrich, trocken bei Raumtemperatur.
  11. Verwenden Sie eine neue Pipette für jede Maus.
  12. Nach dem Trocknen können diese estrous Abstriche eingefärbt sofort oder gespeichert und zu einem späteren Zeitpunkt gebeizt. Wright Giemsa Färbung wird am häufigsten verwendet, die Folien zu beflecken. Dieser Fleck gibt es im Handel als eine einstufige Fleck, der keine Fixierung der Folie zu verhindern, dass Zellen abwaschen während des Färbung Prozess erfordert. Die Folie wird in den Fleck für 45-60 Sekunden, gemäß den Anweisungen des Herstellers gelegt.
  13. Die Folien sind dann unter dem Mikroskop untersucht, und die Zellen gesehen entspricht die Phase des Zyklus: 1) wenn das Weibchen in Proestrus ist, die Zellen gelten als Cluster von runden, wohlgeformten kernhaltige epitheliale Zellen mit Zellkern, die als dunklere Flecken der Zytoplasma; (2) wenn das Weibchen in Brunst ist, sind die Mehrzahl der Zellen verhornten Plattenepithel Epithelzellen, die einen Zellkern fehlt, sind eckig aussehen und auftreten in dichten Büscheln; (3) wenn das Weibchen in Metestrus ist, sind die Zellen in der Regel weiße Blutkörperchen (insbesondere Neutrophile mit einigen verhornten Plattenepithel Epithelzellen vorhanden) mit dunkel gefärbten Kernen, die wie zwei Würste miteinander geprägt sind; (4) während Diestrus sind die Zellen normalerweise weiße Blutkörperchen mit dem Auftreten von ein paar kernhaltigen Epithelzellen…
2. Vaginal schrubben
  1. Benötigten Materialien sind sterile Baumwolle Spitze Applikatoren mit einer 2 mm Durchmesser Spitze, sauberes Glas-Objektträger und sterile physiologische Kochsalzlösung.
  2. Befeuchten Sie einen Baumwoll-gespitzten Applikator mit Kochsalzlösung.
  3. Legen Sie die Spitze des Applikators in die Scheide der zurückhaltende Maus.
  4. Vorsichtig drehen und Rollen der Spitze gegen die Scheidenwand. Entfernen Sie vorsichtig den Tupfer.
  5. Zellen werden in einen trockenen Objektträger übertragen, durch Walzen den Tupfer auf der Folie.
  6. Sobald die Folie trocken ist, kann auch gebeizt mit Wright Giemsa Fleck.
    Swabbing gilt eine stressige Prozedur und -wann können betonte Mäusen gestört Estrous Zyklen. Vaginale und zervikalem Stimulation verursacht durch schrubben kann Scheinträchtigkeit auslösen. Wiederholte Abstriche von der vaginalen Schleimhaut können Schäden verursachen, wenn Sie nicht mit richtigen Zurückhaltung und mit der richtig dimensionierten Wattestäbchen vorsichtig, durchgeführt. ^3,4

Abbildung 2. Vaginale Zytologie – Zyklus unterschiedliche Stadien der Nager Brunst

6. visualisieren einen copulator Stecker

Dieser Stecker besteht aus Vaginalsekret und Sperma, und bleibt in der Scheide für 12-24 h Postcopulation. Das Vorhandensein des Steckers bestätigt, Paarung, aber garantiert nicht, dass die Frau schwanger ist. Wenn die verstopfte Frau schwanger ist, am ersten Tag der Schwangerschaft gilt der Tag, nachdem der Stecker gefunden wird.

Heben Sie die Maus aus dem Käfig heraus und legen Sie sie auf Draht-Bar-Käfig-Spitze mit ihrem Endstück in Richtung zu Ihnen.
Position der Maus durch Druck direkt über das Heck zu wölben die Rückseite um bessere Präsentation der vaginalen Öffnung zu ermöglichen.
Beobachten Sie ihre vaginale Öffnung für eine weißliche Masse. Die copulator Stecker möglicherweise nicht visuell klar aber kann mit dem Einsatz einer stumpfen Sonde bestätigt werden.
Mit der Spitze der Sonde, legen Sie es sanft in die vaginale Öffnung. Das Vorhandensein eines copulator Steckers wird die Weiterentwicklung der Sonde innerhalb 0,5 cm von der Scheidenöffnung behindern.
Die Sonde werden mit Alkohol desinfiziert und vor jedem Gebrauch vollständig getrocknet.

Das Weibchen Würfe hat, das Datum der Geburt, die Wurfgröße, die Anzahl geboren, die Anzahl entwöhnt, das Verhältnis Männer zu Frauen Welpen sowie das Verhältnis der Genotypen sollte alle aufgezeichnet werden. Wenn die Genotypen innerhalb eines Wurfes die Genotypen der Eltern nicht entsprechen, muss die Wiederholung der Prüfungen getan werden, um zu überprüfen, die wahre Genotyp.

(7) absetzen

Schwangerschaft für Mäuse und Ratten beträgt ca. 21 Tage. Die jungen werden im Alter von 21-28 Tagen abgesetzt. Beide Mäuse und Ratten können so früh wie 8 Wochen alt zu züchten, so ist es zwingend notwendig, dass die Welpen schon früh nach Geschlecht getrennt sind. Intensive Zucht erfordert, dass die Welpen von jedem Wurf am Tag 20 zu verhindern, dass die älteren Welpen anwesend, als die nächste Wurf abgesetzt werden. Für intensiven Zucht können die Welpen mit der Mutter letzten 20 Tage alt, oft bis zu 28 Tage alt belassen werden. Dies kann sehr vorteilhaft für viele gentechnisch veränderter Stämme sein, da die Welpen möglicherweise nicht so kräftig wie nonengineered oder Wildtyp Tiere.

Männliche und weibliche Welpen sind bei der Entwöhnung getrennt. Wann immer möglich, sollten neu entwöhnte Jungtiere nicht einzeln untergebracht werden. Wenn ein Wurf nur ein Welpe eines bestimmten Geschlechts enthält, sollte versucht, dieser Welpe mit anderen des gleichen Geschlechts untergebracht. Möglich Wohnmöglichkeiten sind: 1) ein einziger weiblichen Welpen bleiben mit der Mutter, wenn nicht in eine intensive Zucht Käfig; (2) ein einziger weiblicher oder männlicher Welpen kann mit anderen gleichen Geschlechts Welpen aus einem anderen Wurf der gleichen Altersgruppe gestellt werden; (3) wenn die Eltern ein monogames paar sind, kann das Weibchen aus dem Käfig erlauben einen einzigen männlichen Welpen mit dem Vater untergebracht werden entfernt; und 4) ein einziger männlichen Welpen kann mit weiblichen Geschwistern bis zu 5 Wochen alt untergebracht werden. Das Geschlecht des Welpen sollte eine Woche, um zu verhindern, dass unerwünschte Würfe von unsachgemäß getrennten Welpen postweaning überprüft werden.

Absetzer Mäuse und Ratten sollte täglich kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass sie gedeihen. Obwohl die Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren⁵ besagt, dass Essen die Tiere so zu verhindern, dass die Verschmutzung durch Kot und Urin vorgelegt werden muss, sollten neu entwöhnte Mäuse eine kleine Menge an Nahrung (eine Tablette pro zur Verfügung gestellt werden Maus) in einer Glasschale (Petrischale) auf den Boden gelegt. Das fördert die Tiere für den Übergang, Nagetier Chow als ihre alleinige Nahrungsquelle. Auch für Tiere, die auf Gestellen untergebracht sind, die Wasser in die Käfige durch eine automatische Bewässerungsanlage zu bieten, kann eine Flasche Wasser in den Käfig hinzugefügt werden, wenn die Mäuse offenbar dehydriert werden.

Name	Kolonie-Typ	Beschreibung
ICR	Fremd-	Albino
Swiss-Webster	Fremd-	Albino
BALB/c	Inzucht	Albino
FVB	Inzucht	Albino
C57BL/6	Inzucht	Schwarzer Mantelfarbe
C₃H	Inzucht	Braune Fellfarbe
DBA/2	Inzucht	Braun/grau Fellfarbe
Athymic Akte (Nu/Nu)	Inzucht	Haarlos
SCID	Inzucht	Schwere kombinierte immundefiziente Mäuse-verschiedene Farben

Tabelle 1. Häufig verwendet Maus Flecken und Aktien.

Name	Kolonie-Typ	Beschreibung
Sprague-Dawley	Fremd-	Albino
Wistar	Fremd-	Albino
Fisher-344	Inzucht	Albino
Lewis	Inzucht	Albino
Lange Evans	Inzucht	Mit Kapuze, schwarz und weiß

Tabelle 2. Häufig verwendete Ratte Sorten und Bestände

Applications and Summary

Hauseigene Brutkolonien bieten Flexibilität, Forschung, insbesondere bei Projekten, die Embryonen oder Neugeborene zu nutzen. Verwendung von Techniken wie zeitlich Paarung mit copulator Steckern und vaginale Zytologie, kann das Datum der Empfängnis und Schwangerschaft genauer vorhergesagt werden. Dies erlaubt Forschern, ihre Experimente genauer zu planen. Steuerung von Umweltfaktoren wie Licht Zyklen, Temperatur, Feuchtigkeit und Vibrationen wird die Zucht Ergebnisse optimieren.

References

Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
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Transcript

Millions of mice and rats are bred for use in biomedical research every year, and many institutions choose to this in-house to reduce costs and increase research options. The advantages of in-house breeding are, 1) researchers are able to manipulate the genetics of the animals through selective breeding 2) they can time pregnancies to meet research needs, and 3) they can work with embryos and neonates as necessary. However, to setup a successful breeding scheme, one should understand the rodent estrous cycle. In addition, they should have knowledge about the different mating schemes, the factors affecting rodent breeding behavior and the weaning considerations…all of which will be discussed in this video presentation.

Let’s begin with review of the rodent estrous cycle. Both female rats and mice are polyestrous, meaning they have more than one estrus cycle in a year or a breeding season. Each cycle lasts for 4-5 days and can be divided into 4 stages: metestrus, diestrus, proestrus, and estrus. Estrus is the ovulatory phase, which means that if the female is in the proestrus or the estrus phase, she is ready to conceive.

One way to determine the estrous cycle stage is by visual examination. Manually restrain the animal by the tail and with the forepaws resting on a cage lid and carefully inspect the size of the vaginal opening and the surrounding tissue. During the proestrus phase, the vaginal opening is wide and is characterized by swelling of the surrounding tissue, which is pink in color and very moist. Often there are wrinkles or striations along the dorsal and ventral edges of the opening. During the estrus, the swelling surrounding the vaginal opening is reduced and the tissues are not as moist and pink. During the metestrus, the vaginal opening is minimal and there is negligible swelling. During diestrus, there is no swelling of the tissues around the vaginal area and the opening is small or closed.

Another, more accurate approach for determining the estrous cycle stage is vaginal cytology for which cell samples are collected by either lavage or swabbing. For lavage, place a latex bulb on the end of a sterile 200-microliter tip and draw up approximately 100 microliters of sterile double distilled water into the pipette. Next, lift the mouse out of the cage and place her on the wire bar cage top with her tail towards you. Firmly grasp the tail and elevate the hindquarters of the mouse such that only the front paws are grasping the lid. Place the end of the filled tip at the opening of the vaginal canal without penetrating the orifice. Gently depress the bulb to expel approximately 25-50 microliters of water at the vaginal opening. The liquid will spontaneously aspirate into the canal without tip insertion. Slowly release the pressure exerted on the bulb and the fluid will withdraw back into the tip. Repeat 4-5 times using the same tip, bulb, and fluid to obtain a sufficient number of cells in a single sample. Place the fluid on glass slide, and allow the smear to completely dry at room temperature. Once dry, these estrous smears can be stored for later use, or they can be stained immediately using the Wright-Giemsa stain, which is a one-step stain and does not requiring fixation. The slide is placed in the stain for 45 to 60 seconds.

On the other hand, for swabbing, wet a 2 mm cotton-tipped applicator with saline. Insert the tip of the applicator into the vagina of the restrained mouse and gently turn and roll the tip against the vaginal wall. Then remove the swab carefully and transfer the cells to a dry glass slide by rolling the swab across the slide. This procedure is considered stressful and can cause damage if not performed gently, with proper restraint, and with the correct sized cotton swabs. Like lavage, once the slide is dry, it can be stained with the Wright-Giemsa stain. Following staining, the slides can be examined under a microscope.

If the female is in proestrus, the cells are seen as clusters of round, well-formed, nucleated epithelial cells with a nucleus that stains darker than the cytoplasm. If she is in estrus phase, the majority of the cells are cornified squamous epithelial cells that lack a nucleus. They are angular in appearance and are in densely packed clusters. If the female is in metestrus, the cells are typically white blood cells, specifically neutrophils, with some cornified squamous epithelial cells present. During diestrus, the cells present are normally white blood cells with the occurrence of a few nucleated epithelial cells.

Now that you have an understanding of the rodent estrous cycle, let’s discuss how to set-up mating. First step is determination of the sex, which is done by comparing the anogenital distances. In females, the distance between the anus and the external genitalia is shorter than it is for the males. Based on research needs and the strain’s breeding efficiency, the mating scheme can be monogamous — where one female is bred to one male OR polygamous — where two or more females are bred to one male.

In terms of timing, given that the rodent estrous cycle is short-only 4-5 days long-one can set up mating randomly. Or they can set up “timed mating”, which involves introducing female to the mating cage when she is at the point of maximum receptivity and fertility-that is during the proestrus or the estrus phase. In either case, the mating should be set up at the end of a day, as rodents are nocturnal and tend to mate at night. The following morning, the female is examined for a copulatory plug – a whitish mass consisting of vaginal fluid and semen that persists for 12-24 hours post-copulation. If the copulatory plug is not visually obvious, gently insert the tip of a blunt probe into the vaginal opening. The presence of a copulatory plug will impede the advancement of the probe within 0.5 cm of the vaginal opening. In case of random mating, copulatory plug appearance commonly takes three days. The presence of a plug confirms mating does not guarantee that the female is pregnant.

Once a copulatory plug is observed, the female should be monitored for signs of pregnancy such as weight gain. If the plugged female is pregnant, then the day the plug was found is embryonic day zero or E0 and the next day is considered as the first day of gestation, or E1, and so on right up to parturition-that is giving birth-which is between 19 to 21 days. Approximately 20-24 hours post partum, both female rats and mice undergo an estrus and can conceive again.

In an intensive breeding scheme, which is commonly used for animals with a short breeding life span due to a genetic mutation, the male animals are left in the cage with the female and pups, so that the female can conceive another litter immediately. This scheme can be stressful to the female as she is continually lactating and gestating. On the contrary, the non-intensive breeding scheme, involves separating the female once she is visibly pregnant, and not returning her to the male’s cage until her litter has been weaned, making this a less demanding breeding scheme.

There are many factors that can influence the breeding performance of mice and rats. Let’s review some of them, which come up more frequently. The vigor of female breeders largely depends on the level of inbreeding. Animals that are outbred are much more hardy and vigorous, thus they produce larger and stronger litters. Another factor that can affect breeding performance is aggressive behavior. Some commonly used strains, such as C57BL/6 mice, have a tendency to display aggression, which can interfere with breeding. When breeding an aggressive strain, all litters should be closely watched. Animals from a litter containing aggressive pups should not be used for breeding. Temperature, humidity, and lighting fluctuations can cause decreases in breeding efficiency. Noise and vibrations within the breeding rooms have also been shown to cause deleterious effects. Animals with genetic modifications tend to be less hardy and fertile, and some of the mutations may result in lethality of the pups before or soon after birth.

Now let’s briefly review how to wean pups of these lab animals. The time to start weaning differs with the breeding scheme. In case of non-intensive breeding, the young may be weaned at 21-28 days of age. But in case of intensive breeding, the pups of each litter are weaned at day 20 to prevent the older pups from being present when the next litter in born. Since rodents can begin mating as young as 8 weeks, male and female pups are separated at weaning. Whenever possible, newly weaned pups should not be housed singly.

If a litter contains only one pup of a given sex, attempts should be made to house this pup with pups of the same gender from another litter. The possible housing options for weaning pups are listed in the manuscript below. Weanling mice and rats should be checked daily to assure that they are thriving. For food supply, a small amount of food, one pellet per mouse, should be placed on the cage floor for the first 7-10 days, with additional food in the cage top. This will encourage the animals to transition to having rodent chow as their sole food source. For water supply, a bottle should be added even if the animals are housed on racks with automatic watering system. This is to prevent dehydration.

Lastly, let’s see how scientists are using the in-house breeding approach to their advantage. One of the most common applications of setting up mating is to develop mice with altered genotype. To study a gene’s function, researchers often disrupt its genetic code. However, these animals like humans are diploid and thus have two copies of the same gene. Therefore, in order to disrupt the gene completely, the altered mice need to be bred to produce an animal with both copies dysfunctional, in other words a homozygous knockout. Mice with one copy dysfunctional are called heterozygous or hets.

The other advantage of setting up in-house mating is testing the effect of prenatal exposure to test compounds. For example, here researchers provided pregnant female a liquid diet containing alcohol from E7 to E13. Then on E13, they dissected the pregnant female, obtained fetal brains, and sliced them into thin sections. Lastly, staining of the slides revealed that prenatal alcohol exposure increased cell death in the neural tissue.

Finally, in-house breeding also allows for the study of post pregnancy disorders like postpartum depression. In this study, scientists first moved the litter away from the dam during the lactating period. Then, 60 minutes later, reintroduced the pups to the dam. And to induce stress in the female, added a novel male intruder to the cage. Then, the researchers observed the dam for maternal aggression, which includes attacking and biting of the intruder male as well as for different maternal care behaviors like pup grooming, and nursing. The data obtained revealed that stress has a significant effect on both postpartum maternal aggression and care.

You’ve just watched JoVE’s video on fundamentals of breeding and weaning mice and rats in the laboratory. You should now have a better understanding of the rodent estrus cycle and also know how to determine the cycle stage and how to use it to set-up successful mating schemes. We also reviewed the factors that can affect the breeding behavior, and explained how and when to wean mice and rat pups. As always, thanks for watching!

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