Festphasen-Synthese

Solid Phase Synthesis

JoVE Science Education
Organic Chemistry II

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JoVE Science Education Organic Chemistry II

Solid Phase Synthesis

5.2: Nucleophilic Substitution

5.15: Polarimeter

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09:42 min

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February 22, 2017

Overview

Quelle: Vy M. Dong und Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA

Merrifield Festphasen-Synthese ist ein Nobelpreis gewinnen Erfindung wo ein Edukt-Molekül ist auf einer festen Unterlage gebunden und erfährt aufeinander folgende chemische Reaktionen, um eine gewünschte Verbindung zu bilden. Wenn die Moleküle an einem festen Träger gebunden sind, können durch Waschen entfernt Verunreinigungen, während die Ziel-Verbindung an das Harz gebunden bleibt überschüssige Reagenzien und Nebenprodukte entfernt werden. Speziell, präsentieren wir ein Beispiel der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) um dieses Konzept zu demonstrieren.

Principles

Festphasen-Synthese ist eine Methode verwendet, um die Synthese von Molekülen zu optimieren. Es wird oft in der kombinatorischen Chemie (eine Technik verwendet, um eine große Anzahl von Molekülen in kurzer Zeit vorbereiten) verwendet, um Bibliotheken zu erzeugen Verbindungen wegen der einfachen Reinigung und insgesamt chemische Synthese. Festphasen-Synthese beinhaltet in der Regel die Verwendung eines Harzes; ein nicht löslich, Polymer-basierten Material, welches pre-functionalized ist, so dass der Start Gebäude Blockcan leicht binden. Die Bausteine sind in der Regel geschützt, sobald sie auf das Harz hinzugefügt werden, und sie können leicht deprotected und behandelt mit dem nächsten gewünschten Baustein in Lösung (Abbildung 1). Sobald das gewünschte Molekül synthetisiert wurde, kann es leicht aus dem Harz gespalten.

Denn es robust ist, wurde Festphasen-Synthese zur Synthese von Nukleinsäuren, Oligosaccharide und am häufigsten Peptide. Entdeckt und im Jahre 1963 von Merrifield berichtet, ist SPPS die am häufigsten verwendete Methode zur Erzeugung Bibliotheken Peptide geworden. Merrifield gewann den Nobelpreis 1984 für die Erfindung der SPPS. SPPS profitieren einfach von Fmoc (Basis Sensitive) oder Boc (Säure empfindlich)N-Gruppen auf die Aminosäuren zum Aufbau von Bibliotheken von Peptiden in kürzester Zeit zu schützen. HBTU (Haftvermittler) und ich-Pr₂EtN (Base) Aktivieren der C-Terminus der Aminosäure für die Kopplung mit einer anderen Aminosäure. Fmoc Gruppen schützen kann durch 4-Methylpiperidine, entfernt werden, während Boc Gruppen zu schützen durch starke Säuren wie Trifluoroacetic Säure entfernt werden kann. In diesem Experiment demonstrieren wir durch die Synthese von einem Dipeptid SPPS. Den Kaiser-Test, eine qualitative Methode, um auf das Vorhandensein von primären Aminen testen dient uns dazu, um den Fortschritt der Reaktion zu überwachen.

Abbildung 1. Konzept der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS).

Procedure

1. laden das Harz

Ein 100mL Peptid-Synthese Schiff fügen Sie 2-Chlorotrityl-Chlorid (CTC) Harz (1,1 Mmol/g, 0,360 g, 0.400 Mmol hinzu). Geben Sie 20 mL DMF und es ihnen ermöglichen, für 30 min unter N Schwellen_2.
Abtropfen lassen Sie die Perlen unter Vakuum und 10 mL DMF.
Fügen Sie 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 Mmol) und 2,5 mL i –Pr₂EtN und Mischung unter N₂ für 15 Minuten.
Das Lösungsmittel im Vakuum abgießen und die Beladung mit Fmoc-Ala-OH für 15 min wiederholen.
Abtropfen lassen das Lösungsmittel im Vakuum und die Perlen mit 10 mL DMFunder N₂waschen und abtropfen lassen unter Vakuum 3 X.

2. Deprotection der Fmoc-Gruppe

10 mL 20 % 4-Methylpiperidine in DMF und rühren Sie die Perlen unter N₂ für 15 Minuten.
Abtropfen Sie das Lösungsmittel im Vakuum und wiederholen Sie den Deprotection.
Waschen Sie die Perlen mit 10 mL DMF unter N₂ und Abfluss unter Vakuum 3 X.

(3) durchführen der Kaiser-Test

Der Kaiser-Test durchgeführt werden durch Zugabe von 1 bis 2 Tropfen der Lösung A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL Pyridin), Lösung B (1 g Ninhydrin-, 20 mL n-Butanol), und C-Lösung (20 g Phenol, 10 mL n-Butanol) jeweils in zwei Reagenzgläser. Ein Reagenzglas wird das Steuerelement sein, während andererseits die Reaktion zu überwachen.
Hinzu kommen ein paar Perlen des Harzes aus dem Reaktionsgefäß Reaktion Reagenzglas und erwärmen die zwei Reagenzgläser bis 110 ° C.
Wenn die Deprotection abgeschlossen ist, schaltet sich der Inhalt des Reagenzglases eine dunkle blau/lila Farbe. Wenn die Deprotection unvollständig oder fehlerhaft ist, bleibt die Lösung gelb. Vergleichen Sie das Reaktionsgefäß Test mit Reagenzglas Kontrolle.

4. Kupplung die nächsten Bausteine

Entleeren Sie das Lösungsmittel im Vakuum.
Waschen Sie die Perlen mit 10 mL N-Methyl-2-pyrrolidon unter N₂ und Abfluss das Lösungsmittel im Vakuum.
Fügen Sie zunächst die nächsten Kupplung auf 10 mL NMP, 620 MgFmoc-Phe-OH (1,6 Mmol), 610 mg HBTU (1,6 Mmol) und 2,5 mLi –Pr₂EtN, und lassen Sie das Harz unter N₂ für 30 min Blasen wirft.
Entleeren Sie das Lösungsmittel im Vakuum.
Waschen Sie die Perlen mit 10 mL DMF unter N₂ und Abfluss unter Vakuum 3 X.
Führen Sie den Kaiser testen (siehe Schritte 3.1-3.3), um die Fertigstellung der Kupplung zu suchen. Die Perlen und die Lösung im Reagenzglas sollte gelb sein.

(5) Spalten das Peptid aus dem Harz

Die restlichen Fmoc-Gruppe mit Schritte 2.1-2.3 zu Spalten.
Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum abgelassen wird, fügen Sie 40 mL-Dekolleté-Lösung (95 % TFA, 2,5 % H₂O, 2,5 % Tipps hinzu), Harz und Blase unter N₂ für 3 h.
Legen Sie eine neue Auffangkolben auf der Peptid-Synthesizer und drain TheTFA Lösung, die das gewünschte Peptid unter Vakuum in die neue Flasche enthält.

(6) Niederschlag und ich spendet des Peptids

Trennen Sie die TFA-Lösung in 4 konische Fläschchen und jedes Fläschchen, das Peptid auszufällen fügen Sie 25 mL kalten Äther (−20 ° C hinzu).
Zentrifugieren Sie die Fläschchen (3.000 u/min, 0-4 ° C) für 20 min. Dekantieren die restliche TFA und Äther-Lösung aus der konischen Vials und konzentrieren den Peptid-Niederschlag um die gewünschte Dipeptid als weißer Feststoff zu leisten.

Festphasen Synthese ist ein Verfahren, in denen das Produkt während gebunden zu einer unlöslichen Material synthetisiert wird.

Festphasen Synthese wird oft verwendet, um biologische Oligomere und Polymere wie Peptide, Nukleinsäuren und Oligosaccharide zu produzieren. Diese Moleküle bestehen aus Ketten von kleineren molekularen Untereinheiten, Monomere genannt. Synthese einer Oligomere oder Polymere nimmt viele Schritte wie die Monomere in der richtigen Reihenfolge hinzugefügt werden müssen.

Ein Problem mit mehrstufigen Synthesen, Reinigung und Isolierung der stabile Produkte der einzelnen Schritte, genannte Zwischenerzeugnisse, sinkt die Gesamtausbeute. In der festen Phase Synthese bleibt das Zwischenprodukt an die solide Unterstützung im gesamten Synthese gebunden. Dies ermöglicht Lösungsphase Reagenzien, Lösungsmittel und Nebenprodukte weggespült, entfällt die Notwendigkeit, zu reinigen und jede Zwischenprodukt zwischen den einzelnen Schritten zu isolieren.

Dieses Video wird zeigen das Verfahren für die Festphasen-Peptidsynthese und einige Anwendungen der Festphasen Synthese in der Chemie einführen.

In der Festphasen-Synthese ist ein Molekül auf einer festen Unterlage in einer Abfolge von Reaktionen synthetisiert. Zum Beispiel werden eine Oligomere oder Polymere synthetisiert ein Monomer zu einem Zeitpunkt um das Endprodukt zu bilden. Die wachsende Oligomere oder Polymere bleibt stark an die solide Unterstützung bis sie getrennt ist, oder gespalten, aus der Halterung mit Reagenzien gebunden.

Jedes Monomer müssen mindestens zwei Bindungsstellen an der Polymerkette zu beteiligen, aber nur eine Bindungsstelle kann zu einem Zeitpunkt um sicherzustellen, dass das Monomer zum richtigen Atom bindet vorhanden sein. Dies geschieht mit Gruppen zu schützen, sind die funktionellen Gruppen, die in einen oder mehrere Schritte der Synthese nicht reaktiv sind. Die Bindungsstelle wiederhergestellt, oder deprotected, durch die Behandlung des Moleküls mit bestimmten Reagenzien, die Schutz zu konvertieren, eine reaktive funktionelle Gruppe gruppieren.

Um Festphasen-Synthese zu beginnen, ist das Ausgangsmaterial ein speziell entwickeltes Harz oder unlösliche Polymer am Standort nur Bindung gebunden. Dann ist das gebundene Ausgangsmaterial deprotected Bindung des zweiten Monomer in der Kette zu ermöglichen. Als nächstes eine Lösung aus dem zweiten Monomer in der Kette hinzugefügt, zusammen mit einer Kopplung Agent , Bindung zwischen den Monomeren zu erleichtern.

Nach das zweiten Monomer an das Ausgangsmaterial bindet, ist das resultierende dimeres Zwischenprodukt deprotected. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis das Ziel Oligomer oder Polymer gebildet hat. Das Produkt ist von der festen Unterstützung in Lösung, gespalten, aus denen es gereinigt, isoliert und analysiert werden kann.

Festphasen Synthese wird oft für die Synthese von Peptiden, die Ketten von Aminosäuren verwendet. Aminosäuren haben eine Amingruppe, eine Carboxylgruppe und eine Substituent oder “Side-Chain”. Das Amin ist zunächst geschützt. Sobald deprotected, bildet das Amin eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe der nächsten Aminosäure.

Nun, Sie die Prinzipien der Festphasen Synthese verstehen, gehen wir durch ein Verfahren für die Festphasen-Peptidsynthese, in dem wir die Ergänzung der ersten beiden Aminosäuren zeigen wird.

Um den Vorgang zu starten, schließen Sie ein Auffangkolben für Abfälle an eine 100 mL manuelle Peptid-Synthese-Schiff. Dann legen Sie 0,360 g 2-Chlorotrityl-Chlorid Harz in das Gefäß.

Eine Stickstoff-Gas-Linie Nebenarm des Schiffes und einer Vakuumleitung an der gezackten Schlauchadapter anschließen.

20 mL Dimethylformamid in das Harz und die Harzkügelchen für 30 min unter einen Fluss von Stickstoffgas anschwellen. Wenden Sie dann Vakuum das Lösungsmittel zu reinigen.

Das Schiff 10 mL DMF, 1,6 Mmol Fmoc-geschützten Aminosäure und 2,5 mL N, N –Diisopropylethylamine hinzufügen. Blase unter der Stickstoffgas, das die Lösung für 15 min zum Laden der geschützten Aminosäure auf das Harz vermischt.

Entfernen Sie das Lösungsmittel im Vakuum zu und führen Sie einen zweiten laden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels, schütteln Sie die geladenen Harzkügelchen dreimal in 10 mL Portionen von DMF, jedem Waschen in den Auffangkolben abfließen.

Fügen Sie zu der geladenen Perlen 10 mL einer 20 % igen Lösung von 4-Methylpiperidine in DMF. Blase die Mischung für 15 min, die Fmoc-Gruppe zu entfernen.

Entleeren Sie des Lösungsmittels und wiederholen Sie den Vorgang Deprotection. Waschen Sie und abtropfen lassen Sie das geladene Harz dreimal als zuvor. Speichern Sie die Perlen unter Lösungsmittel, bis sie bereit für den nächsten Schritt.

Um sicherzustellen, dass die geladene Verbindung vollständig deprotected war, erster Platz 1 bis 2 Tropfen der jeweiligen Kaiser-Test-Lösung in zwei Reagenzgläser.

Ein paar geladene Perlen in einem Reagenzglas und beide Rohre bis 110 Grad in einem Ölbad. Deprotection ist vollständig, wenn die Harzmischung dunkel wird blau bis violett, auf das Vorhandensein von Amin Gruppen in der Mischung.

Um die Kupplung Schritt beginnen, waschen Sie zuerst die Perlen mit 10 mL NMP unter einen Strom von N2 Gas.

Dann fügen Sie 10 mL NMP, 1,6 Mmol der nächsten Fmoc-geschützten Aminosäure, 1,6 Mmol Haftvermittler HBTU und 2,5 mL DIPEA geladen Harz.

Blase N2 gas durch die Harzmischung für 30 Minuten und dann abtropfen lassen das Lösungsmittel. Waschen Sie und abtropfen lassen Sie die Perlen mit 10 mL Portionen von DMF dreimal als zuvor.

Wiederholen Sie der Kaiser-Test. Kupplung ist erfolgreich aufgetreten, wenn die Perlen und die Lösung gelb, darauf hinweist, dass keine Amin Gruppen vorhanden sind.

Als nächstes Spalten Sie die neue Fmoc-Gruppe mit 20 % 4-Methylpiperidine in DMF und waschen Sie die Perlen mit 10 mL Portionen von DMF. Wiederholen Sie die Kupplung und Deprotection für jede verbleibende Aminosäure in der Ziel-Peptid.

Nach dem letzten Aminosäure deprotected worden ist und die Harzkügelchen wurden gewaschen, fügen Sie 40 mL der Spaltung Peptidlösung, das Peptid-Produkt aus dem Harz zu trennen.

Stickstoff-Gas durch die Harzmischung für 3 h-Blase, und ersetzen Sie den Auffangkolben. Übertragen Sie die Lösung aus dem Harz-Gemisch auf den neuen Auffangkolben unter Vakuum.

Um das Endprodukt zu erzeugen, entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer.

Festphasen Synthese ist weit verbreitet in Biologie und Chemie. Schauen wir uns ein paar Beispiele.

Festphasen-Synthese eröffnet viele neue synthetische Wege, Oligosaccharide, die kurze Ketten Einfachzucker Monomere mit wichtigen biologischen Rollen, wie Energiespeicher sind. Im Gegensatz zu Peptidbindungen enthält jeder Band zwischen Zucker ein Stereocenter. Um ein Oligosaccharid synthetisieren, nicht nur die Monomere müssen in der richtigen Reihenfolge, aber die Anleihen müssen auch die richtigen Stereochemie. Festphasen-Synthesetechniken wurden entwickelt, um paar jedes Monomer durch ein höchst Stereoselective Verfahren, die heute ausreichend verfeinert, um automatisiert werden.

Festphasen-Synthese ist ein gemeinsames Konzept für Kombinatorische Chemie, die Praxis der Synthese von vielen Varianten eines Stoffes in einem einzigen synthetischen Prozess. Die geladene Harz kann Teile mit unterschiedlichen Monomeren oder Moleküle reagieren leicht aufgeteilt werden soll. Nach jeder Reaktion sind die Portionen gewaschen und neu kombiniert. Dies wird wiederholt, bis die gewünschte Anzahl der Produkte generiert wurde. Diese Technik eignet sich vor allem in der pharmazeutischen Forschung, wie sie verwendet werden kann, um neue Verbindungen zu erzeugen oder um die Reaktivität einer Verbindung mit einer Vielzahl von Molekülen zu bewerten.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die feste Phase Synthese beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen die grundlegenden Prinzipien der Festphase Synthese, das Verfahren für die Festphasen-Peptidsynthese und ein paar Beispiele wie Festphasen Synthese in der organischen Chemie verwendet wird. Danke fürs Zuschauen!

Results

Repräsentative Ergebnisse für Festphasen-Peptid-Synthesisfor Verfahren 3.

Prozedurschritt	Farbe der Lösung
3.1	Steuern – klar, hellgelb Reaktion – klar, hellgelb
3.2	Steuern – klar, hellgelb Reaktion – dunkelblau
3.3	Dunkel blaue Lösung, Perlen blau – komplette Deprotection oder Kupplung gescheitert Farblos, Perlen gelb – Deprotection ist fehlgeschlagen oder vollständig ausfüllen Farblose Lösung Perlen rot – unvollständig Kupplung oder unvollständige Deprotection

Tabelle 1. Vertreter ergibt sich für Procedu 3.

Applications and Summary

In diesem Experiment haben wir ein Beispiel der Festphasen-Synthese über SPPS durch die Synthese von einem Dipeptid gezeigt.

Festphasen-Synthese ist in der kombinatorischen Chemie verbreitet, Bibliotheken von Verbindungen für schnelle Screening aufzubauen. Es ist allgemein verwendet, Peptide, Oligosaccharide und Nukleinsäuren zu synthetisieren. Darüber hinaus wurde dieses Konzept in der chemischen Synthese umgesetzt. Weil es heterogen ist, können in nachfolgenden Reaktionen diesen Volumenkörper unterstützt Reagenzien oft recycelt und wiederverwendet werden.

Transcript

Solid phase synthesis is a method in which the product is synthesized while bound to an insoluble material.

Solid phase synthesis is often used to produce biological oligomers and polymers such as peptides, nucleic acids, and oligosaccharides. These molecules are composed of chains of smaller molecular subunits, called monomers. Synthesizing an oligomer or polymer takes many steps, as the monomers must be added in the correct order.

An issue with multi-step syntheses is that purification and isolation of the stable products of each step, called intermediate products, decreases the overall yield. In solid phase synthesis, the intermediate product remains bound to the solid support throughout synthesis. This allows solution-phase reagents, solvents, and byproducts to be washed away, eliminating the need to purify and isolate each intermediate product between steps.

This video will illustrate the procedure for solid phase peptide synthesis and introduce a few applications of solid phase synthesis in chemistry.

In solid-phase synthesis, a molecule is synthesized on a solid support in a sequence of reactions. For instance, an oligomer or polymer will be synthesized one monomer at a time to form the final product. The growing oligomer or polymer remains strongly bound to the solid support until it is separated, or cleaved, from the support with reagents.

Each monomer must have at least two binding sites to be part of the polymer chain, but only one binding site can be available at a time to ensure that the monomer binds to the correct atom. This is achieved with protecting groups, which are functional groups that are not reactive during one or more steps of the synthesis. The binding site is restored, or deprotected, by treating the molecule with specific reagents to convert the protecting group to a reactive functional group.

To begin solid-phase synthesis, the starting material is bound to a specially designed resin or insoluble polymer at its only available binding site. Then, the bound starting material is deprotected to allow binding of the second monomer in the chain. Next, a solution of the second monomer in the chain is added, along with a coupling agent to facilitate bonding between the monomers.

Once the second monomer binds to the starting material, the resulting dimeric intermediate product is deprotected. This process is repeated until the target oligomer or polymer has formed. The product is cleaved from the solid support into solution, from which it can be purified, isolated, and analyzed.

Solid phase synthesis is often used for the synthesis of peptides, which are chains of amino acids. Amino acids have an amine group, a carboxyl group, and a substituent, or ‘side chain’. The amine is initially protected. Once deprotected, the amine forms a peptide bond with the carboxyl group of the next amino acid.

Now that you understand the principles of solid phase synthesis, let’s go through a procedure for solid phase peptide synthesis, in which we will demonstrate the addition of the first two amino acids.

To begin the procedure, connect a receiving flask for waste to a 100-mL manual peptide synthesis vessel. Then place 0.360 g of 2-chlorotrityl chloride resin into the vessel. Connect a nitrogen gas line to the vessel sidearm and a vacuum line to the serrated hose adapter.

Add 20 mL of dimethylformamide to the resin and allow the resin beads to swell for 30 min under a flow of nitrogen gas. Then, apply vacuum to drain the solvent.

Add 10 mL of DMF, 1.6 mmol of an Fmoc-protected amino acid, and 2.5 mL of N,N-diisopropylethylamine to the vessel. Bubble under the nitrogen gas, which mixes the solution, for 15 min to load the protected amino acid onto the resin.

Remove the solvent under vacuum and perform a second loading. After removing the solvent, agitate the loaded resin beads three times in 10-mL portions of DMF, draining each wash into the receiving flask.

Next, add to the loaded beads 10 mL of a 20% solution of 4-methylpiperidine in DMF. Bubble the mixture for 15 min to remove the Fmoc group.

Drain the solvent and repeat the deprotection procedure. Wash and drain the loaded resin three times, as before. Store the beads under solvent until they are ready for the next step.

To verify that the loaded compound was completely deprotected, first place 1 to 2 drops of each Kaiser test solution in two test tubes.

Place a few loaded beads in a test tube and heat both tubes to 110 degrees in an oil bath. Deprotection is complete if the resin mixture turns dark blue to purple, indicating the presence of amine groups in the mixture.

To begin the coupling step, first wash the beads with 10 mL of NMP under a flow of N2 gas.

Then, add 10 mL of NMP, 1.6 mmol of the next Fmoc-protected amino acid, 1.6 mmol of the coupling agent HBTU, and 2.5 mL of DIPEA to the loaded resin.

Bubble N2 gas through the resin mixture for 30 minutes, and then drain the solvent. Wash and drain the beads with 10-mL portions of DMF three times, as before.

Repeat the Kaiser test. Coupling has occurred successfully if the beads and solution turn yellow, indicating that no amine groups are present.

Next, cleave the new Fmoc group with 20% 4-methylpiperidine in DMF and wash the beads with 10-mL portions of DMF. Repeat the coupling and deprotection for each remaining amino acid in the target peptide.

After the last amino acid has been deprotected and the resin beads have been washed, add 40 mL of peptide cleavage solution to separate the peptide product from the resin.

Bubble nitrogen gas through the resin mixture for 3 h, and then replace the receiving flask. Transfer the solution from the resin mixture to the new receiving flask under vacuum.

To generate the final product, remove the solvent with a rotary evaporator.

Solid phase synthesis is widely used in biology and chemistry. Let’s look at a few examples.

Solid-phase synthesis opened many new synthetic pathways to oligosaccharides, which are short chains of simple sugar monomers with important biological roles, such as energy storage. Unlike peptide bonds, each bond between sugars contains a stereocenter. To synthesize an oligosaccharide, not only must the monomers be in the correct order, but the bonds must also have the correct stereochemistry. Solid-phase synthesis techniques were developed to couple each monomer by a highly stereoselective process, which today is sufficiently refined to be automated.

Solid-phase synthesis is a common approach to combinatorial chemistry, which is the practice of synthesizing many variants of a compound in a single synthetic process. The loaded resin can easily be split into portions to react with different monomers or molecules. After each reaction, the portions are washed and recombined. This is repeated until the desired number of products has been generated. This technique is particularly useful in pharmaceutical research, as it can be used to generate new compounds or to evaluate the reactivity of a compound with a wide array of molecules.

You’ve just watched JoVE’s introduction to solid phase synthesis. You should now understand the underlying principles of solid phase synthesis, the procedure for solid phase peptide synthesis, and a few examples of how solid phase synthesis is used in organic chemistry. Thanks for watching!

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