Festphasen-Synthese
Quelle: Vy M. Dong und Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield Festphasen-Synthese ist ein Nobelpreis gewin…
1. laden das Harz
- Ein 100mL Peptid-Synthese Schiff fügen Sie 2-Chlorotrityl-Chlorid (CTC) Harz (1,1 Mmol/g, 0,360 g, 0.400 Mmol hinzu). Geben Sie 20 mL DMF und es ihnen ermöglichen, für 30 min unter N Schwellen2.
- Abtropfen lassen Sie die Perlen unter Vakuum und 10 mL DMF.
- Fügen Sie 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 Mmol) und 2,5 mL i -Pr2EtN und Mischung unter N2 für 15 Minuten.
- Das Lösungsmittel im Vakuum abgießen und die Beladung mit Fmoc-Ala-OH für 15 min wiederholen.
- Abtropfen lassen das Lösungsmittel im Vakuum und die Perlen mit 10 mL DMFunder N2waschen und abtropfen lassen unter Vakuum 3 X.
2. Deprotection der Fmoc-Gruppe
- 10 mL 20 % 4-Methylpiperidine in DMF und rühren Sie die Perlen unter N2 für 15 Minuten.
- Abtropfen Sie das Lösungsmittel im Vakuum und wiederholen Sie den Deprotection.
- Waschen Sie die Perlen mit 10 mL DMF unter N2 und Abfluss unter Vakuum 3 X.
(3) durchführen der Kaiser-Test
- Der Kaiser-Test durchgeführt werden durch Zugabe von 1 bis 2 Tropfen der Lösung A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL Pyridin), Lösung B (1 g Ninhydrin-, 20 mL n-Butanol), und C-Lösung (20 g Phenol, 10 mL n-Butanol) jeweils in zwei Reagenzgläser. Ein Reagenzglas wird das Steuerelement sein, während andererseits die Reaktion zu überwachen.
- Hinzu kommen ein paar Perlen des Harzes aus dem Reaktionsgefäß Reaktion Reagenzglas und erwärmen die zwei Reagenzgläser bis 110 ° C.
- Wenn die Deprotection abgeschlossen ist, schaltet sich der Inhalt des Reagenzglases eine dunkle blau/lila Farbe. Wenn die Deprotection unvollständig oder fehlerhaft ist, bleibt die Lösung gelb. Vergleichen Sie das Reaktionsgefäß Test mit Reagenzglas Kontrolle.
4. Kupplung die nächsten Bausteine
- Entleeren Sie das Lösungsmittel im Vakuum.
- Waschen Sie die Perlen mit 10 mL N-Methyl-2-pyrrolidon unter N2 und Abfluss das Lösungsmittel im Vakuum.
- Fügen Sie zunächst die nächsten Kupplung auf 10 mL NMP, 620 MgFmoc-Phe-OH (1,6 Mmol), 610 mg HBTU (1,6 Mmol) und 2,5 mLi -Pr2EtN, und lassen Sie das Harz unter N2 für 30 min Blasen wirft.
- Entleeren Sie das Lösungsmittel im Vakuum.
- Waschen Sie die Perlen mit 10 mL DMF unter N2 und Abfluss unter Vakuum 3 X.
- Führen Sie den Kaiser testen (siehe Schritte 3.1-3.3), um die Fertigstellung der Kupplung zu suchen. Die Perlen und die Lösung im Reagenzglas sollte gelb sein.
(5) Spalten das Peptid aus dem Harz
- Die restlichen Fmoc-Gruppe mit Schritte 2.1-2.3 zu Spalten.
- Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum abgelassen wird, fügen Sie 40 mL-Dekolleté-Lösung (95 % TFA, 2,5 % H2O, 2,5 % Tipps hinzu), Harz und Blase unter N2 für 3 h.
- Legen Sie eine neue Auffangkolben auf der Peptid-Synthesizer und drain TheTFA Lösung, die das gewünschte Peptid unter Vakuum in die neue Flasche enthält.
(6) Niederschlag und ich spendet des Peptids
- Trennen Sie die TFA-Lösung in 4 konische Fläschchen und jedes Fläschchen, das Peptid auszufällen fügen Sie 25 mL kalten Äther (−20 ° C hinzu).
- Zentrifugieren Sie die Fläschchen (3.000 u/min, 0-4 ° C) für 20 min. Dekantieren die restliche TFA und Äther-Lösung aus der konischen Vials und konzentrieren den Peptid-Niederschlag um die gewünschte Dipeptid als weißer Feststoff zu leisten.
Die Festphasensynthese ist eine Methode, bei der das Produkt synthetisiert wird, während es an ein unlösliches Material gebunden ist.
Die Festphasensynthese wird häufig zur Herstellung biologischer Oligomere und Polymere wie Peptide, Nukleinsäuren und Oligosaccharide verwendet. Diese Moleküle bestehen aus Ketten kleinerer molekularer Untereinheiten, den sogenannten Monomeren. Die Synthese eines Oligomers oder Polymers erfordert viele Schritte, da die Monomere in der richtigen Reihenfolge hinzugefügt werden müssen.
Ein Problem bei mehrstufigen Synthesen besteht darin, dass die Reinigung und Isolierung der stabilen Produkte jedes Schritts, der sogenannten Zwischenprodukte, die Gesamtausbeute verringert. Bei der Festphasensynthese bleibt das Zwischenprodukt während der gesamten Synthese an den festen Träger gebunden. Auf diese Weise können Reagenzien, Lösungsmittel und Nebenprodukte in der Lösungsphase weggespült werden, so dass jedes Zwischenprodukt zwischen den Schritten nicht mehr gereinigt und isoliert werden muss.
Dieses Video veranschaulicht das Verfahren zur Festphasenpeptidsynthese und stellt einige Anwendungen der Festphasensynthese in der Chemie vor.
Bei der Festphasensynthese wird ein Molekül in einer Abfolge von Reaktionen auf einem festen Träger synthetisiert. Zum Beispiel wird ein Oligomer oder Polymer ein Monomer nach dem anderen synthetisiert, um das Endprodukt zu bilden. Das wachsende Oligomer oder Polymer bleibt stark an den festen Träger gebunden, bis es mit Reagenzien vom Träger getrennt oder gespalten wird.
Jedes Monomer muss mindestens zwei Bindungsstellen haben, um Teil der Polymerkette zu sein, aber es kann jeweils nur eine Bindungsstelle verfügbar sein, um sicherzustellen, dass das Monomer an das richtige Atom bindet. Dies wird mit Schutzgruppen erreicht, bei denen es sich um funktionelle Gruppen handelt, die während eines oder mehrerer Schritte der Synthese nicht reaktiv sind. Die Bindungsstelle wird wiederhergestellt oder entschützt, indem das Molekül mit spezifischen Reagenzien behandelt wird, um die Schutzgruppe in eine reaktive funktionelle Gruppe umzuwandeln.
Um mit der Festphasensynthese zu beginnen, wird das Ausgangsmaterial an seiner einzigen verfügbaren Bindungsstelle an ein speziell entwickeltes Harz oder unlösliches Polymer gebunden. Dann wird das gebundene Ausgangsmaterial ungeschützt, um die Bindung des zweiten Monomers in der Kette zu ermöglichen. Als nächstes wird eine Lösung des zweiten Monomers in der Kette zusammen mit einem Haftvermittler hinzugefügt, um die Bindung zwischen den Monomeren zu erleichtern.
Sobald das zweite Monomer an das Ausgangsmaterial bindet, wird das resultierende dimere Zwischenprodukt entschützt. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis sich das Zieloligomer oder -polymer gebildet hat. Das Produkt wird von dem festen Träger in eine Lösung gespalten, aus der es gereinigt, isoliert und analysiert werden kann.
Die Festphasensynthese wird häufig für die Synthese von Peptiden verwendet, bei denen es sich um Ketten von Aminosäuren handelt. Aminosäuren haben eine Amingruppe, eine Carboxylgruppe und einen Substituenten oder eine "Seitenkette". Das Amin wird zunächst geschützt. Sobald das Amin entschützt ist, bildet es eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe der nächsten Aminosäure.
Nachdem Sie nun die Prinzipien der Festphasensynthese verstanden haben, gehen wir ein Verfahren für die Festphasenpeptidsynthese durch, in dem wir die Zugabe der ersten beiden Aminosäuren demonstrieren.
Um den Vorgang zu starten, schließen Sie einen Aufnahmekolben für Abfall an ein manuelles 100-ml-Peptidsynthesegefäß an. Geben Sie dann 0,360 g 2-Chlornitritylchlorid-Harz in das Gefäß. Schließen Sie eine Stickstoffgasleitung an den Seitenarm des Behälters und eine Vakuumleitung an den gezackten Schlauchadapter an.
Geben Sie 20 mL Dimethylformamid in das Harz und lassen Sie die Harzkügelchen 30 Minuten lang unter einem Strom von Stickstoffgas quellen. Wenden Sie dann ein Vakuum an, um das Lösungsmittel abzulassen.
Geben Sie 10 ml DMF, 1,6 mmol einer Fmoc-geschützten Aminosäure und 2,5 ml N,N-Diisopropylethylamin in das Gefäß. Blase 15 Minuten lang unter das Stickstoffgas, das die Lösung mischt, um die geschützte Aminosäure auf das Harz zu laden.
Entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum und führen Sie eine zweite Beladung durch. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels werden die geladenen Harzkügelchen dreimal in 10-ml-Portionen DMF gerührt und bei jeder Wäsche in den Auffangkolben abgelassen.
Als nächstes fügen Sie den geladenen Kügelchen 10 ml einer 20%igen Lösung von 4-Methylpiperidin in DMF hinzu. Lassen Sie die Mischung 15 Minuten lang sprudeln, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen.
Lassen Sie das Lösungsmittel ab und wiederholen Sie den Entschützungsvorgang. Waschen und lassen Sie das geladene Harz wie zuvor dreimal abtropfen. Lagern Sie die Kügelchen unter Lösungsmittel, bis sie für den nächsten Schritt bereit sind.
Um zu überprüfen, ob die beladene Verbindung vollständig entschützt wurde, geben Sie zunächst 1 bis 2 Tropfen jeder Kaiser-Testlösung in zwei Reagenzgläser.
Legen Sie ein paar geladene Kügelchen in ein Reagenzglas und erhitzen Sie beide Röhrchen in einem Ölbad auf 110 Grad. Die Entschützung ist abgeschlossen, wenn sich das Harzgemisch dunkelblau bis violett verfärbt, was auf das Vorhandensein von Amingruppen in der Mischung hinweist.
Um den Kopplungsschritt zu beginnen, waschen Sie die Kügelchen zuerst mit 10 mL NMP unter einem Strom von N2-Gas.
Geben Sie dann 10 mL NMP, 1,6 mmol der nächsten Fmoc-geschützten Aminosäure, 1,6 mmol des Haftvermittlers HBTU und 2,5 mL DIPEA zum geladenen Harz.
Blasen Sie N2-Gas 30 Minuten lang durch die Harzmischung und lassen Sie dann das Lösungsmittel ab. Waschen und tropfen Sie die Kügelchen wie zuvor dreimal mit 10-ml-Portionen DMF ab.
Wiederholen Sie den Kaiser-Test. Die Kopplung ist erfolgreich, wenn sich die Kügelchen und die Lösung gelb verfärben, was darauf hinweist, dass keine Amingruppen vorhanden sind.
Als nächstes spalten Sie die neue Fmoc-Gruppe mit 20 % 4-Methylpiperidin in DMF und waschen Sie die Kügelchen mit 10-ml-Portionen DMF. Wiederholen Sie die Kopplung und Entschützung für jede verbleibende Aminosäure im Zielpeptid.
Nachdem die letzte Aminosäure entschützt und die Harzkügelchen gewaschen wurden, fügen Sie 40 ml Peptidspaltlösung hinzu, um das Peptidprodukt vom Harz zu trennen.
Blasenstickstoffgas 3 Stunden lang durch das Harzgemisch blasen und dann den Auffangkolben austauschen. Die Lösung aus dem Harzgemisch unter Vakuum in den neuen Auffangkolben überführen.
Um das Endprodukt zu erzeugen, entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.
Die Festphasensynthese ist in der Biologie und Chemie weit verbreitet. Schauen wir uns ein paar Beispiele an.
Die Festphasensynthese eröffnete viele neue Synthesewege zu Oligosacchariden, bei denen es sich um kurze Ketten von einfachen Zuckermonomeren handelt, die eine wichtige biologische Rolle spielen, wie z. B. die Energiespeicherung. Im Gegensatz zu Peptidbindungen enthält jede Bindung zwischen Zuckern ein Stereozentrum. Um ein Oligosaccharid zu synthetisieren, müssen nicht nur die Monomere in der richtigen Reihenfolge sein, sondern die Bindungen müssen auch die richtige Stereochemie haben. Es wurden Festphasensynthesetechniken entwickelt, um jedes Monomer durch einen hochgradig stereoselektiven Prozess zu koppeln, der heute ausreichend verfeinert ist, um automatisiert zu werden.
Die Festphasensynthese ist ein gängiger Ansatz der kombinatorischen Chemie, bei der viele Varianten einer Verbindung in einem einzigen Syntheseprozess synthetisiert werden. Das beladene Harz kann leicht in Portionen gespalten werden, um mit verschiedenen Monomeren oder Molekülen zu reagieren. Nach jeder Reaktion werden die Portionen gewaschen und neu kombiniert. Dies wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl an Produkten generiert wurde. Diese Technik ist besonders nützlich in der pharmazeutischen Forschung, da sie zur Erzeugung neuer Verbindungen oder zur Bewertung der Reaktivität einer Verbindung mit einer Vielzahl von Molekülen verwendet werden kann.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Festphasensynthese gesehen. Sie sollten nun die zugrundeliegenden Prinzipien der Festphasensynthese, das Verfahren zur Festphasenpeptidsynthese und einige Beispiele für den Einsatz der Festphasensynthese in der organischen Chemie verstehen. Danke fürs Zuschauen!
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Q1: Why is solid phase synthesis better than traditional multi-step synthesis?
Solid phase synthesis improves overall yield by eliminating intermediate purification steps. Since the product remains bound to the solid support throughout synthesis, solution-phase reagents, solvents, and byproducts can be washed away without isolating each intermediate product. This streamlined approach saves time and increases efficiency in synthesizing oligomers and polymers.
Q2: What role do protecting groups play in solid phase synthesis?
Protecting groups are functional groups that remain unreactive during specific synthesis steps, ensuring monomers bind to the correct atom. Each monomer requires two binding sites but only one can be available at a time. Protecting groups are removed through deprotection, converting them back to reactive functional groups and allowing the next monomer to attach in the correct sequence.
Q3: How does the Kaiser test verify successful deprotection in peptide synthesis?
The Kaiser test detects amine groups present on resin beads after deprotection. When heated with Kaiser reagent solutions, a dark blue to purple color indicates complete deprotection and the presence of free amine groups. If coupling has occurred successfully, the beads turn yellow, showing no amine groups remain available for further reaction.
Q4: What are the main steps in solid phase peptide synthesis?
Solid phase peptide synthesis involves binding an amino acid to resin, then repeatedly deprotecting the amine group, coupling the next amino acid using a coupling agent, and washing away byproducts. After all amino acids are added in sequence, the peptide is cleaved from the resin with cleavage solution and purified. This cyclical process ensures amino acids attach in the correct order.
Q5: How is solid phase synthesis applied in combinatorial chemistry?
In combinatorial chemistry, loaded resin is split into portions that react with different monomers or molecules. After each reaction, portions are washed and recombined, repeating until many product variants are generated. This technique is valuable in pharmaceutical research for synthesizing new compounds and evaluating how a compound reacts with diverse molecules efficiently.
Q6: Why is solid phase synthesis particularly useful for synthesizing oligosaccharides?
Oligosaccharides require monomers in correct order and bonds with precise stereochemistry. Solid phase synthesis techniques enable highly stereoselective coupling of each sugar monomer, controlling stereochemistry at each bond. These methods are refined enough to be automated, making solid phase synthesis ideal for producing complex oligosaccharides with biological roles like energy storage.
Q7: What happens after the final peptide product is cleaved from the resin?
After cleavage with peptide cleavage solution, the peptide product transfers to a new receiving flask under vacuum. The solvent is then removed using a rotary evaporator to generate the final product. This purification step isolates the synthesized peptide from the resin and other impurities for analysis and characterization.