Name: Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger Maus-TH17-Zellen, die IL-17 sezernieren, mittels Zytokin-Sekretionsassay und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht präzise Immunforschung.

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Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Machen Sie einen Puffer mit PBS mit BSA (0,5%) und 2 mM EDTA. Da Luftblasen MACS Trennsäulen Block kann, muss der Puffer entgast und bei 2-8 ° C vor Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Wir verwenden RPMI 1640 Medium mit 5% Maus-Serum. Das Kulturmedium sollte nicht enthalten BSA oder FCS, da diese Verbindungen wird die Besonderheit des Zell-Stimulation verändern. </li><li> Die Maus IL-17 Sekretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit von Miltenyi-Biotec. Das Kit enthält folgende Komponenten: der IL-17 Catch-Reagenz, das IL-17 Detection Antibody (Biotin), die Anti-Biotin-PE, und die Anti-PE MicroBeads. </li></ol> Förderung der Milzzellen <ol><li> Dieses Protokoll ist in der Gegenwart eine negative und positive Kontrolle, wie unstimulierten Splenozyten und eine Gegenfärbung für T-Zellen durchgeführt. Dieses Protokoll wird mit einer sterilen Technik durchgeführt. </li><li> Bereiten Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus-Splenozyten, dass isolierte Verwendung des gentleMACS ™ Dissociator wurden. Die Konzentration der Zellen sollte über Zellzählung vorgegeben werden. Pellet die Zellen bei 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen der Überstand der Pellet mit einer Pipette. Nicht dekantieren das Rohr, um den Verlust des Pellets zu vermeiden. </li><li> Nun, die Zellen in das Kulturmedium und fügen Sie dann zu einem Brunnen. Fügen Sie ausreichend Medium für eine Konzentration von 10 Millionen Zellen pro ml und fünf Millionen Zellen pro Quadratzentimeter. </li><li> Zur Stimulierung einer Immunantwort in unserer resuspendierten Zellen, fügen wir Ionomycin (1 pg / ml) und PMA (10 ng / mL) zur Probe und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Dann wird der Brunnen sind entsprechend gekennzeichnet. </li><li> Jetzt werden wir unsere Zellen für 3 Stunden bei 37 ° C ohne Mischen auf die Stimulation Periode beginnen. Fahren Sie mit IL-17-Analyse 3 Stunden ab Einsetzen der Stimulation, so entsprechend planen. </li><li> So stoppen Sie die Sekretion werden die Zellen auf Eis gelegt, und wir sammeln die stimulierten Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit kaltem Puffer. Die Zellen werden dann aus dem Brunnen zu einem Röhrchen überführt und gewaschen werden, ein zweites Mal. </li><li> Um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt sind, ist es eine gute Idee, Ihr Gericht unter einem Mikroskop zu überprüfen. Wenn Zellen immer noch verbunden bleiben, können Sie die restlichen Zellen durch Spülen der Teller mit kaltem Puffer zu sammeln. Jede Zellklumpen in ihrer Zellsuspension kann mit Hilfe der Pre-Trennfilter werden. </li></ol> Labeling der Zellen mit Catch Reagent <ol><li> Es ist äußerst wichtig zu beachten, dass dieser Test optimal funktioniert, wenn weniger als 2% der IL-17-sezernierenden Zellen vorhanden sind. </li><li> Wenn die Konzentration von IL-17 sezernierenden Zellen wird erwartet, dass mehr als 2% einstellen Volumina entsprechend. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Abbildung 8" width="500" height="162" /></li><li> Eine mögliche Fehlerquelle dieses Verfahrens ist eine Kreuzkontamination von der Catch Reagent, die beim Etikettieren auftreten können, wenn die bi-spezifische Antikörper bindet an ein nicht-sezernierenden T-Zellen und Fallen IL-17 aus einem benachbarten Lymphozyten sezerniert wird, um dadurch Fehlalarme. </li><li> Um dieses Problem zu umgehen, ist es wichtig, kühlen Zellen nach unten vor der Markierung und die Arbeit mit kaltem Puffer zur Verbreitung von IL-17 langsam und vermeiden Kreuzkontamination. Zusätzlich zu halten die Zellen kalt, müssen sie bei einer definierten Konzentration gehalten werden. </li><li> Zu Beginn der Kennzeichnung Verfahren verwenden wir 10 Millionen Zellen in einer 15 ml Tube verschließbar. Werden höhere Zellzahlen verwendet werden müssen, einfach skalieren alle Volumes entsprechend. Sobald die optimale Zellkonzentration erhalten worden ist, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer. </li><li> Spin down die Zellen bei 300 × g für 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge (2-8 ° C). </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen Überstand vollständig mit einer Pipette. Nicht Dekantieren des Überstandes, da dies zu Zellverlust und ungenau Volumina führen wird. Wiederholen Sie den Waschvorgang, die der Zugabe von 10 ml kaltem Puffer, Zentrifugation und Aspiration besteht. </li><li> Jetzt, da wir ein Pellet der gewünschten Reinheit haben, die Zellen in 80 ul der kalten Kulturmedium. Um beschriften, werden wir nun mit 20 ul der Maus IL-17 Catch-Reagenz. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 5 Minuten auf dem Eis. </li><li> Nach der 5 Minuten Inkubationszeit auf Eis, entfernen Sie den Schlauch und verdünnen die Zellen in 10 ml 37 ° C warmen Medium. Dann sichern Sie den Schlauch auf den MACSmix Tube Rotator und inkubieren das Rohr bei 37 ° C für 45 min unter ständiger Bewegung. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C wird neu gestartet Zytokinsekretion. </li></ol> Labeling der Zellen mit IL-17 Detection Antibody (Biotin) und Anti-Biotin-PE <ol><li> Nach dem 45 Minuten-Sekretion Zeitraum bei 37 ° C wird das Reagenzglas sofort auf Eis. Dieser stoppt Zytokinsekretion. Von hier aus ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten.Arbeiten mit kaltem Puffer wird verhindert Kreuzkontaminationen des Catch Reagent. </li><li> Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. </li><li> Das Zellpellet wird in 80 ul kaltem Puffer resuspendiert und die Röhre wird auf Eis gelegt. </li><li> Um zu vermeiden, unspezifische Bindung des Antikörpers, empfehlen wir die Zugabe von 10 &amp;mgr; l FcR Blockierungsreagenz und auf Eis inkubieren für 5 min. Dann fügen wir 20 uL Maus IL-17 Detection Antibody (Biotin), die konjugierte Biotin und für 10 Minuten auf Eis inkubieren ist. </li><li> Wieder einmal waschen Sie die Zellen wie wir schon früher durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min durchgeführt. </li><li> Jetzt saugen Sie den Überstand und Zellpellet in 80 ul kaltem Puffer. </li><li> Add 20 uL unserer sekundären Antikörper, Anti-Biotin-PE. </li><li> Mischen Sie die Zellen und sekundären Antikörper-Lösung, und wieder inkubieren Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis. </li><li> Nach dieser zweiten Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen mit 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge. </li><li> Das Pellet kann nun in 500 ul kaltem Puffer resuspendiert werden. </li><li> Wenn die Zellen für weitere Downstream-Analyse getrennt werden müssen, können sie magnetisch mit Anti-PE-MicroBeads beschriftet werden und manuell oder automatisiert mittels MACS-Säulen und MACS-Separatoren getrennt. </li><li> Wir haben nun die Beschriftung der Splenozyten abgeschlossen und sind für die Analyse bereit. </li></ol> FACS-Analyse <ol><li> Für unsere Analyse werden wir die stimulierten und unstimulierten Splenozyten mittels Durchflusszytometrie zu vergleichen. </li><li> Vor durchflusszytometrischen Analyse werden die Zellen mit Propidiumiodid bei 0,5 pg / mL zu Tor aus toten Zellen gefärbt. Die MACSQuant ™ Analyzer wurde mit 200.000 Zellen pro Probe geladen und wir werden in Zukunft an die Streudiagramme der relativen Antikörperreaktivität in den Proben zu suchen. Zwei wichtige Aspekte für die Analyse von seltenen Zellen - wie IL-17-positiven Zellen - mittels Durchflusszytometrie sind: <ul><li> Einstellung ein Tor auf Lymphozyten in der Vorwärtsstreuung gegenüber Seite Streudiagramm </li><li> und Ausblendung toten Zellen (gefärbt mit Propidiumiodid) und B-Zellen (die unspezifische Hintergrundfärbung führen) zur weiteren Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit </li></ul></li><li> Wir verwendeten CD4-APC-Antikörper gegen T-Zellen und die CD45R/B220-PerCP Antikörper gegen den B-Zellen erkennen zu erkennen. Wir sehen die Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht Eigenschaften der Proben und wenden ein Tor auf der Lymphozyten-Population. </li><li> Ein zweites Tor wurde angewandt, um die bunten abgestorbenen Zellen und gefärbte B-Zellen (Y-Achse) zu sehen. Diese Zellen sind von der T-Zell-Analyse ausgeschlossen. </li><li> In diesem Beispiel, der im Wesentlichen unsere Negativ-Kontrolle, können wir sehen, dass es nur sehr wenige IL-17 sezernierenden CD4-positiven T-Zellen in unstimulierten Proben - etwa 0,003% (Abbildung 4). Mit Blick auf die stimulierten T-Zell-Population, können wir sehen, eine beträchtliche Anzahl von CD4-positiven T-Zellen, die Sekretion von IL-17 - über 0,367% (Abbildung 5A) vor der Trennung und 60,76% nach magnetischer Separation mit MACS Technology (Abbildung 5B). </li></ol>

Alle Protokolle und Datenblätter finden Sie unter www.miltenyibiotec.com. Warnungen Die Reagenzien enthalten Natriumazid. Unter sauren Bedingungen Natriumazid zu Stickstoffwasserstoffsäure, die extrem giftig ist. Azid-Verbindungen sollten mit fließendem Wasser vor dem Wegwerfen verdünnt werden. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden empfohlen, um Ablagerungen in Abflussrohren explosive Bedingungen einstellen können vermieden werden.

TH17-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der adaptiven Immunität und die Entzündungsreaktion und sind eine Schlüsselkomponente beim Vorantreiben autoimmune Entzündung. Dieses Video dokumentiert, wie Miltenyi die Maus verwenden IL-17 Sekretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit (PE). Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, eine Abschätzung der Häufigkeit von IL-17-sezernierenden Zellen in Ihrem Ausgangspunkt Zellpräparation haben. Die entsprechende Zellkonzentration während der Etikettierung und Zytokinsekretion Zeitraum verhindert Kreuzkontaminationen durch andere Zellen in Ihrem Aufhängung und sorgt für zuverlässige Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>Maus IL-17 Sekretions-Assay Zellenanreicherungs- und Detektionskit (PE)</td><td>Reagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidiumiodidlösung</td><td>Reagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR-Blockier-Reagenz, Maus</td><td>Reagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tote-Zellen-Entfernungskit</td><td>Reagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix-Röhrchenrotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482;-Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Start-Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS-Säulen</td><td>Werkzeug</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS-Separator</td><td>Werkzeug</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detektion und isolation von lebensfähigen maus il-17-sezernierenden t-zellen

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Das MACS Zytokinsekretion Assay-Technologie ermöglicht die Erkennung von sezernierten Zytokine auf die einzelne Zelle Ebene und empfindliche Trennung von lebensfähigen Zytokin-sezernierenden Zellen. Um Label IL-17-sezernierenden Zellen, eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus Milzzellen präpariert und bei 37 ° C stimuliert mit PMA / Ionomycin zu Zytokinsekretion zu induzieren. So stoppen Sie die Sekretion Zellen werden dann auf Eis gelegt und an den IL-17 Catch-Reagenz ausgesetzt waren, eine bi-spezifische Antikörper, der an CD45 bindet an der Zelloberfläche von Leukozyten und IL-17, wie es ist ausgeschieden und gefangen in der Nähe der Zelloberfläche. Sekretion wird dann durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37 neu gestartet ° C und IL-17 wird durch die Catch Reagent gefangen. Sekretion wird dann wieder, indem Zellen auf Eis gestoppt. Zum Nachweis der gefangen IL-17 werden die Zellen mit einem zweiten IL-17-spezifischen Antikörper, konjugiert mit Biotin und ein Anti-Biotin-PE-Antikörper inkubiert. Die Zellen können nun direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden oder hergerichtet für die Isolierung und Anreicherung von spätere Kennzeichnung mit Anti-PE konjugierte MicroBeads.

Dieses Verfahren beschreibt die Detektion und Isolation von Maus-TH17 Leukozyten, die sich aktiv sezernieren IL-17 nach Stimulation.

Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

Die MACS Cytokine Secretion Assay-Technologie ermöglicht den Nachweis sezernierter Zytokine auf Einzelzellebene sowie die sensitive Isolierung lebensfähiger ...

Die max-Zytokinsekretions-Assay-Technologie ermöglicht den Nachweis sezernierter Zytokine auf Einzelzell-Ebene und die empfindliche Isolierung lebensfähiger zytokinsekretierender Zellen, um IL-17-sekretierende Zellen zu markieren. Eine Einzelzell-Suspension von Maus-Leukozyten wird hergestellt und bei 37 Grad Celsius mit PMA und Ionomycin stimuliert, um die Zytokinsekretion auszulösen und anschließend zu stoppen. Danach werden die Zellen auf Eis gegeben, wo sie der IL-17-Catch-Reagenz ausgesetzt werden.Wenn die Sekretion durch Erhöhung der Temperatur auf 37 Grad Celsius wieder initiiert wird, wird IL-17 durch das Catch-Reagenz festgehalten. Ein biklonaler Antikörper, der an CD45 auf der Zelloberfläche von Leukozyten und an IL-17 bindet, während es sezerniert und nahe der Zelloberfläche eingefangen wird, stoppt die Sekretion erneut, indem die Zellen auf Eis gestellt werden. Um das festgehaltene IL-17 nachzuweisen, werden die Zellen mit einem zweiten, IL-17-spezifischen Antikörper inkubiert, der mit Biotin konjugiert ist, sowie mit einem Anti-Biotin-PE-Antikörper. Die Zellen können nun direkt per Durchflusszytometrie analysiert oder durch anschließende Markierung mit PE-konjugierten Mikroperlen für die Isolierung und Anreicherung vorbereitet werden. Hallo, mein Name ist Ellie Rankin, eine der Wissenschaftlerinnen bei Mill Tenney Biotech.Heute werde ich Ihnen ein Verfahren zeigen, wie man TH17-Leukozyten isoliert und nachweist, die nach Stimulation IL-17 sezernieren. IL-17 spielt eine wichtige Rolle in der adaptiven Immunität und der entzündlichen Reaktion und ist außerdem entscheidend für die Auslösung von autoimmuner Entzündung. Lassen Sie mich Ihnen zeigen, wie der Assay durchgeführt wird. Für den heutigen Protokollablauf müssen wir zunächst einen Puffer herstellen, der PBS mit BSA und zwei Millimolar EDTA enthält. Da Luftblasen die Trennsäulen blockieren können, muss der Puffer entgast und vor der Verwendung bei zwei bis acht Grad Celsius gelagert werden.Zweitens verwenden wir RPMI 1640-Medium, das 5 % Mausenserum enth&auml;lt. Das Kulturmedium sollte kein BSA oder FCS enthalten, da diese Substanzen die Spezifit&auml;t der Zellstimulation ver&auml;ndern w&uuml;rden. Abschlie&szlig;end ben&ouml;tigen Sie das Maus-IL-17-Sekretions-Assay-Zellanreicherungs- und Detektionskit von MIL 10 E Biotech.Das Kit enthält die folgenden Komponenten: das IL-17-Fängereagenz, den IL-17-Detektionsantikörper, Biotin, den Anti-Biotin-PE und die Anti-PE-Mikroperlen. In der Regel führen Sie dieses Protokoll mit einer negativen und einer positiven Kontrolle durch, beispielsweise unstimulierte PLE-Zellen und eine Gegenfärbung für T-Zellen. Für unsere Demonstration konzentrieren wir uns ausschließlich auf die stimulierten Zellen.Dieses Protokoll wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Unser Protokoll beginnt mit einer Einzelzell-Suspension von Maus-SP-Zellen, die mittels des gentle max associator isoliert wurden. Die Zellkonzentration sollte zuvor durch Zellzählung bestimmt werden.Die Zellen bei 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur pelletieren. Nach der Zentrifugation aspirations wir die Überstände vom Pellet mit einer Pipette ab. Die Röhrchen nicht ausschütten, um Verlust des Pellets zu vermeiden. Die Zellen sollten nun in unserem Kulturmedium resuspendiert und anschließend ausreichend Medium hinzugefügt werden, um eine Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter und 5 Millionen Zellen pro Quadratzentimeter zu erreichen.Um eine Immunantwort in unseren resuspendierten Zellen zu stimulieren, fügen wir Ionomycin und PMA zur Probe hinzu und mischen die Lösung, indem wir sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Anschließend werden die Vertiefungen entsprechend beschriftet. Nun inkubieren wir die Probe drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Vermischung, um die Stimulationsphase zu beginnen.Führen Sie die IL-17-Analyse drei Stunden nach Beginn der Stimulierung durch. Planen Sie dementsprechend. Hier sehen wir stimulierte Maus-Milzzellen.Beachten Sie die charakteristische Morphologie und Zellaggregation stimulierter Zellen. Der Übersichtlichkeit halber verfolgen wir nur die stimulierten Zellen. Ab diesem Punkt sammeln wir die stimulierten Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren, um die Sekretion zu stoppen.Die Zellen werden anschließend mit kaltem Puffer aus der Vertiefung in ein Reagenzglas überführt und ein zweites Mal gewaschen. Um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden, empfiehlt es sich, die Platte unter dem Mikroskop zu überprüfen. Falls weiterhin Zellen anhaftend bleiben, können die verbliebenen Zellen durch Spülen der Platte gesammelt werden.Mit kaltem Puffer können Zellklumpen in Ihrer Zellsuspension mithilfe der Vorab-Filter entfernt werden. Eine mögliche Fallgrube dieses Verfahrens ist die Kreuzkontamination des Catch-Reagenzes, die während der Markierung auftreten kann. Wenn der bispezifische Antikörper an eine nichtsekretierende T-Zelle bindet und IL-17, das von einem benachbarten Lymphozyten sezerniert wird, einfängt, entstehen dadurch falsch positive Ergebnisse. Um dieses Problem zu umgehen, ist es entscheidend, die Zellen vor der Markierung abzukühlen und mit kaltem Puffer zu arbeiten, um die Sekretion und Diffusion von IL-17 einzuschränken und so die Kreuzkontamination zu vermeiden.Es ist äußerst wichtig zu beachten, dass eine Kreuzkontamination auch auftreten kann, wenn mehr als 2 % IL-17-sekretierender Zellen vorhanden sind. Wenn mit einer Konzentration von IL-17-sekretierenden Zellen von mehr als 2 % zu rechnen ist, müssen die Volumina entsprechend angepasst werden. Daher müssen die Zellen neben der Aufrechterhaltung einer niedrigen Temperatur stets in einer definierten Konzentration gehalten werden.Um das Markierungsverfahren zu beginnen, verwenden wir 10 Millionen Zellen in einem 15-Milliliter-Verschlussröhrchen. Falls höhere Zellzahlen verwendet werden müssen, skalieren Sie einfach alle Volumina entsprechend hoch. Sobald die optimale Zellkonzentration erreicht ist, waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter kaltes Pufferlösung hinzufügen.Zentrifugieren Sie die Zellen nun bei 300 Gs für 10 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand vollständig mit einer Pipette. Gießen Sie den Überstand nicht ab, da dies zu Zellverlust und ungenauen Volumina führen würde. Wiederholen Sie den Waschschritt, der aus dem Hinzufügen von 10 Milliliter kaltem Puffer, Zentrifugation und Absaugen besteht.Da wir nun ein Pellet der gewünschten Reinheit haben, resuspendieren Sie die Zellen in einigen Mikrolitern kaltem Kulturmedium, um sie zu markieren. Geben Sie nun 20 Mikroliter der Maus-IL-17-Catch-Reagenz hinzu. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang auf Eis.Nach der fünfminütigen Inkubationszeit auf Eis nehmen Sie das Röhrchen und verdünnen die Zellen in 10 Milliliter Medium, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde. Danach befestigen Sie das Röhrchen auf dem Max-Mix-Tubenrotator und inkubieren es 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Unter kontinuierlicher Bewegung führt das Erhöhen der Temperatur auf 37 Grad Celsius nach der 45-minütigen Sekretionsphase bei 37 Grad Celsius zu einem Wiederaufnahme der Zytokinsekretion. Stellen Sie das Röhrchen unverzüglich auf Eis. Dies stoppt die Zytokinsekretion.Von diesem Punkt an ist es entscheidend, die Zellen auf Eis zu halten. Die Verwendung kalten Puffers verhindert eine Kreuzkontamination des Catch-Reagenz. Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Puffer und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 G und zwei bis acht Grad Celsius.Den Überstand vollständig abpipettieren. Den Waschschritt noch einmal wiederholen. Das Zellpellet wird in 80 Mikrolitern kaltem Puffer resuspendiert und das Röhrchen auf Eis gestellt.Um eine unspezifische Bindung des Antikörpers zu vermeiden, empfehlen wir die Zugabe von 10&nbsp;Mikroliter FCR-Blockierreagenz und Inkubation auf Eis für fünf Minuten. Anschließend geben wir 20&nbsp;Mikroliter Maus-IL-17-Detektionsantikörper, der mit Biotin konjugiert ist, hinzu und inkubieren 10&nbsp;Minuten auf Eis. Waschen Sie die Zellen erneut wie zuvor, indem Sie 10&nbsp;Milliliter kaltes Pufferlösung hinzufügen und bei 2 bis 8&nbsp;Grad Celsius 10&nbsp;Minuten bei 300&nbsp;Gs zentrifugieren.Aspirieren Sie nun und resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 µL kaltem Puffer. Geben Sie anschließend 20 µL des sekundären Antikörpers hinzu: Anti-Biotin-PE. Mischen Sie die Zellen und die Lösung mit dem sekundären Antikörper gründlich und inkubieren Sie das Gefäß erneut 10 Minuten auf Eis.Nach Abschluss der zweiten Inkubation die Zellen mit 10 Milliliter kaltem Puffer waschen und zentrifugieren. Der Pellet kann nun in 500 Mikroliter kaltem Puffer resuspendiert werden. Falls die Zellen für weitere downstream-Analysen getrennt werden müssen, können sie magnetisch mit Anti-PE-Mikroperlen markiert und manuell oder automatisiert mithilfe von Max-Säulen und Max-Separatoren getrennt werden.Wir haben nun die Markierung unserer SPLU-Zellen abgeschlossen und sind bereit für die Analyse. Wir werden die stimulierten und unstimulierten SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie vergleichen, bevor wir fortfahren. Totzellen werden mit Propidiumiodid bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter gefärbt, um sie auszuschließen.Der Durchflusszytometer wurde mit 200.000 Zellen pro Probe beladen, und wir werden nun die Streudiagramme der relativen Antikörperreaktivität in den Proben betrachten. Zwei wichtige Aspekte bei der Analyse seltener Zellen wie IL-17-positiver Zellen mittels Durchflusszytometrie sind die Setzung eines Gates auf Lymphozyten im Vorwärtsstreuung-gegen-Seitenstreuung-Diagramm und das Ausschließen toter Zellen, die mit Propidiumiodid sowie B-Zellen gefärbt sind, da diese eine unspezifische Hintergrundfärbung verursachen können. Um die Empfindlichkeit der Detektion weiter zu erhöhen.Hier verwenden wir einen CD4-APC-Antikörper, um T-Zellen im CD45RB220-PerCP-Antikörper nachzuweisen. Zum Nachweis der B-Zellen betrachten wir die Forward- und Side-Scatter-Eigenschaften der Proben und setzen ein Gate auf die Lymphozytenpopulation. Ein zweites Gate wurde angewendet, um die angefärbten toten Zellen und die angefärbten B-Zellen auf der Y-Achse zu erkennen.Diese Zellen werden von der T-Zell-Analyse ausgeschlossen. In diesem Beispiel, das im Wesentlichen unserer negativen Kontrolle entspricht, erkennen wir, dass es in unstimulierten Proben nur sehr wenige IL-17-sekretierende CD4-positive T-Zellen gibt, etwa 0,003 %. Bei Betrachtung der stimulierten T-Zell-Population sehen wir eine beträchtliche Anzahl an CD4-positiven T-Zellen, die IL-17 sezernieren, etwa 0,367 % vor der Trennung und 60,76 % nach der magnetischen Trennung mit Max-Technologie. Wir haben Ihnen soeben anhand von Videoaufnahmen gezeigt, wie man den IL-17-Sekretionsassay von Miltenyi Biotec für Mäuse zur Zellenanreicherung und Detektion mit PE verwendet.Der wichtigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, eine Vorstellung von der Häufigkeit der IL-17-sekretierenden Zellen zu haben, die in der Ausgangspopulation vorhanden sind. Die richtige Zellkonzentration gewährleistet, dass die Markierung und die Zytokinsekretionsphase weniger Kreuzkontamination aufweisen, wodurch zuverlässige Ergebnisse sichergestellt werden. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen, auch bekannt als iNKT-Zellen. Das Verfahren beginnt mit der Injektion eines synthetischen Glykolipids in eine Maus, um die Aktivierung und Proliferation von iNKT-Zellen in der Milz zu stimulieren. Anschließend werden einzellige Suspensionen aus der Milz hergestellt und mit iNKT-Zell-erkennenden Komplexen, die mit Fluorophoren markiert sind, inkubiert, gefolgt von einer magnetischen Bead-basierten...

Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Die In-vitro-Analyse der Klassenschalter-Rekombination bei Mäusen ist aufgrund zytophiler IgE-Moleküle, die an Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von B-Zellen gebunden sind, eine Herausforderung.  Wir beschreiben eine Methode zur IgE-Detektion unter Verwendung der Trypsin-vermittelten Spaltung von oberflächengebundenem IgE vor der Fixierung und Permeabilisierung für die zytoplasmatische Fluoreszenzfärbung.

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung.  Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse des Phänotyps von regulatorischen T (Treg)-Zellen, die von naiven und chronischen lymphozytären Choriomeningitis-Virus-infizierten Mäusen isoliert wurden. Darüber hinaus stellen wir einen Prozess zur Verfügung, um die suppressive Aktivität derT-reg-Zellen zu bewerten.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Wir beschreiben hier ein transgenes Reporter-Mausmodell, um die IL-22-produzierenden Zellen in verschiedenen Mausgeweben sichtbar zu machen. Mit dieser Methode kann die Position anderer Zytokine oder Sekretärsproteine in der Maus verfolgt werden.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Dieses Papier beschreibt Protokolle zur Bewertung der Tfh- und GC-B-Antwort im Mausmodell einer Influenza-Virusinfektion.

Bewertung von T Follicular Helper Cells und Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die an Typ-2-Entzündungen beteiligt sind, sind hauptsächlich an der Reaktion auf Helmintheninfektionen, allergische Erkrankungen, metabolische Homöostase und Gewebereparatur beteiligt. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung von ILC2s aus der murinen Nasenschleimhaut und zum Nachweis der Expression von CD226 demonstriert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226

Dieses Protokoll beschreibt die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in vitro. Konkret kann in Kombination mit einem auf Multiparameter-Durchflusszytometrie basierenden Ansatz mit dieser Differenzierungsmethode eine Reinheit von 90 % pathogener Th17-Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen gewonnen werden.

In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.

Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger Maus-TH17-Zellen, die IL-17 sezernieren, mittels Zytokin-Sekretionsassay und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht präzise Immunforschung.

Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

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