Biodistribution von Nano-Wirkstoffträgern: Anwendungen von SEM

1. Nanopartikel-Injektion und Organentnahme

1. Injizieren Sie Nanopartikel in eine anästhesierte Maus intravenös, um passives Targeting zu ermöglichen.
2. Zu den gewünschten Zeitpunkten, d.h. 1, 4 und 8 Wochen, nach der Injektion, die Mäuse nach den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) human einschläfern.
3. Öffnen Sie die Körperhöhle und entfernen Sie operativ die Organe von Interesse. Die Organe in 10% Phosphat gepuffertes Formalin in einen Polypropylenbehälter legen, bis die Probenvorbereitung.

2. Gewebeprobenvorbereitung

1. Verwenden Sie Zangen, um das Mausgewebe vom Fixativ in Phosphatgepufferte Saline (PBS) zu übertragen. Gestein die Probe für 30 min, ersetzen Sie die PBS alle 10 min.
2. Entfernen Sie das Gewebe und trocknen Sie mit einem Kimwipe. Dann legen Sie es in eine Kunststoffform mit optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT). Über Nacht bei -80 °C lagern.
3. Am nächsten Tag die Probe auf den Kryostat übertragen und die Temperatur auf -23 °C einstellen.
4. Etikettgleitet mit dem Organtyp und der Nanopartikelgröße und legen Sie sie in ein Regal im Kryostat.
5. Bedecken Sie das Kryostatfutter mit OCT und legen Sie die Probe darüber. Senken Sie den Extraktorkolben über die Probe und lassen Sie ihn für 3-5 min ausdemieren.
6. Montieren Sie das Futter auf den Probenhalter und richten Sie es so aus, dass die Klinge direkt über die gefrorene Probe geschnitten werden kann. Bringen Sie die Probe in die Nähe der Klinge für grobe Verkleidung. Stellen Sie die Dicke auf 30 m ein und schneiden Sie mehrere Abschnitte, bis eine gleichmäßig geschnittene Scheibe hergestellt wird.
7. Wechseln Sie zu feiner Verkleidung, indem Sie die Schnittdicke auf 7-8 m verringern. Sammeln Sie einen in Scheiben geschnittenen Abschnitt, indem Sie eine beschriftete Glasrutsche auf die Scheibe drücken. Platzieren Sie zwei Folien auf jeder Folie, und lagern Sie sie in einem Schiebeträger. Bei Raumtemperatur trocknen lassen.
8. Nach dem Trocknen die Proben dehydrieren, indem Sie das Schiebegestell in 50% Ethanol für 3 min tauchen, um OCT zu entfernen. Dann das Rack für 3 min auf 80% Ethanol übertragen, bevor es das Rack in einem 1:1-Verhältnis von kaltem Methanol zu Aceton für 10 min bei -20 °C legt.
9. Entfernen Sie das Schiebegestell und entleeren Sie das überschüssige Lösungsmittel auf einem Papiertuch. Nach 20–30 min die Dias in eine Diabox legen und bis zur Bildgebung bei -20 °C in einem Gefrierschrank aufbewahren.

3. Hochauflösende Bildgebung mit SEM und EDS

1. Bereiten Sie die Probe wie in "SEM Imaging of Biological Samples" beschrieben vor. Dann laden Sie die Probe in das SEM.
2. Schalten Sie das SEM ein, und stellen Sie den Arbeitsabstand auf etwa 5 mm und die Beschleunigungsspannung und den Strahlstrom auf 25 keV ein, was normalerweise zu hoch für eine biologische Probe wäre. Die Probe ist jedoch zur Leitfähigkeit und zum Schutz beschichtet.
3. Beginnen Sie mit der Bildgebung und zoomen Sie auf etwa 1.000-2.000X Vergrößerung, um die Strukturen zu sehen, die die Nanopartikel enthalten würden. Beachten Sie, dass man sie ohne Rückstreuung (BSD) nicht unter einer bestimmten Tiefe unterscheiden kann.
4. Setzen Sie den BSD unter den gleichen Parametern ein und verschieben Sie die Bühne in z-Richtung auf den gleichen Arbeitsabstand wie zuvor.
5. Beginnen Sie mit der Bildgebung bei etwa der gleichen Vergrößerung und überprüfen Sie, ob Sie in der Lage sind, einen hohen Kontrast in Gegenwart von Nanopartikeln zu sehen. Speichern Sie die Bilder.
6. Verwenden Sie verschiedene BSD-Konfigurationen (bei denen sich die Ladungen auf dem Detektor ausrichten), um diejenige auszuwählen, die den höchsten Kontrast für die Nanopartikel anzeigt.
7. Zoom-in auf einem kontrastreichen Bereich, der ein Nanopartikel oder einen Klumpen von Nanopartikeln zeigt.
8. Öffnen Sie die^2. Kamera der Kammer und beobachten Sie, wie Sie den EDS in das System einlegen, indem Sie die Abwärtstaste am SEM-Aufsatz drücken. Sobald der EDS nah ist, aber nicht den BSD oder die Pistole berührt, lassen Sie die Taste los.
9. Öffnen Sie das Aztec-Programm auf dem EDS-Computer (noch am Arbeitsplatz) und erfassen Sie ein Bild vom SEM. Verwenden Sie die "Point and Shoot"-Methode, um auf einen Bereich zu klicken, der sehr dicht an Kontrast- und Nanopartikeln ist.
10. Das EDS zeigt von diesem Punkt an das Spektrum der charakteristischen Röntgenstrahlen. Suchen Sie nach Barium- und Titanspitzen, die im Diagramm identifiziert werden sollen. Dies bestätigt, dass das, was Sie betrachten, in der Tat die Nanopartikel und nicht irgendeine Art von Kontamination sind.
11. Kehren Sie zum Beispiel zurück und verwenden Sie die Atlas-Software, um die Ränder des Organs auf der Folie zu kartieren. Wählen Sie das "Organ"-Protokoll zum Erstellen eines Mosaikbildes des Bereichs aus, und lassen Sie es laufen (dies kann höchstens ein paar Stunden dauern).
12. Sobald das zusammengesetzte Bild von der Software erstellt und genäht wurde, exportieren Sie es als Tif-Datei.
13. Öffnen Sie die Tif-Datei in ImageJ, einer Open-Source-Software, und passen Sie Kontrastschwellenwerte an, um die Bereiche mit sehr hohem Kontrast (d. h. die Nanopartikel) hervorzuheben. Verwenden Sie integrierte Funktionen, um das Volumen von Nanopartikeln mithilfe der im Organprotokoll definierten Pixelgröße zu quantifizieren (sollte etwa 100 nm betragen).
14. Während sich dieses Verfahren nur auf die 1-Wochen-Probe der Mauslunge bezieht, wird dieses Verfahren mit den Proben aus anderen Wochen und anderen Organen wiederholt, um ein Diagramm zu erstellen, das die Verteilung zeigt.
15. Nach der Berechnung der Bioverteilung für jedes Organ für jede Woche zeigen Bioverteilungsdiagramme die Veränderungen in der Bioverteilung und Konzentration von Nanopartikeln im Laufe der 8 Wochen. Diese zeigen die Spitzenkonzentration und geben auch Auskunft darüber, wie lange es dauert, bis die Nanopartikel aus dem Organ entfernt sind.