Antikörper-Generierung: Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hybridomen

Antikörper sind ein mächtiges Werkzeug für Forschung und Diagnose, was bedeutet, dass ihre Herstellung in großen Mengen oft notwendig ist.

Der erste Schritt zur Generierung von Antikörpern besteht darin, das gewünschte Antigen in ein Wirtstier zu injizieren. Das Antigen aktiviert die B-Zellen des Wirts, die dann Antikörper produzieren und freisetzen, die spezifisch für dieses Antigen sind. Anschließend wird ein regelmäßiges Screening der Antiseren des Wirtstieres auf das Vorhandensein des Zielantikörpers mittels ELISA oder einer anderen Nachweismethode durchgeführt. Sobald sie nachgewiesen ist, wird die Milz des Wirtstieres, in der sich die B-Zellen befinden, entfernt. Wenn nun alle B-Zellen aus der Milz isoliert sind, sollte dies eine Population umfassen, die Antikörper gegen das gewünschte Antigen sezerniert. Wir bezeichnen diese Population als polyklonal, da jede Zelle wahrscheinlich an ein anderes Epitop des Antigens bindet und daher ihren eigenen individuellen und einzigartigen Antikörper erzeugt.

Um monoklonale Antikörper zu erzeugen, also Antikörper, die gezüchtet werden, um ein bestimmtes Epitop zu erkennen, muss zunächst die einzelne B-Zelle, die den gewünschten Antikörper produziert, isoliert und kultiviert werden. Leider überleben B-Zellen in Kultur nicht gut. Um diese Hürde zu überwinden, fusionieren Wissenschaftler B-Zellen mit unsterblichen Myelomzellen, was zu Hybridomen führt. Diese Zellen werden dann in einem selektiven Medium gezüchtet, das nur den Hybridomen erlaubt, zu wachsen und Antikörper freizusetzen. Auch hier wird das Medium mit einer Methode wie dem ELISA auf den gewünschten Antikörper gescreent. Sobald es nachgewiesen ist, werden die Hybridome über einen Prozess kloniert, der als begrenzende Verdünnung bezeichnet wird, eine serielle Verdünnung der Mutterkultur, die dazu führen sollte, dass einzelne Zellen in die Vertiefungen einer Screening-Platte ausgesät werden. Dies ermöglicht das Wachstum von Hybridomen aus einer einzigen Elternzelle, wodurch eine monoklonale Zelllinie entsteht, die nur den gewünschten Antikörper freisetzt. Diese monoklonalen Linien können in Gewebekulturflaschen expandiert werden, um große Mengen an monoklonalen Antikörpern herzustellen. Danach, wenn die Zellen abzusterben beginnen, können die Antikörper mit Ammoniumsulfat aus dem Medium ausgefällt werden. Normalerweise interagieren Antikörper in Lösung durch hydrophile Wechselwirkungen mit Wasser. Ammonium und Sulfat sind jedoch hochgeladene Ionen, die die Wassermoleküle von den Antikörpern trennen, wodurch die Löslichkeit der Antikörper verringert und sie ausfallen.

Überprüfen Sie zunächst die Materialliste und bereiten Sie alle Medien, Verbrauchsmaterialien und Arbeitsoberflächen für das Protokoll vor.

Schalten Sie dann ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein. Geben Sie anschließend 10 Milliliter vollständiges RPMI in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und 15 Milliliter vollständiges RPMI in einen T75-Zellkulturkolben und stellen Sie sie beiseite. Nehmen Sie die gefrorene Durchstechflasche mit Hybridomzellen vorsichtig und mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung aus dem Flüssigstickstofflager. Um den Druck im Inneren des Fläschchens zu verringern, lösen Sie die Kappe leicht. Inkubieren Sie nun das Fläschchen vorsichtig im Wasserbad und achten Sie darauf, dass die Kappe über der Wasseroberfläche bleibt, um die Gefahr einer Kontamination zu minimieren. Wenn die Zellen fast aufgetaut sind, was in der Regel etwa zwei Minuten dauert, stellen Sie das Fläschchen in die Gewebekulturhaube.

Wischen Sie dann die Außenseite des Fläschchens mit 70 % Ethanol ab, bevor Sie die Kappe entfernen. Übertragen Sie die Zellen mit einer sterilen Pipette in das konische Röhrchen, das 10 Milliliter vollständiges RPMI-Medium enthält. Zentrifugieren Sie das Röhrchen dann fünf Minuten lang bei 1200 U/min. Bewegen Sie das Röhrchen nach der Zentrifugation zurück zur Gewebehaube und wischen Sie die Außenseite des Röhrchens mit Ethanol ab. Ohne das Pellet zu stören, den Überstand verwerfen und dann fünf Milliliter frisches, vollständiges RPMI-Medium hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren, um es wieder zu suspendieren. Übertragen Sie anschließend die Zellen in den T75-Zellkulturkolben und legen Sie den Kolben in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, was normalerweise etwa drei Tage dauert. Beachten Sie, dass Hybridomzellen nicht adhärent sind und im Medium schwebend wachsen. Die Zeit bis zum Erreichen einer ausreichenden Konfluenz kann je nach Anzahl der lebenden Zellen und der Art der verwendeten Hybridomzelle variieren.

Sobald die Zellen ausreichend zusammenfließen, werden sie mit einer sterilen 25-Milliliter-Pipette aus dem Kulturkolben in ein konisches Zentrifugenröhrchen überführt. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1200 U/min für fünf Minuten. Während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, geben Sie 18 Milliliter vollständiges RPMI in jeden der drei neuen T75-Zellkulturkolben und legen Sie diese beiseite. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in sechs Millilitern vollständiger RPMI. Geben Sie anschließend zwei Milliliter der Zellsuspension in jeden der drei neuen Zellkulturkolben. Zum Schluss werden die Kolben in einen Inkubator gegeben, der auf 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius eingestellt ist, und inkubieren Sie, bis die Kolben zu etwa 80 % zusammenfließen, etwa drei Tage.

Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in dem serumfreien Medium fortzusetzen, das für Hybridom-Zelllinien entwickelt wurde, wie z. B. das kommerziell erhältliche HB Basal Liquid Medium, das das HB101-Präparat enthält. Übertragen Sie die Zellen aus jedem Zellkulturkolben in konische Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen dann durch Zentrifugation bei 1200 U/min für fünf Minuten. Geben Sie nun je 230 Milliliter des serumfreien Mediums HB101 in sechs 225 Zentimeter große Zellkulturflaschen und stellen Sie sie beiseite. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 10 Millilitern zugesetztem HB101-Medium. Geben Sie dann in jeden Zellkulturkolben fünf Milliliter der Zellsuspension. Legen Sie die Kolben in den 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und züchten Sie die Zellen etwa drei Wochen lang weiter. Während dieser Zeit produzieren die Zellen den interessierenden monoklonalen Antikörper und geben ihn an das Kulturmedium ab, und der Antikörper ist bereit für die Reinigung, wenn die Zellen zu sterben beginnen.

Um die zellulären Trümmer von den antikörperhaltigen Nährmedien zu entfernen, gießen Sie den Inhalt der Kulturflaschen in Röhrchen für einen Rotor mit festem Winkel. Legen Sie die Röhrchen in den Rotor und stellen Sie sicher, dass er vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert ist. Drehen Sie die Röhren acht Minuten lang mit 10.000 U/min. Während die Proben zentrifugieren, legen Sie ein Zwei-Liter-Plastikbecherglas mit einem Rührstab in einen Eiskübel und stellen Sie den Eiskübel dann auf eine Rührplatte.

Befestigen Sie als Nächstes einen 500-Milliliter-Filterdeckel an einer Ein-Liter-Flasche. Befestigen Sie diese Flaschenfiltereinheit mit dem entsprechenden Schlauch an einem Hausstaubsauger. Gießen Sie dann den Überstand, der den Antikörper enthält, in die Filteroberseite. Das restliche Medium wird zentrifugiert, um die Zelltrümmer vom antikörperhaltigen Überstand zu trennen. Wenn die Filteroberseite mit Überstand gefüllt ist, starten Sie das Vakuum. Wenn die Ein-Liter-Auffangflasche fast voll ist, entfernen Sie den Filterdeckel und gießen Sie den gefilterten Überstand in den Zwei-Liter-Becher auf Eis. Wiederholen Sie die Filtrationsschritte, bis der gesamte Überstand verarbeitet ist.

Wenn die gesamte Probe verarbeitet ist, wiegen Sie 295 g Ammoniumsulfat pro einem Liter gefiltertem Überstand. Starte die Rührplatte und gib das Ammoniumsulfat in den nächsten Stunden langsam in den Überstand. Dies verhindert eine lokal hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz, die zur Ausfällung unerwünschter Proteine führen kann. Sobald das gesamte Ammoniumsulfat hinzugefügt wurde, decken Sie das Becherglas mit Folie ab und stellen Sie es zusammen mit der Rührplatte in einen kalten Raum bei vier Grad Celsius und stellen Sie es so ein, dass die Antikörperlösung über Nacht gerührt wird.

Gießen Sie am nächsten Morgen die Ammoniumsulfat-haltige Antikörperlösung aus dem Zwei-Liter-Becherglas in saubere Röhrchen für den Festwinkelrotor. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang ohne Pause bei 6500 U/min, um den Antikörper am Boden der Röhrchen zu pelletieren. Saugen Sie anschließend den Überstand ab und achten Sie darauf, das weiche Pellet nicht aufzusaugen. Verwenden Sie weiterhin denselben Satz Röhrchen, um den pelletierten Antikörper aus dem Rest des Ammoniumsulfat-haltigen Überstands zu sammeln. Nach der letzten Aspiration resuspendieren Sie jedes Antikörperpellet in etwa einem Milliliter PBS.

Um das Ammoniumsulfat aus der Antikörperlösung zu entfernen, schneiden Sie zunächst etwa einen Zoll Dialyseschlauch pro Milliliter Antikörperlösung ab. Wischen Sie anschließend den Schlauch mit destilliertem Wasser ab und binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauchs. Füllen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser, um zu prüfen, ob der Knoten undicht ist. Wenn nach einigen Minuten kein Leck auftritt, leeren Sie das Wasser aus dem Schlauch.

Pipettieren Sie anschließend die Antikörperlösung in den Schlauch. Um so viel Antikörper wie möglich zurückzugewinnen, spülen Sie die Röhrchen mit zusätzlichen 0,25 Millilitern PBS und übertragen Sie diese ebenfalls auf die Schläuche. Befestigen Sie die Oberseite des Schlauchs mit einem Dialyseclip so nah wie möglich an der Lösung. Klebe dann die Oberseite des Schlauchs an die Außenseite eines Vier-Liter-Becherglases, wobei der gefüllte Teil des Schlauchs in das Becherglas hängt. Nehmen Sie nun das Becherglas in den vier Grad kalten Raum und stellen Sie es auf eine Rührplatte. Füllen Sie den Becher bis zum Rand mit PBS und fügen Sie einen Rührstab hinzu. Lassen Sie das Röhrchen und die Lösung über Nacht etwa acht Stunden lang rühren. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das PBS im Becherglas durch frisches PBS und lassen Sie das Becherglas dann etwa acht Stunden lang erneut umrühren. Wiederholen Sie den Vorgang später am Abend ein letztes Mal. Öffnen Sie morgens den Dialyseschlauch und überführen Sie dann die Antikörperlösung aus dem Schlauch in konische 15-Milliliter-Röhrchen. Um Fällungsmittel zu entfernen, die sich während der Dialyse gebildet haben könnten, zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1200 U/min. Zum Schluss den Überstand in frische Röhrchen umfüllen.

Um die Antikörperkonzentration zu quantifizieren, wird zunächst eine 20-fache Verdünnung vorgenommen, indem fünf Mikroliter eines Antikörperaliquots zu 95 Mikrolitern PBS hinzugefügt werden. Pipettieren Sie dann den verdünnten Antikörper in eine Küvette und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration bei 280 Nanometern aufzuzeichnen. Berechnen Sie anschließend die Antikörperkonzentration mit der gezeigten Formel. Beschriften Sie schließlich die Fläschchen mit Schraubverschluss mit dem Namen des Antikörpers, der Konzentration, dem Herstellungsdatum und, falls zutreffend, der Chargennummer und dem Namen des Experimentators und aliquotieren Sie dann den Antikörper in die markierten Fläschchen mit Schraubverschluss. Diese können bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Beispielausbeuten unter Verwendung der 120G8-Anti-Maus-CD317- oder PDCA-1-Hybridomlinie lagen zwischen 44 und 99,6 Milligramm, was typischerweise eine durchschnittliche Menge von 67,3 Milligramm ergibt. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder Produktionslauf mit derselben Hybridom-Zelllinie in der Menge des am Ende verfügbaren monoklonalen Antikörpers leicht unterschiedlich sein kann.