Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie

1. Vorbereitung

1. Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
2. Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann gründlich trocken.
3. Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.

2. Dissektion

1. Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus durch Hypoxie. Sichern Sie die eingeschläferte Maus auf einer Sezierplatte in der Supine-Position und führen Sie eine Längs-Laparotomie mit Schere und Zange durch.
2. Mit Zange, bewegen Sie den Darm und Magen auf der rechten Seite des Bauches, um den Magen und Milz auszusetzen. Die Milz ist am Magen befestigt.
3. Mit Zangen die Milz vorsichtig vom Magen lösen und in die Petrischale legen, die 5 ml HBSS 2% FCS enthält.

3. Immunzellisolierung

1. Legen Sie die Milz auf ein 40 m Zellsieb über die gleiche Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es zu dissoziieren.
2. Übertragen Sie die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
3. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
4. Das Pellet in 2 ml Kaliumacetat wieder aufsetzen, um die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie 2 min und machen Sie dann das Volumen bis zu 15 ml mit HBSS 2% FCS.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml HBSS 2% FCS wieder aus.
6. Zählen Sie die Zellen mit einem Trypan-Blau-Färbe-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 10⁷ Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.

4. CFSE Färbung und T-Zell-Stimulation

1. 10⁷ isolierte Milzzellen/Rohr in 4 Röhren verteilen (15 ml-Rohre, beschriftet 1 bis 4)