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Für die meisten immunologischen Studien ist die Messung der Proliferation von Immunzellen ein wichtiger Schritt, und die auf Fluoreszenzfarbstoffen basierende CFSE-Methode wird häufig verwendet. Die richtige Zellteilung ist für Immunzellen wichtig, da sie sowohl das Niveau als auch die Spezifität einer Immunantwort reguliert. Zum Beispiel vermehren sich T-Zellen, um Krebszellen zu identifizieren und abzutöten, und B-Zellen durchlaufen eine Zellteilung, um spezifische Antikörper zu produzieren. Die übergeordnete Prämisse des CSFE-Assays besteht darin, die Zellen mit dem grün fluoreszierenden Farbstoff CFSE zu färben, der in lebende Zellen eindringt und stabil an die darin befindlichen Proteine bindet, was zu einer dauerhaften Markierung führt. Wenn sich die farbstoffhaltige Elternzelle teilt, erhält jede Tochterzelle die Hälfte der Fluoreszenz von der Mutterzelle.
Dieser Prozess setzt sich in den nachfolgenden Teilungen fort, wobei die Farbstoffintensität mit jeder Teilung allmählich abnimmt. Am gewünschten Endpunkt wird die Fluoreszenzintensität jeder Zelle mittels Durchflusszytometrie gemessen. Diese Daten werden dann verwendet, um die Anzahl und das Muster der Teilungen zu quantifizieren, die die Zellen durchlaufen haben. Wie hier gezeigt, stammt die Zellpopulation mit der höchsten Fluoreszenz aus der Elterngeneration. Die zweithöchste gehört der zweiten Generation und so weiter. Die Anzahl der Peaks bestimmt die Anzahl der Zellteilungen.
Darüber hinaus können bei Verwendung von primären Immunzellen bestimmte Zellpopulationen, wie z. B. die T-Zellen, mit einem andersfarbigen Fluoreszenzfarbstoff zusammen mit CFSE markiert und gleichzeitig mit Hilfe der mehrfarbigen Durchflusszytometrie identifiziert werden. Die neuen Daten können auf der gleichen Grafik dargestellt werden, so dass nun die T-Zell-Subpopulation mit unterschiedlichen CFSE-Färbeintensitäten dargestellt werden kann, anhand derer die Proliferationsrate der T-Zellen spezifisch analysiert werden kann. Dieses Video zeigt das Protokoll für die CFSE-Färbung von Maus-Splenozyten, die mit einem Anti-CD3-Antikörper stimuliert werden. Es folgen die Färbung zur Markierung von T-Zellen und die Durchflusszytometrie, um ihre Zellproliferation zu verfolgen.
Ziehen Sie zunächst geeignete Schutzkleidung und Laborhandschuhe an. Waschen Sie anschließend eine Pinzette und eine Präparierschere zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70 % Ethanol und wischen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch trocken. Bereiten Sie 50 Milliliter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit einer Konzentration von 2 % fötalem Kälberserum (FCS) vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einem 50-Milliliter-Röhrchen kombinieren. Mischen Sie, indem Sie die Lösung etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Anschließend werden Milzzellen der Maus isoliert, wie im Videoprotokoll für die FACS-Isolierung von Milz-B-Lymphozyten gezeigt.
Markieren Sie vier 15-Milliliter-Röhrchen eins bis vier und geben Sie eins mal 10 zu den siebten isolierten Milzzellen. Geben Sie anschließend drei Milliliter HBSS 2% FCS in jedes Röhrchen. Pipettieren Sie dann einen Mikroliter von fünf mikromolaren Carboxyfluorescein-Succinimidylester oder CFSE in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator für 10 Minuten. Die Zellen in den Röhren eins und zwei werden nicht stimuliert. Sie werden verwendet, um das basale Proliferationsniveau von Milz-CD4- und CD8-T-Zellen aufzudecken.
Pipettieren Sie 10 Milliliter HBSS 2% FCS in diese Röhrchen. Die Röhrchen drei und vier werden mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert, um die Auswirkungen auf den Zellzyklus zu beobachten. Geben Sie 10 Milliliter HBSS 2 % FCS und Anti-CD3-Antikörper in einer Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter in die Röhrchen drei und vier. Als nächstes zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überstände. Resuspendieren Sie die Pellets in zwei Millilitern HBSS 2% FCS und pipettieren Sie die resultierenden Lösungen in separate Vertiefungen auf einer Sechs-Well-Platte. Beschriften Sie die Platte vorsichtig von eins bis vier, um die Identität der Probe im Auge zu behalten. Inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.
Geben Sie am dritten Tag zwei Milliliter HBSS 2% FCS in die Vertiefungen eins und drei, die die Zellen aus den Röhrchen eins und drei enthalten sollten. Pipettieren Sie kräftig auf und ab und geben Sie die Proben dann in beschriftete Fünf-Milliliter-FACS-Röhrchen. Setzen Sie die Sechs-Well-Platte wieder in den Inkubator ein. Diese verbleibenden Zellen aus den Vertiefungen zwei und vier werden am fünften Tag analysiert, um die langfristigen Auswirkungen der Stimulation auf den Zellzyklus zu untersuchen. Die Röhrchen bei 370 x g sieben Minuten bei 10 Grad Celsius zentrifugieren und dann die Überstände verwerfen. Geben Sie nun 100 Mikroliter Antikörpermischung in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Geben Sie anschließend einen Milliliter HBSS 2% FCS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überstände. Die Pellets in 200 Millilitern HBSS 2% FCS wieder aufhängen und gut mischen. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue, etikettierte FACS-Röhrchen.
Bewerten Sie dann die T-Zellproliferation mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt. Gate der Zellen, um lymphoide CD3-positive Zellen auszuwählen und CD4-positive und CD8-positive Zellen zu unterscheiden, und Aufzeichnung der Daten für die Röhrchen eins und drei. Wiederholen Sie am fünften Tag den Zellfärbeprozess mit den Zellen aus den verbleibenden zwei Vertiefungen der Sechs-Well-Platte.
Wir werden die Auswirkungen der CD3-Stimulation auf den Zellzyklus von CD4- und CD8-positiven Zellen drei Tage und fünf Tage nach der Stimulation analysieren. Um zu beginnen, klicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie Ihre Dateien in das Fenster Alle Beispiele. Doppelklicken Sie auf die Datei für die nicht stimulierten Zellen, die am dritten Tag gesammelt wurden, um ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung auf der y-Achse und seitlicher Streuung auf der x-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf das Polygon, um die Lymphozytenpopulationen basierend auf ihrer Morphologie einzukreisen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Subpopulation die Lymphozyten der Population und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Population und wählen Sie im neuen Fenster Thy1.2 auf der y-Achse und CD3 auf der x-Achse. Klicken Sie dann auf das Polygon, um die doppelt positiven Zellen CD3 und Thy1.2 einzukreisen. Benennen Sie die Grundgesamtheit im neuen Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation in T-Zellen und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Bevölkerung. Wählen Sie im neuen Fenster CD4 auf der Y-Achse und CD8 auf der X-Achse aus. Klicken Sie dann auf das Polygon, um die CD4-positive Population einzukreisen. Nennen Sie die Population im neuen Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation CD4-T-Zellen und klicken Sie auf OK. Klicken Sie nun auf das Polygon, um die CD8-positive Population einzukreisen. Nennen Sie die Population im neuen Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation CD8-T-Zellen und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diese Schritte mit den anderen Dateien.
Um die Häufigkeiten von sich teilenden und nicht teilenden Zellen zu bestimmen, visualisieren Sie zunächst die Zellpopulationen, indem Sie auf Layout-Editor klicken. Ziehen Sie dann die CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen aus jeder der vier Röhren in das Fenster "Alle Proben". Diagramme, die Ihre Populationen darstellen, werden angezeigt. Doppelklicken Sie für jede Röhre auf das Punktdiagramm für CD8-T-Zellen und wählen Sie Histogramm unter Diagrammdefinition aus, um die Ergebnisse zu visualisieren. Wählen Sie CFSE als Parameter, um die stimulierten und unstimulierten Zellpopulationen zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Nicht teilende Zellen behalten höhere CFSE-Spiegel bei, während proliferierende Zellen den CFSE-Gehalt an sich teilende Zellen aufteilen.
Doppelklicken Sie nun bei gedrückter Umschalttaste auf das Histogramm. Klicken Sie im neuen Fenster auf Bereich und wählen Sie den CFSE-Bereich aus, der dem höchsten Peak entspricht. Benennen Sie die Population im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation in "Nicht teilende CD8-T-Zellen" und beschriften Sie die Population mit "Dividing CD8 Cells". Wiederholen Sie nun den Vorgang, um die teilenden und nicht teilenden CD4-T-Zellen in jedem Röhrchen auszuwählen. Um die Häufigkeit der Teilung von CD3-positiven Zellen zu untersuchen, klicken Sie auf Tabelleneditor. Ziehen Sie dann die interessierenden Populationen, "Dividing CD8 T-Cells" und "Dividing CD4 T-Cells", in die Tabelle. Wählen Sie im Menü Statistik die Option Häufigkeit von T-Zellen aus. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen, um die Häufigkeit in einer neuen Tabelle anzuzeigen.
