Assay für Zelltod: Chrom Release Assay der zytotoxischen Fähigkeit

In diesem Video werden Sie beobachten, wie Sie den Chromfreisetzungstest durchführen und das zytotoxische Potenzial der Effektorzellen bestimmen.

Immunzellen sind verantwortlich für die Identifizierung und Entfernung potenziell schädlicher Zellen, wie Krebs oder virusinfizierte Zellen, aus dem Körper, der ein integraler Bestandteil der Immunantwort ist. Mehrere Immunzellen, wie T-Zellen und NK-Zellen, besitzen eine Eigenschaft, die als zytotoxisches Potenzial bekannt ist, die die Fähigkeit ist, Zielzellen zu identifizieren und Proteine zu sezernieren, die Proteinabbau, Lyse und Tod dieser Zielzellen induzieren. Die Quantifizierung des zytotoxischen Potenzials ist entscheidend für die Messung der Aktivierung und Potenz von Immunzellen, und der Chromfreisetzungstest wird häufig für diesen Zweck verwendet.

Diese Methode ermöglicht es Benutzern, Zytoxizität durch bestimmte Arten von Immunzellen unter verschiedenen Bedingungen induziert zu vergleichen, was für die Untersuchung der Krebsimmuntherapie und immunitätsbedingte Krankheiten wertvoll ist. Zunächst werden die Zielzellen, wie Krebszellen, mit einem radioaktiven Isotop, Chrom 51, inkubiert, das von den Zellen aufgenommen wird. Als nächstes werden diese radiobeschrifteten Zellen mit den isolierten Immunzellen von Interesse, auch Effektorzellen genannt, in einer runden Bodenplatte mit 96-Well-Platte kultiviert, um die Interaktion zwischen den beiden Zelltypen zu erleichtern.

Die Gesamteinrichtung des Assays beinhaltet die Inkubation einer bestimmten Anzahl von Zielzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Immunzellen, zusammen mit entsprechenden Kontrollen. Die Co-Kultur ermöglicht es den Effektorzellen, Apoptose und Lyse in den Zielzellen zu induzieren, was zur Freisetzung des intrazellulären Chroms 51 in den Überstand führt. Dann wird zu einem voroptimierten Zeitpunkt der Überstand, der das freigesetzte Chrom enthält, aus allen Brunnen geerntet. Das radioaktiv ist deaktiv istde Chrom 51, erfährt spontan radioaktiven Zerfall, um Gammastrahlung auszusenden. Die Gammastrahlungswerte in den Überständen aus allen Brunnen in der Assayplatte stellen eine quantifizierbare Ausgabe der Lyse der Zielzellen dar. Dies wird mit einem Gammazähler gemessen, der dann verwendet wird, um das zytotoxische Potenzial der Immunzellen zu bestimmen.

Zunächst werden die Zielzellen, in diesem Beispiel die menschliche Melanomzelllinie WM793, zu einer einzelzelligen Suspension präpariert. Entfernen Sie dazu zunächst die Medien aus dem Gewebekulturkolben und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS. Dekantieren Sie die PBS und fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin auf die Platte für etwa zwei Minuten. Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen, und fügen Sie dann fünf Milliliter RPMI-Medien in den Kolben. Pipette die Medien nach oben und unten, um die Zellen zu sammeln und fügen Sie diese Suspension zu einem 15 Milliliter konischen Rohr.

Legen Sie das Rohr in die Zentrifuge für fünf Minuten bei 1200 U/min. Entfernen Sie als Nächstes das Medium aus dem Rohr, um sicherzustellen, dass das Zellpellet nicht gestört wird. Streichen Sie vorsichtig den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu stören und fügen Sie 10 Milliliter Medien in das Rohr. Dann, sanft Pipette die Medien nach oben und unten, um die Zellen in Suspension zu bringen. Als nächstes bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und übertragen Sie zwei Milliliter der ursprünglichen Zellsuspension in ein neues 15 Milliliter konisches Rohr. Legen Sie das Rohr in eine Zentrifuge und pellet die Zellen bei 12 hundert RPM für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation das überschüssige Medium aus dem Rohr in einen Abfallbehälter gießen. Kurz wirbeln Sie das Rohr, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückgelassenen Mediums wieder aufzuhängen.

Bereiten Sie als Nächstes die Verwendung von Chromium 51 vor, indem Sie in einen Laborraum wechseln, der für diese spezielle Radioaktivität vorgesehen ist. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des Chromium s. 51 in allen Schritten sowie eine ordnungsgemäße Beschilderung geben, um anzugeben, wo Proben mit Chrom 51 aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist auch notwendig, um im Raum für eine mögliche Kontamination zu dienen.

Einmal für die ordnungsgemäße Verwendung von Radioaktivität eingerichtet, fügen Sie 100 Mikrocuries Chrom 51 direkt in die Zielzellsuspension. Fügen Sie dann ein kleines Stück radioaktives Klebeband in die Röhre ein, um anzuzeigen, dass die Probe und das Rohr jetzt radioaktiv sind. Legen Sie das Rohr in einen 37 Grad Celsius Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie für eine Stunde, das Rohr alle 15 bis 20 Minuten zu flicken.

Während die Zielzellen etikettiert werden, bereiten Sie eine einzelzellige Suspension von Effektorzellen vor. In diesem Beispiel wurden menschliche periphere Mono-Kernzellen oder PDMCs aus Vollblut durch Standarddichtegradientzentrifugation bis zu einer Konzentration von 5 mal 10 bis 6 isoliert. Übertragen Sie diese Effektorzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir und fügen Sie dann 200 Mikroliter dieser Suspension in jede Bohrung der Reihe B in einer 96-well-Rundbodenplatte ein. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter RPMI zu jedem Brunnen in Reihe C bis G der Platte hinzu.

Beginnen Sie nun mit der Durchführung serieller Verdünnungen der PBMCs, um einen Bereich von Effektorzellennummern zu erhalten, indem Sie zuerst 100 Mikroliter der Zellen in den Brunnen in Zeile B entfernen und diese zu Zeile C hinzufügen. Verdünnen Sie dann die Effektorzellen weiter, indem Sie 100 Mikroliter Zellen von Zeile C in Zeile D übertragen. Sobald Zeile G erreicht ist, bewegen Sie 100 Mikroliter aus den Brunnen, um ein endgültiges Volumen von 100 Mikrolitern in jedem Brunnen in dieser Reihe zu hinterlassen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Gewebekulturmedium zu den Brunnen in Reihe A hinzu, um als Kontrolle für die spontane Freisetzung von Chrom 51 aus den Zielzellen zu dienen, da dieser Zeile keine Effektorzellen hinzugefügt werden sollten. Legen Sie dann eine Platte in einen 37 Grad Celsius Inkubator, bis die Zielzellen bereit sind, hinzugefügt zu werden.

Nach der Inkubationszeit entfernen Sie die Zielzellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit 5 MilliliterFBS, um überschüssiges Chrom 51 zu entfernen. Legen Sie dann das Rohr in eine bestimmte Zentrifuge und drehen Sie bei 1200 U/min für 5 Minuten. Entfernen Sie die radioaktive FBS-Waschanlage in einen geeigneten Abfallbehälter und wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in einem frischen 5 Milliliter FBS wieder aufhängen. Legen Sie das Rohr in eine bestimmte Zentrifuge und drehen Sie die Zellen wieder bei 1200 U/min für 5 Minuten. Entfernen Sie die zweite Wäsche und überprüfen Sie das Pellet auf eingebaute Radioaktivität mit einem Geigerzähler. Schließlich das Pellet in 10 Milliliter n komplettem Medium aussetzen und das Chrom 51 mit Zielzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir gießen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter dieser beschrifteten Zielzellen zu jedem Brunnen der 96-Well-Effektor-Zellplatte hinzu. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter von 1% NP-40 in Wasser zu den Brunnen in Reihe H hinzu, um alle Zielzellen in dieser Zeile zu lysieren. Diese Brunnen werden als Steuerung verwendet, um die Gesamtzahlprominute oder cpm zu bestimmen.

Nun, da die Platte vorbereitet ist, sichern Sie den Deckel, indem Sie ein kleines Stück Klebeband auf jeder Seite der Platte hinzufügen und legen Sie ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel, um anzuzeigen, dass es Chrom 51 enthält. Legen Sie die Platte dann in eine Zentrifuge, die für den Umgang mit radioaktiven Proben markiert ist. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu. Stellen Sie die Zentrifuge auf 1200 U/min und bringen Sie die Platte auf Denspeed. Sobald Die Geschwindigkeit, stoppen Sie die Maschine. Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge. Legen Sie die Platte dann in einen 37 Grad Celsius Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über die Platte für zusätzliche Sicherheit. 16 Stunden lang inkubieren, damit die Zielzellen lysieren können.

Am Ende der Inkubationszeit entfernen Sie vorsichtig das Band um den Rand der Platte, und entfernen Sie den Deckel. Als nächstes legen Sie den Ernterahmen auf die Platte, um sicherzustellen, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Baumwollstecker vorhanden sind. Nun drücken Sie langsam und sanft die Baumwollstopfen in die Brunnen. Nach etwa zehn Sekunden den Druck auf die Baumwollstecker loslassen und dann die Baumwollstecker auf Rohrstreifen übertragen. Legen Sie jedes dieser Rohre in ein sekundäres FACS-Rohr. Schließlich laden Sie die FACS-Röhren auf einen Gammazähler und führen Sie die Proben aus, um die in jedem Zustand freigesetzte Chrommenge 51 zu quantifizieren. Zeichnen Sie sorgfältig die Reihenfolge auf, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden.

Hier wurden zu den ersten 3 Bahnen und CPG-stimulierte PMBCs zu den Bahnen 4 bis 6 hinzugefügt. In diesem Beispiel wurden die Zahlen pro Minute in die Zellen einer Kalkulationstabelle eingegeben, wie die Proben in der originalen Platte angeordnet waren und die Mittelwerte der Triplicate berechnet wurden. Für die erste Bedingung wurden beispielsweise die Zellen A1, A2 und A3 in Zelle I3 gemittelt. Sobald die Durchschnittswerte ermittelt wurden, kann der Prozentsatz der spezifischen Lyse für jede Bedingung mit dieser Formel berechnet werden. Um beispielsweise die prozentuale spezifische Lyse für die nicht stimulierten Zellen zu berechnen, die ein Verhältnis von 50 zu 1 Effektorzellen zu Zielzellen hatten, wurde das spontane CPM, das in diesem Beispiel 1164,67 beträgt, vom experimentellen CPM 1129 subtrahiert. 67. Diese Zahl kann dann durch die Differenz zwischen dem maximalen CPM und dem spontanen CPM dividiert und dann mit 100 multipliziert werden, um die prozentuale spezifische Lyse zu geben. Diese wird dann für jede Bedingung berechnet. Diese Daten können dann grafisch dargestellt werden, um einen Vergleich des E-T-Verhältnisses mit der prozentspezifischen Lyse sowohl für die nicht stimulierten PBMCs als auch für die VON CPG stimulierten PBMCs zu zeigen. In diesem Beispiel stimulierten Effektorzellen mit CPG effektiver abgetötete Zielzellen, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde bei den nicht stimulierten PBMCs nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CPG-Stimulation für den beobachteten Anstieg der Zielzelllyse notwendig ist.