Assay für Zelltod: Chrom Release Assay der zytotoxischen Fähigkeit

In diesem Video sehen Sie, wie Sie den Chrom-Release-Assay durchführen und das zytotoxische Potenzial der Effektorzellen bestimmen.

Immunzellen sind dafür verantwortlich, potenziell schädliche Zellen wie Krebs oder virusinfizierte Zellen aus dem Körper zu identifizieren und zu entfernen, was ein integraler Bestandteil der Immunantwort ist. Mehrere Immunzellen, wie T-Zellen und NK-Zellen, besitzen eine Eigenschaft, die als zytotoxisches Potenzial bekannt ist, nämlich die Fähigkeit, Zielzellen zu identifizieren und Proteine zu sezernieren, die den Proteinabbau, die Lyse und den Tod dieser Zielzellen induzieren. Die Quantifizierung des zytotoxischen Potenzials ist entscheidend für die Messung der Aktivierung und Potenz von Immunzellen, und der Chromfreisetzungsassay wird zu diesem Zweck häufig verwendet.

Diese Methode ermöglicht es den Anwendern, die durch bestimmte Arten von Immunzellen induzierte Zytoxizität unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, was für die Untersuchung der Krebsimmuntherapie und immunitätsbedingter Krankheiten wertvoll ist. Zu Beginn werden die Zielzellen, wie Krebszellen, mit einem radioaktiven Isotop, Chrom 51, inkubiert, das von den Zellen aufgenommen wird. Als nächstes werden diese radioaktiv markierten Zellen mit den isolierten Immunzellen von Interesse, auch Effektorzellen genannt, in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden kokultiviert, um die Interaktion zwischen den beiden Zelltypen zu erleichtern.

Der Gesamtaufbau des Assays umfasst die Inkubation einer bestimmten Anzahl von Zielzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Immunzellen sowie geeignete Kontrollen. Die Co-Kultur ermöglicht es den Effektorzellen, Apoptose und Lyse in den Zielzellen zu induzieren, was zur Freisetzung des intrazellulären Chromiums 51 in den Überstand führt. Dann, zu einem voroptimierten Zeitpunkt, wird der Überstand mit dem freigesetzten Chrom aus allen Bohrlöchern geerntet. Da das Chrom 51 radioaktiv ist, zerfällt es spontan radioaktiv und emittiert Gammastrahlung. Die Gammastrahlung in den Überständen aus allen Vertiefungen in der Assay-Platte stellt eine quantifizierbare Ausgabe der Lyse der Zielzellen dar. Dies wird mit einem Gamma-Zähler gemessen, mit dem dann das zytotoxische Potenzial der Immunzellen bestimmt wird.

Zu Beginn werden die Zielzellen, in diesem Beispiel die humane Melanomzelllinie WM793, in einer Einzelzellsuspension präpariert. Dazu wird zunächst das Medium aus dem Gewebekulturkolben entnommen und die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS gewaschen. Dekantieren Sie das PBS und geben Sie dann einen Milliliter Trypsin für etwa zwei Minuten auf den Teller. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen, und geben Sie dann fünf Milliliter RPMI-Medium in den Kolben. Pipettieren Sie das Medium auf und ab, um die Zellen zu sammeln, und geben Sie diese Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Legen Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei 1200 U/min in die Zentrifuge. Entfernen Sie anschließend das Medium aus dem Rohr und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu beschädigen. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Boden des Rohrs, um das Zellpellet aufzubrechen, und geben Sie 10 Milliliter Medium in das Rohr. Pipettieren Sie das Medium dann vorsichtig auf und ab, um die Zellen in Suspension zu bringen. Bestimmen Sie anschließend die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und überführen Sie zwei Milliliter der ursprünglichen Zellsuspension in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 120 U/min. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren das überschüssige Medium aus dem Röhrchen in einen Abfallbehälter. Wirbeln Sie das Röhrchen kurz durch, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückbleibenden Mediums wieder zu resuspendieren.

Bereiten Sie sich als Nächstes auf die Verwendung von Chromium 51 vor, indem Sie in einen Laborraum umziehen, der für diese spezielle Radioaktivität vorgesehen ist. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des Chromiums 51 bei allen Schritten sowie eine angemessene Beschilderung vorhanden sein, die darauf hinweist, wo Proben mit Chrom 51 aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist ebenfalls notwendig, um im Raum für eine mögliche Kontamination zu dienen.

Sobald die Radioaktivität für die richtige Verwendung eingerichtet ist, fügen Sie 100 Mikrocurie Chrom 51 direkt zur Zielzellsuspension hinzu. Fügen Sie dann ein kleines Stück radioaktives Klebeband auf das Röhrchen hinzu, um anzuzeigen, dass die Probe und das Röhrchen jetzt radioaktiv sind. Legen Sie das Röhrchen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie es eine Stunde lang, wobei Sie das Röhrchen alle 15 bis 20 Minuten schnippen.

Während die Zielzellen markieren, bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von Effektorzellen vor. In diesem Beispiel wurden mononukleäre Zellen (PDMCs) des menschlichen peripheren Blutes durch Standard-Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut auf eine Konzentration von 5 mal 10 bis 6 isoliert. Übertragen Sie diese Effektorzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir und fügen Sie dann 200 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung von Reihe B in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden hinzu. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter RPMI in jede Vertiefung in den Reihen C bis G der Platte.

Beginnen Sie nun mit der Durchführung von seriellen Verdünnungen der PBMCs, um eine Reihe von Effektorzellzahlen zu erhalten, indem Sie zuerst 100 Mikroliter der Zellen in den Vertiefungen in Reihe B entfernen und diese zu Reihe C hinzufügen. Verdünnen Sie dann die Effektorzellen weiter, indem Sie 100 Mikroliter Zellen von Reihe C in Reihe D übertragen. Setzen Sie die serielle Verdünnung fort. Sobald Reihe G erreicht ist, bewegen Sie 100 Mikroliter aus den Vertiefungen, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern in jeder Vertiefung in dieser Reihe zu belassen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Gewebekulturmedium in die Vertiefungen in Reihe A, um die spontane Freisetzung von Chrom 51 aus den Zielzellen zu kontrollieren, da dieser Reihe keine Effektorzellen hinzugefügt werden sollten. Legen Sie dann eine Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, bis die Zielzellen zum Hinzufügen bereit sind.

Nach der Inkubationszeit nehmen Sie die Zielzellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit 5 Millilitern FBS, um überschüssiges Chrom 51 zu entfernen. Legen Sie dann das Röhrchen in eine dafür vorgesehene Zentrifuge und drehen Sie es 5 Minuten lang bei 1200 U/min. Entnehmen Sie die radioaktive FBS-Wäsche in einen geeigneten Abfallbehälter und wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in frischen 5 Millilitern FBS resuspendieren. Stellen Sie das Röhrchen in eine dafür vorgesehene Zentrifuge und drehen Sie die Zellen erneut bei 1200 U/min für 5 Minuten. Entfernen Sie die zweite Wäsche und überprüfen Sie das Pellet mit einem Geigerzähler auf eingeschlossene Radioaktivität. Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern vollständigem Medium und gießen Sie die mit Chrom 51 markierte Zielzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir. Geben Sie dann 100 Mikroliter dieser markierten Zielzellen in jede Vertiefung der 96-Well-Effektorzellplatte. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter 1% NP-40 in Wasser in die Vertiefungen in Reihe H, um alle Zielzellen in jeder Reihe zu lysieren. Diese Wells werden als Kontrolle verwendet, um die Gesamtanzahl pro Minute (cpm) zu bestimmen.

Nun, da die Platte vorbereitet ist, sichern Sie den Deckel, indem Sie ein kleines Stück Klebeband an jeder Seite der Platte anbringen und ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel legen, um anzuzeigen, dass er Chrom 51 enthält. Legen Sie dann die Platte in eine Zentrifuge, die für die Handhabung radioaktiver Proben gekennzeichnet ist. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu. Stellen Sie die Zentrifuge auf 1200 U/min ein und bringen Sie die Platte auf Geschwindigkeit. Sobald Sie die Geschwindigkeit erreicht haben, stoppen Sie die Maschine. Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge. Legen Sie dann die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über der Platte, um zusätzliche Sicherheit zu gewährleisten. Inkubieren Sie 16 Stunden lang, damit die Zielzellen lysieren können.

Entfernen Sie am Ende der Inkubationszeit vorsichtig das Klebeband um den Rand der Platte und entfernen Sie den Deckel. Platzieren Sie als Nächstes den Ernterahmen auf der Platte und vergewissern Sie sich, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Wattestopfen angebracht sind. Drücken Sie nun die Wattestopfen langsam und vorsichtig in die Vertiefungen. Lassen Sie nach etwa zehn Sekunden den Druck auf die Wattestopfen ab und übertragen Sie die Wattestopfen dann auf Schlauchstreifen. Setzen Sie jedes dieser Röhrchen in ein sekundäres FACS-Röhrchen ein. Laden Sie abschließend die FACS-Röhrchen auf einen Gamma-Zähler und lassen Sie die Proben laufen, um die Menge an Chrom 51 zu quantifizieren, die unter jeder Bedingung freigesetzt wird. Notieren Sie sorgfältig die Reihenfolge, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden.

Hier wurden den ersten 3 Lanes unstimulierte PBMCs und den Lanes 4 bis 6 CPG-stimulierte PMBCs hinzugefügt. In diesem Beispiel wurden die Zählungen pro Minute auf die gleiche Weise in die Zellen einer Tabelle eingegeben, wie die Stichproben in der ursprünglichen Platte angeordnet wurden, und die Durchschnittswerte der Triplikate wurden berechnet. Für die erste Bedingung wurden z. B. die Zellen A1, A2 und A3 in Zelle I3 gemittelt. Sobald die Durchschnittswerte bestimmt sind, kann der Prozentsatz der spezifischen Lyse für jede Bedingung mit dieser Formel berechnet werden. Um beispielsweise die prozentuale spezifische Lyse für die nicht stimulierten Zellen zu berechnen, die ein Verhältnis von 50 zu 1 Effektorzellen zu Zielzellen aufwiesen, wurde die spontane CPM, die in diesem Beispiel 1164,67 beträgt, von der experimentellen CPM 1129 subtrahiert. 67. Diese Zahl kann dann durch die Differenz zwischen dem maximalen CPM und dem spontanen CPM dividiert und dann mit 100 multipliziert werden, um die prozentuale spezifische Lyse zu erhalten. Diese wird dann für jede Bedingung berechnet. Diese Daten können dann grafisch dargestellt werden, um einen Vergleich des E-zu-T-Verhältnisses mit der prozentualen spezifischen Lyse sowohl für die unstimulierten PBMCs als auch für die CPG-stimulierten PBMCs zu zeigen. In diesem Beispiel töteten Effektorzellen, die mit CPG stimuliert wurden, Zielzellen effektiver ab, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde bei den nicht stimulierten PBMCs nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CPG-Stimulation für die beobachtete Zunahme der Zielzelllyse notwendig ist.