Assay für Zelltod: Chrom Release Assay der zytotoxischen Fähigkeit

Prozessübersicht

Der typische ⁵¹Cr-Release-Assay zur Messung des Zelltodes umfasst folgende Schritte:

1. Zunächst werden die Zielzellen mit Na₂[⁵¹Cr]O₄beschriftet. Dies unterscheidet sie von den Effektorzellen im Assay.
2. Während die Zielzellen etikettiert werden, werden die Effektorzellen gesammelt und mit der seriellen Verdünnungstechnik wird eine abnehmende Titration der Effektorzellen in einer runden unteren 96-Well-Assay-Platte erzeugt.
3. Am Ende der Zielzellkennzeichnung werden die Zellen zuerst gewaschen und dann eine feste Anzahl von Zellen der Assayplatte hinzugefügt, die bereits eine Reihe von Verdünnungen von Effektorzellen enthält.
4. Als Nächstes wird der Zellmix des Zieleffektors für einen definierten Zeitraum inkubiert, um eine ausreichende Zellinteraktion mit den Zielzellen zu ermöglichen, um die Zelllyse zu mediat.
5. Schließlich werden die Kulturüberstande geerntet und in Röhren gesammelt. Der 51-Cr-Betrag wird mit einem Gammazähler quantifiziert.
6. Am Ende werden die Daten gesammelt und verwendet, um die "prozentuale spezifische Zelllyse" der Zielzellen zu berechnen.

1. Kennzeichnung von Zielzellen mit ⁵¹Cr

1. Zunächst bereiten Sie die Zielzellen (hier- menschliche Melanom-Zelllinie WM793) zu einer einzelzelligen Suspension vor.
2. Entfernen Sie dazu zunächst die Medien aus dem Gewebekulturkolben.
3. Dann waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1X PBS.
4. Versuchen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Trypsin für 2 min auf die Platte legen.
5. Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.
6. Fügen Sie dem Kolben 5 ml RPMI-Medien hinzu und pipen sie das Medium nach oben und unten, um die Zellen zu lösen.
7. Sammeln Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und zentrieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 1200 U/min. Dekant den Überstand.
8. Fügen Sie 10 ml Medien in das Pellet und sanft Pipetten sie die Medien nach oben und unten, um die Zellen in Suspension zu bringen.
9. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer.
10. Übertragen Sie 1x10⁶ Zellen in ein neues 15 ml konisches Rohr.
11. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 1200 U/min und dekanieren Sie den Überstand.
12. Kurz wirbeln Sie das Rohr, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückgelassenen Mediums wieder aufzuhängen.
13. Fügen Sie der WM793-Zielzellsuspension 100 CIs von ⁵¹Cr direkt hinzu.
    Hinweis: Für die jeweilige Radioaktivität sollte ein spezieller Laborraum eingerichtet werden. Darüber hinaus sollte es eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des ⁵¹Cr während aller Schritte sowie eine ordnungsgemäße Beschilderung geben, um anzugeben, wo Proben mit ⁵¹Cr aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist ebenfalls notwendig, um den Raum für eine mögliche Kontamination zu vermessen.
14. Fügen Sie ein kleines Stück radioaktives Klebeband in die Röhre, um anzuzeigen, dass die Röhre jetzt radioaktiv ist.
15. Legen Sie das Rohr in einen 37°C Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie 1 h. Streichen Sie das Rohr alle 15-20 Minuten, um die Aufnahme der Zielzelle des Chroms zu erhöhen.
16. Waschen Sie nach der Inkubationszeit die Zielzellen mit 5 ml FBS, um überschüssige ⁵¹Cr zu entfernen.
17. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 U/min für 5 min. Decant radioaktive FBS waschen in entsprechenden Abfallbehälter.
18. Das Pellet wieder aufhängen und ein zweites Mal mit FBS waschen. Überprüfen Sie das Pellet auf eingebaute Radioaktivität mit einem Geigerzähler.
19. Setzen Sie das Pellet in 10 ml komplettem Medium wieder auf und erreichen Sie eine Zellkonzentration von 10⁵ Zellen/ml.
    Hinweis: Der Zellzählschritt nach der ⁵¹Cr-Kennzeichnung wird hier weitgehend aus Sicherheitsgründen weggelassen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die WM793-Zellkonzentration mit der vor der ⁵¹Cr-Kennzeichnung identisch war.

2. Vorbereiten von Effektorzellen

1. Es können verschiedene Effektorzellen verwendet werden, z. B. menschliche oder Maus-T-Zellen und NK-Zellen. In diesem Beispiel wurden PBMCs verwendet, die durch Standarddichtegradientenzentrifugation (bis zu einer Konzentration von 5x10⁶) aus Vollblut isoliert wurden.
2. Zunächst fügen Sie jedem Brunnen einer der Reihen (hier Reihe A, siehe Tabelle 1) einer 96-well-Rundbodenplatte 100 L Gewebekulturmedium hinzu. Hier werden keine Effektorzellen hinzugefügt, und sie dienen als "Leer" zur Bestimmung der "minimalen/spontanen ⁵¹Cr-Freisetzung" aus den Zielzellen.

Tabelle 1: ⁵¹Cr Release Assay Layout: Reihe A- Zielzellen (10⁴ Zellen / 100 l) nur mit Medien inkubiert (erzeugt 'leer' zur Bestimmung der "minimum/spontan ⁵¹Cr Release"). Zeilen B bis C- Brunnen mit unterschiedlichen Effektor: Zielzellen (E:T)-Verhältnisse, die von 50:1 bis 1,5:1 reichen. Zeile H- Zielzellen (10⁴ Zellen/100 l) inkubiert mit 1% NP-40 (NP-40 lyses die Zielzellen, erzeugung "maximale oder insgesamt ⁵¹Cr Freisetzung"). Jedes E:T-Verhältnis wird in dreifacher Auslage für jeden Versuchszustand getestet. Spalte 1-3- unstimulierte PBMCs und Spalte 4-6- CpG-stimulierte PBMCs.

3. Als nächstes erzeugen Sie eine 2-fache serielle Zellverdünnung der PBMCs (in Dreifacharbeit für jede Versuchsbedingung), um eine Effektorzellkonzentration von 5x10⁵ bis 15.625 Zellen/100 l Medien zu erhalten (hier Zeilen B bis G).
   Hinweis: In diesem Beispiel ist das Anfangseffektor: Zielzelle (E: T) Verhältnis ist 50:1. Dieses Verhältnis kann jedoch je nach experimentellen Besonderheiten angepasst werden.
4. Lassen Sie die letzte Zeile leer (hier Zeile H), indem Sie diesen Brunnen keine Effektorzellen hinzufügen. (Diese Zeile wird verwendet, um die "Gesamtanzahl/min oder (ca. p. m)" oder die "maximale ⁵¹Cr-Version") zu generieren.
5. Legen Sie die Platte in den 37°C-Inkubator, bis die Zielzellen bereit sind, hinzugefügt zu werden.

3. Hinzufügen von ⁵¹Cr beschrifteten WM793-Zielzellen zum Assay

1. Nach der Inkubationszeit die Zielzellen aus dem Inkubator entfernen und mit 5 ml FBS waschen, um überschüssige ⁵¹Cr zu entfernen.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 U/min für 5 min, mit einer bestimmten Zentrifuge.
3. Entfernen Sie die FBS-Waschanlage (radioaktiver Überstand) in einen geeigneten Abfallbehälter.
4. Wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in einem frischen 5 ml FBS wieder aufhängen.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 1200 U/min für 5 min.
6. Schließlich das Pellet in 10 ml des kompletten Mediums wieder aussetzen.
7. Gießen Sie die ⁵¹Cr-markierte WM793-Zellsuspension (10⁵ Zellen/ml) in ein Einweg-Reagenzreservoir.
8. Fügen Sie dann 100 l dieser beschrifteten Zielzellen zu jedem Brunnen der 96-Well-Effektor-Zellplatte hinzu, wobei eine Mehrkanalpipette verwendet wird.
9. Als Nächstes fügen Sie 100 L von 1% NP-40 (in Wasser) in die Reihe der Brunnen, die frei von Effektorzellen sind (hier Zeile H). 1% NP-40 wird die Zielzellen lysieren, und somit dienen diese Brunnen als Kontrollen, um die "Gesamtanzahl/min, oder (c. p. m)" oder die maximale ⁵¹Cr-Freisetzung zu bestimmen.
10. Befestigen Sie deckel auf Platte, indem Sie ein kleines Stück gasdurchlässiges Klebeband auf jeder Seite der Platte hinzufügen und legen Sie ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel, um anzuzeigen, dass es ⁵¹Cr enthält.
11. Kurz gesagt, zentrieren Sie die Platte bei 1200 U/min. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu.
    Hinweis: Es ist wichtig, eine Zentrifuge zu verwenden, die für den Umgang mit radioaktiven Proben markiert ist.
12. Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge.
13. Legen Sie die Platte in einen 37°C Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über die Platte für zusätzliche Sicherheit. Inkubieren Sie für 16 h, um eine Zielzelllyse zu ermöglichen.
    Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach verwendeten Effektorzellen und möglichem Tötungsmechanismus zwischen 4 und 18 h variieren.

4. Ernte der Übertreibungen

1. Am Ende der Inkubationszeit entfernen Sie vorsichtig das Band um den Rand der Platte und entfernen Sie den Deckel.
2. Als nächstes legen Sie den Ernterahmen auf die Platte, um sicherzustellen, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Baumwollstecker vorhanden sind. Dadurch wird die Sammlung eines zellfreien Überstandes sichergestellt.
3. Nun drücken Sie langsam und sanft die Baumwollstopfen in die Brunnen.
4. Nach ca. 10 Sekunden den Druck auf die Baumwollstecker loslassen und dann die Baumwollstecker auf Rohrstreifen übertragen.
5. Legen Sie jedes dieser Rohre in ein sekundäres FACS-Rohr.
6. Schließlich laden Sie FACS-Röhren auf den Gammazähler und führen Sie die Proben aus, um die Menge von ⁵¹Cr zu quantifizieren, die in jedem Zustand freigesetzt wird. Die Proben werden in der Regel 1 Minute lang gemessen, was eine einfache Bestimmung der "Zählungen/Minute" ermöglicht.
7. Zeichnen Sie sorgfältig die Reihenfolge auf, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden.

5. Datenanalyse

1. Hier wurden den ersten drei Spalten unstimulierte PBMCs hinzugefügt und cpG-stimulierte PBMCs (CpG ODN, (1 g/ml) für 24 h) zu den Spalten 4-6 hinzugefügt. Siehe Tabelle 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
pro	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
c	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
f	1579	1472	1483	2028	1779	1769
g	1326	1325	1184	1801	1654	1565
h	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Ⅰ	Durchschnitt von A1,A2,A3 ->		1164.67	Spontanc.p.m		1058.33
J	Durchschnitt von B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
kb	Durchschnitt von C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
l	Durchschnitt d1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
m	Durchschnitt von E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Durchschnitt von F1,F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Durchschnitt von G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
seiten	Durchschnitt h1,H2,H3 ->		8884.67	Maximal c.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-Stim PBMC	E:T-Verhältnis

Tabelle 2: ⁵¹Cr-Release-Assay-Daten: Datenwerte "Anzahl pro Minute" / "c. p. m", durchschnitts c. p. m-Werte und berechnete prozentspezifische Lysewerte.

2. Die gesammelten Daten (Anzahl pro Minute, d.h. c.p.m) wurden in die Zellen einer Kalkulationstabelle in der gleichen Weise eingegeben, wie die Proben in der Originalplatte angeordnet waren.
3. Zunächst wurden die Durchschnittswerte der Triplicate berechnet. Tabelle 2 - Zellen I3 bis P3, für nicht stimulierte PBMCs und Zellen I6 bis P6, für CpG-stimulierte PBMCs.
4. Nach der Ermitteltur der Durchschnittswerte wurde der prozentuale Anteil der spezifischen Lyse für jede Bedingung anhand der folgenden Formeln
   
   
5. Der Prozentuale Anteil der spezifischen Lyse wurde für jede Bedingung berechnet (Tabelle 2 - Zellen J4 bis O4, für nicht stimulierte PBMCs und J7 bis O7, für nicht stimulierte PBMCs).