Mikroskopie und Färbungen: Gram-, Kapsel- und Endosporenfärbung

Bakterien sind mikroskopisch kleine lebende Organismen, die viele Unterscheidungsmerkmale aufweisen, wie z. B. Form, Anordnung der Zellen, ob sie Kapseln produzieren oder nicht und ob sie Sporen bilden. Diese Merkmale können alle durch Färben sichtbar gemacht werden und helfen bei der Identifizierung und Klassifizierung verschiedener Bakterienarten.

Um die ersten beiden Merkmale der Zellform und -anordnung zu untersuchen, können wir eine einfache Technik namens Gram-Färbung verwenden. Hier wird Kristallviolett auf Bakterien aufgetragen, die auf einem Objektträger heiß fixiert wurden. Als nächstes wird dem Objektträger die Gram-Jodlösung zugesetzt, was zur Bildung eines unlöslichen Komplexes zwischen dem Kristallviolett und der Gram-Jodlösung führt. Dann wird ein Entfärber aufgetragen und alle Bakterien mit einer dicken Peptidoglykanschicht färben sich violett, da diese Schicht nicht leicht vom Entfärber durchdrungen werden kann. Diese Bakterien werden als grampositiv bezeichnet.

Gramnegative Bakterien haben eine dünnere Peptidoglykanschicht und entfärben den Entfärber, wodurch die violette Farbe verloren geht. Sie färben sich jedoch rötlich-rosa, wenn eine Safranin-Gegenfärbung hinzugefügt wird, die sich an eine Lipopolysaccharidschicht auf ihrer Außenseite bindet. Nach der Färbung können die Zellen auf Morphologie, Größe und Anordnung beobachtet werden, z. B. in Ketten oder Clustern, was bei der Klassifizierung und Identifizierung weiter hilft.

Eine weitere nützliche Technik im Werkzeugkasten des Mikrobiologen ist die Kapselfärbung, die verwendet wird, um externe Kapseln zu visualisieren, die bestimmte Arten von Bakterienzellen umgeben. Aufgrund der nichtionischen Zusammensetzung der Kapsel und der Tendenz, Flecken abzustoßen, funktionieren einfache Färbemethoden nicht. Stattdessen kommt eine Negativfärbetechnik zum Einsatz, bei der zunächst der Untergrund mit einem sauren Farbstoff, wie z.B. Kongorot, angefärbt wird, bevor die Bakterienzellen mit Kristallviolett angefärbt werden. Dadurch bleibt jede Kapsel als klarer Halo um die Zellen herum vorhanden.

Die letzte wichtige Färbetechnik, die hier behandelt wird, kann dabei helfen, festzustellen, ob die untersuchten Bakterien Sporen bilden. Unter widrigen Bedingungen produzieren einige Bakterien Endosporen, ruhende, zähe, nicht reproduktive Strukturen, deren Hauptfunktion darin besteht, das Überleben von Bakterien in Zeiten von Umweltstress wie extremen Temperaturen oder Dehydrierung zu sichern. Allerdings bilden nicht alle Bakterienarten Endosporen, und sie sind mit Standardtechniken schwer zu färben, da sie für viele Farbstoffe undurchlässig sind. Bei der Schaeffer-Fulton-Methode wird Malachitgrünfärbung verwendet, die auf die Bakterien aufgetragen wird, die an einem Objektträger befestigt sind. Der Objektträger wird dann mit Wasser gewaschen, bevor er mit Safranin gegengefärbt wird. Vegetative Zellen erscheinen rosa-rot, während alle vorhandenen Endosporen grün erscheinen. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie diese gängigen bakteriellen Färbetechniken durchführen und die Färbeproben anschließend mit der Lichtmikroskopie untersuchen.

Um mit dem Eingriff zu beginnen, binden Sie lange Haare zusammen und ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Laborkittels und Handschuhe.

Reinigen Sie dann einen frischen Objektträger mit einem Labortuch. Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung auf den ersten Objektträger. Verwenden Sie dann eine sterile Pipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte auszuwählen. Schmieren Sie die Bakterienkolonie in die Flüssigkeit, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erzeugen. Stellen Sie die Rutsche auf die Arbeitsplatte und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen.

Nach dem Trocknen zünden Sie einen Bunsenbrenner an, um die Bakterien zu fixieren. Führen Sie den Objektträger mit einer Zange mehrmals mit der Bakterienseite nach oben durch die Brennerflamme und achten Sie darauf, dass Sie den Objektträger nicht zu lange in der Flamme halten, da dies die Zellen verformen kann.

Halten Sie nun über dem Waschbecken die Schiene waagerecht und tragen Sie einige Tropfen Gram's Kristallviolett auf, um den Bakterienabstrich vollständig zu bedecken, und legen Sie dann die Schiene auf die Bank, um sie 45 Sekunden lang stehen zu lassen. Halten Sie dann den Objektträger schräg und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrahl auf die Oberseite des Objektträgers, wobei Sie darauf achten, dass der Bakterienabstrich nicht direkt spritzt. Halten Sie nun den Objektträger wieder waagerecht, tragen Sie die Jodlösung von Gram auf, um die gefärbten Bakterien vollständig zu bedecken, und lassen Sie sie dann weitere 45 Sekunden stehen. Spülen Sie anschließend vorsichtig das Jod von der Objektträger, wie zuvor gezeigt. Während Sie den Objektträger schräg halten, geben Sie ein paar Tropfen des Entfärbungsmittels von Gram auf den Objektträger, so dass er etwa 5 Sekunden lang über die gefärbten Bakterien ablaufen kann, bis der Abfluss klar ist. Sofort wie zuvor gezeigt mit Wasser abspülen. Dadurch wird eine übermäßige Entfärbung des Abstrichs begrenzt. Halten Sie dann den Objektträger wieder waagerecht und tragen Sie Gram's Safranin Gegenfärbung auf, um die verfärbten Bakterien vollständig zu bedecken. Spülen Sie das Safranin nach 45 Sekunden vorsichtig mit Wasser von der Folie ab, wie zuvor gezeigt, und tupfen Sie es dann mit Küchenpapier trocken.

Geben Sie zum Schluss einen Tropfen Immersionsöl direkt auf den Objektträger und untersuchen Sie den Objektträger dann mit einem Lichtmikroskop mit einer 100-fachen Ölobjektivlinse.

Um mit diesem Färbeprotokoll zu beginnen, ziehen Sie zunächst die richtige persönliche Schutzausrüstung an und stellen Sie dann sicher, dass die zu verwendenden Objektträger sauber sind.

Bereiten Sie als Nächstes die Lösungen vor. Um eine 1%ige Kristallviolettlösung herzustellen, mischen Sie 0,25 Gramm Kristallviolettpulver mit 25 Millilitern destilliertem Wasser und wirbeln Sie es auf, bis es sich aufgelöst hat. Bereiten Sie dann 1% ige kongorote Lösung vor, indem Sie 0,25 Gramm kongorotes Pulver mit 25 Millilitern destilliertem Wasser mischen und vortexen, bis es sich aufgelöst hat. Pipettieren Sie nun 10 Mikroliter der Kongoroten Lösung auf den Objektträger. Wählen Sie mit einer sauberen, sterilen Pipettenspitze eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte aus. Schmieren Sie dann die Bakterienkolonie in den Farbstoff ein, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erzeugen. Trocknen Sie den Bakterienobjektträger 5-7 Minuten lang vollständig an der Luft. Sobald der Objektträger trocken ist, fluten Sie den Abstrich mit genügend 1 % Kristallviolett, um den Abstrich zu bedecken, und lassen Sie ihn 1 Minute lang einwirken. Halten Sie nun den Objektträger schräg und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrahl auf die Oberseite des Objektträgers, wobei Sie darauf achten, dass die Bakterien nicht direkt spritzen. Halten Sie den Objektträger weiter in einem 45-Grad-Winkel, bis er vollständig an der Luft getrocknet ist. Geben Sie zum Schluss einen Tropfen Immersionsöl direkt auf den Objektträger und untersuchen Sie den Objektträger dann mit einem Lichtmikroskop mit einem 100X-Ölobjektiv.

Um eine Endosporenfärbung durchzuführen, bereiten Sie zunächst eine 0,5%ige malachitgrüne Lösung vor, indem Sie 0 mischen. 125 Gramm Malachitgrünes Pulver mit 25 Millilitern destilliertem Wasser und dann die Lösung aufwirbeln, bis sie sich aufgelöst hat. Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter 1X PBS in die Mitte des Objektträgers. Verwenden Sie dann eine sterile Pipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte auszuwählen. Schmieren Sie die Bakterien in die Flüssigkeit, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erzeugen. Stellen Sie nun die Rutsche auf die Arbeitsplatte und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen zünden Sie einen Bunsenbrenner an, um die Bakterien zu fixieren. Führen Sie den Objektträger mehrmals mit der Bakterienseite nach oben durch die blaue Brennerflamme. Sobald der Objektträger abgekühlt ist, legen Sie ein Stück vorgestanztes Linsenpapier über den hitzefixierten Abstrich. Schalten Sie dann eine Kochplatte auf die höchste Stufe ein und bringen Sie einen Becher mit Wasser zum Kochen.

Tränken Sie das Linsenpapier mit der malachitgrünen Lösung und legen Sie den Objektträger mit einer Zange auf das Becherglas mit kochendem Wasser, um es 5 Minuten lang zu dämpfen. Halten Sie das Linsenpapier feucht, indem Sie je nach Bedarf mehr Farbe tropfenweise hinzufügen. Nehmen Sie dann wieder mit einer Zange den Objektträger aus dem Becherglas und entfernen Sie das Linsenpapier und entsorgen Sie es. Lassen Sie die Folie 2 Minuten abkühlen. Arbeiten Sie über dem Waschbecken, halten Sie die Rutsche schräg und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrahl auf die Oberseite der Rutsche. Halten Sie nun die Folie waagerecht und tragen Sie Safranin auf, um die Folie vollständig zu bedecken. Lassen Sie es dann 1 Minute stehen. Halten Sie anschließend den Objektträger schräg und spülen Sie wie zuvor gezeigt. Lassen Sie die Rutsche auf der Arbeitsplatte an der Luft trocknen. Geben Sie zum Schluss einen Tropfen Immersionsöl direkt auf den Objektträger und untersuchen Sie den Objektträger dann mit einem Lichtmikroskop mit einem 100X-Ölobjektiv.

Im Gram-Färbeprotokoll können zwei verschiedenfarbige Färbungen entstehen. Eine dunkelviolette Färbung zeigt an, dass die Bakterien grampositiv sind und dass sie die kristallviolette Färbung beibehalten haben. Im Gegensatz dazu ist die rötlich-rosa Färbung ein Merkmal von gramnegativen Bakterien, die stattdessen durch die Safranin-Gegenfärbung eingefärbt werden. Zusätzlich können verschiedene Formen und Anordnungen von Bakterien nach der Gram-Färbung sichtbar gemacht werden. So ist es beispielsweise möglich, Kokken oder runde Bakterien von stäbchenförmigen Bazillen zu unterscheiden oder Bakterien, die Stränge bilden, im Vergleich zu solchen, die typischerweise als Klumpen aggregiert oder einzeln auftreten, zu identifizieren.

In einem mit Kapseln gefärbten Mikroskopbild werden die Bakterienzellen in der Regel violett gefärbt, und der Hintergrund des Objektträgers sollte dunkel gefärbt sein. Vor diesem dunklen Hintergrund erscheinen die Kapseln der Bakterien, falls vorhanden, als klarer Halo um die Zellen.

Bei der Endosporenfärbung schließlich werden vegetative Zellen mit der Safranin-Gegenfärbung rot gefärbt. Wenn Endosporen in der Probe vorhanden sind, behalten diese den malachitgrünen Fleck bei und erscheinen bläulich-grün.