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Mikroskopie und Färbungen: Gram-, Kapsel- und Endosporenfärbung

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Microbiology

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Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

6.7: Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

6.9: Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

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11:33 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, und Victor J. DiRita¹
¹ Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Vereinigte Staaten von Amerika

Bakterien sind verschiedene Mikroorganismen, die fast überall auf der Erde vorkommen. Viele Eigenschaften helfen, sie voneinander zu unterscheiden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gram-Färbung Art, Form und Anordnung, Produktion von Kapsel, und Bildung von Sporen. Um diese Eigenschaften zu beobachten, kann man Lichtmikroskopie verwenden; Einige bakterielle Eigenschaften (z. B. Größe, fehlende Färbung und Brechungseigenschaften) machen es jedoch schwierig, Bakterien nur mit einem Lichtmikroskop zu unterscheiden (1, 2). Färben von Bakterien ist notwendig, wenn Bakterientypen mit Lichtmikroskopie unterschieden werden. Die beiden Haupttypen von Lichtmikroskopen sind einfach und zusammengesetzt. Der Hauptunterschied zwischen ihnen ist die Anzahl der Linsen, die verwendet werden, um das Objekt zu vergrößern. Einfache Mikroskope (z. B. eine Lupe) haben nur eine Linse, um ein Objekt zu vergrößern, während zusammengesetzte Mikroskope mehrere Linsen haben, um die Vergrößerung zu verbessern (Abbildung 1). Zusammengesetzte Mikroskope haben eine Objektivlinse in der Nähe des Objekts, die Licht sammelt, um ein Bild des Objekts zu erstellen. Dies wird dann durch das Okular (Augenlinse) vergrößert, das das Bild vergrößert. Die Kombination von Objektiv und Okular ermöglicht eine höhere Vergrößerung als die Verwendung einer einzigen Linse allein. In der Regel verfügen Verbundmikroskope über mehrere Objektivlinsen mit unterschiedlichen Leistungen, um eine unterschiedliche Vergrößerung zu ermöglichen (1, 2). Hier werden wir die Visualisierung von Bakterien mit Gramflecken, Kapselflecken und Endosporenflecken diskutieren.

Abbildung 1: Ein typisches Zusammengesetzten Mikroskop. Die wichtigsten Teile des Mikroskops sind beschriftet.

Der Gram-Fleck, der 1884 vom dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram (1) entwickelt wurde, unterscheidet Bakterien anhand der Zusammensetzung der Zellwand (1, 2, 3, 4). Kurz gesagt, wird ein bakterielles Abstrich auf einem Mikroskopschlitten platziert und dann wärmefixiert, um die Zellen am Dia zu haften und sie leichter zu akzeptieren, Flecken zu akzeptieren (1). Die wärmefeste Probe ist mit Crystal Violet gefärbt und verwandelt die Zellen violett. Die Rutsche wird mit einer Jodlösung gespült, die das Kristallviolett an der Zellwand fixiert, gefolgt von einem Decolorizer (ein Alkohol), um jedes nicht fixierte Kristallviolett wegzuwaschen. Im letzten Schritt wird ein Gegenfleck, Safranin, zu den Farbzellen rot hinzugefügt (Abbildung 2). Gram-positive Bakterien färben lila aufgrund der dicken Peptidoglykan-Schicht, die nicht leicht durch den Decolorizer durchdrungen wird; Gram-negative Bakterien, mit ihrer dünneren Peptidhundlykanschicht und höherem Lipidgehalt, destain mit dem Decolorizer und sind rot gefleckt, wenn Safranin hinzugefügt wird (Abbildung 3). Die Gramfärbung wird verwendet, um Zellen in zwei Typen (Gram-positiv und Gram-negativ) zu unterscheiden und ist auch nützlich, um Zellform (Kugeln oder Koks, Stäbe, gekrümmte Stäbe und Spiralen) und Anordnung (einzelne Zellen, Paare, Ketten, Gruppen und Cluster) zu unterscheiden (1, 3) .

Abbildung 2: Schematic des Gram Staining Protocol. Die linke Spalte zeigt, wie gramnegative Bakterien bei jedem Schritt des Protokolls reagieren. Die rechte Spalte zeigt, wie grampositive Bakterien reagieren. Gezeigt werden auch zwei typische bakterielle Zellformen: die Bazillen (oder Stäbe) und die Kokzien (oder Kugeln).

Abbildung 3: Gram Staining Ergebnisse. Ein Gram-Fleck einer Mischung aus Staphylococcus aureus (Gram-positive lila Kokzi) und Escherichia coli (Gram-negative rote Stäbe).

Einige Bakterien produzieren eine extrazelluläre viskose äußere Schicht, die als Kapsel bezeichnet wird (3, 5). Kapseln sind Schutzstrukturen mit verschiedenen Funktionen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Haftung an Oberflächen und anderen Bakterien, Schutz vor Austrocknung und Schutz vor Phagozytose. Kapseln bestehen in der Regel aus Polysacchariden, die mehr als 95% Wasser enthalten, aber einige können Polyalkohole und Polyame enthalten (5). Aufgrund ihrer meist nicht-ionischen Zusammensetzung und der Tendenz, Flecken abzustoßen, funktionieren einfache Färbemethoden nicht mit Kapsel; Stattdessen verwendet die Kapselfärbung eine negative Färbetechnik, die die Zellen und den Hintergrund färbt und die Kapsel als klaren Halo um die Zellen lässt (1, 3) (Abbildung 4). Kapselfärbung beinhaltet verschmieren eine bakterielle Probe in einen sauren Fleck auf einem Mikroskop-Dia. Im Gegensatz zur Gram-Färbung wird der bakterielle Abstrich während eines Kapselflecks nicht wärmefixiert. Wärmefixierung kann die Kapsel stören oder dehydrieren, was zu falschen Negativen führt (5). Darüber hinaus kann die Wärmefixierung Zellen schrumpfen, was zu einer Lichtung um die Zelle führt, die als Kapsel verwechselt werden kann, was zu falschen Positivmeldungen führt (3). Der saure Fleck färbt den Diahintergrund; Während nacheinem Grundfleck, Crystal Violet, die Bakterienzellen selbst färbt, so dass die Kapsel unbefleckt bleibt und als klarer Halo zwischen den Zellen und dem Diahintergrund erscheint (Abbildung 5). Traditionell wurde Indientinte als saurer Fleck verwendet, da diese Partikel nicht in die Kapsel eindringen können. Daher ist weder die Kapsel noch die Zelle durch Indische Tinte gefärbt; stattdessen ist der Hintergrund befleckt. Kongo Rot, Nigrosin oder Eosin kann anstelle von Indien Tinte verwendet werden. Kapselfärbung kann Ärzten helfen, bakterielle Infektionen zu diagnostizieren, wenn sie Kulturen aus Patientenproben betrachten und geeignete Patientenbehandlungen leiten. Häufige Krankheiten, die durch verkapselte Bakterien verursacht werden, sind Lungenentzündung, Meningitis und Salmonellose.

Abbildung 4: Schematic des Capsule Staining Protocol. Das obere Panel zeigt den Diaabstrich vor jeder Fleckenanwendung an. Die mittlere Tafel zeigt, wie die Rutsche und Bakterien nach dem primären Fleck, Congo Red, aussehen. Das letzte Panel zeigt, wie die Rutsche und Bakterien nach dem Gegenfleck Crystal Violet aussehen.

Abbildung 5: Capsule Staining Ergebnisse. Kapselfärbung von verkapselten Acinetobacter baumannii (mit schwarzen Pfeilen bezeichnet) und nicht verkapselter Escherichia coli (mit weißen Pfeilen bezeichnet). Beachten Sie, dass der Hintergrund dunkel ist und A. baumannii Zellen violett gefärbt sind. Die Kapsel um A. baumannii Zellen ist als Halo offensichtlich, während E. coli keinen Halo hat.

Unter widrigen Bedingungen (z. B. Nährstoffbegrenzung, extreme Temperaturen oder Dehydrierung) produzieren einige Bakterien Endosporen, metabolisch inaktive Strukturen, die gegen physikalische und chemische Schäden resistent sind (1, 2, 8, 9). Endosporen ermöglichen es dem Bakterium, harte Bedingungen zu überleben, indem es das genetische Material der Zellen schützt; sobald die Bedingungen für das Wachstum günstig sind, keimen Sporen, und das Bakterienwachstum setzt sich fort. Endosporen sind mit Standard-Färbetechniken schwer zu färben, da sie undurchlässig für Farbstoffe sind, die typischerweise für die Färbung verwendet werden (1, 9). Die Technik, die routinemäßig verwendet wird, um Endosporen zu färben, ist die Schaeffer-Fulton-Methode (Abbildung 6),die den primären Fleck Malachite Green verwendet, einen wasserlöslichen Fleck, der relativ schwach an zelluläres Material bindet, und Wärme, damit der Fleck brechen kann. durch den Kortex der Sporen (Abbildung 7). Diese Schritte färben die wachsenden Zellen (im Kontext der Endosporenbiologie als vegetative Zellen bezeichnet) sowie Endosporen und freie Sporen (die nicht mehr innerhalb der früheren Zellhülle). Vegetative Zellen werden mit Wasser gewaschen, um Malachitgrün zu entfernen; Endosporen behalten den Fleck durch Erhitzen der Malachitgrün innerhalb der Sporen. Schließlich werden die vegetativen Zellen mit Safranin konterkariert, um sie zu visualisieren (Abbildung 8). Die Färbung von Endosporen hilft, Bakterien in Sporenformer und Nicht-Sporen-Former zu differenzieren, und bestimmt, ob Sporen in einer Probe vorhanden sind, die, wenn vorhanden, bei der Keimung zu einer bakteriellen Kontamination führen könnte.

Abbildung 6: Schematic des Endospore Staining Protocol. Die linke Spalte zeigt, wie sporenbildende Bakterien bei jedem Schritt des Protokolls reagieren. Die rechte Spalte zeigt, wie nicht sporenbildende Bakterien reagieren.

Abbildung 7: Diagramm der Endosporenstruktur. Bakterielle Zelle, die eine Endospore mit den verschiedenen Sporenstrukturen enthält.

Abbildung 8: Endospore Färbung Ergebnisse. Eine typische Färbung von Endosporen von Bacillus subtilis. Die vegetativen Zellen (mit den weißen Pfeilen bezeichnet) sind rot gefärbt, während die Endosporen (mit den schwarzen Pfeilen bezeichnet) grün gebeizt sind.

Procedure

1. Gram Färbung

gliederung
1. Tragen Sie Handschuhe und einen nicht brennbaren Labormantel, da Farbstoffe Hände und Kleidung färben.
2. Ein Bunsenbrenner wird verwendet, um die Bakterien zu erwärmen. Achten Sie beim Arbeiten mit Flammen auf; binden Sie lange Haare zurück.
3. Es werden handelsübliche Gram-Farbstoffreagenzien verwendet.
4. Reinigen Sie Mikroskopschlitten mit Labortüchern.
protokoll
1. Pipetten Sie 10 L Phosphat gepufferte Koch- oder Kulturbrühe auf Demrutschen.
2. Schmieren Sie eine Bakterienkolonie in die Flüssigkeit, um eine dünne gleichmäßige Schicht zu produzieren.
  Hinweis: Verwenden Sie keine Kulturen, die älter als 24 Stunden sind, da zu alte Bakterien Veränderungen in ihrer Zellwand haben könnten, die die Gram-Fleckenergebnisse beeinflussen (1, 4).
3. Vollständig lufttrockene Rutsche.
4. Einmal getrocknet, wärmefixBakterien durch vorbei gleiten durch die Flamme (Bakterien Seite nach oben) 4-5 mal.
  Hinweis: Halten Sie die Folie nicht zu lange in der Flamme oder Sie können die Bakterienzellen verzerren (1).
5. Arbeiten über das Waschbecken, halten Sie die Rutschebene und verwenden Grams Crystal Violet, um die wärmefesten Bakterien vollständig zu decken, lassen Sie 45 Sekunden stehen.
6. Spülen Sie überschüssiges Crystal Violet, indem Sie die Rutsche in einem Winkel halten und einen sanften, indirekten Wasserstrom auf die Rutsche spritzen und sie über die gefärbten Bakterien herunterlaufen lassen. Spritzen Sie wasser nicht direkt auf die Bakterien.
7. Halten Sie wieder Rutschebene, tragen Sie Grams Jodlösung auf, um die gefärbten Bakterien vollständig zu bedecken, lassen Sie 45 Sekunden stehen.
8. Spülen Sie überschüssiges Jod wie in Schritt 1.2.6 oben.
9. Während Sie die Folie in einem Winkel halten, fügen Sie ein paar Tropfen Decolorizer auf die Folie, so dass es über die gefärbten Bakterien rieseln, nur bis der Ablauf klar ist; in der Regel ca. 5 Sekunden. Sofort mit Wasser abspülen, wie in Schritt 1.2.6 oben.
  Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt im Protokoll. Wenn Decolorizer zu lang oder nicht lang genug rieseln kann, führt dies zu einer falschen Gram-Färbung (4).
10. Halten Sie die Rutschstufe wieder, tragen Sie Grams Safranin auf, um die Bakterien vollständig zu bedecken, lassen Sie 45 Sekunden stehen.
11. Spülen Sie überschüssiges Safranin wie in Schritt 1.2.6 oben.
12. Blot, nicht reiben, überschüssiges Wasser von Rutsche mit Papiertüchern.
13. Untersuchen Sie das Dia auf dem Mikroskop mit Öl-Immersion mit einem 100X Objektiv.
Ergebnisse und Datenanalyse
1. Gram-positive Bakterien färben violett.
2. Gram-negative Bakterien färben rot.
3. Form (Koks, Bazillen, gekrümmte Stäbe, Spiralen) von Bakterien werden sichtbar sein.
4. Die Anordnung von Bakterienzellen (einzelne Zellen, gepaarte Zellen, Zellketten, Cluster, Gruppierungen) wird sichtbar.

2. Kapselfärbung

gliederung
1. Tragen Sie Handschuhe und einen Labormantel als Farbstoffe Flecken Hände und Kleidung.
2. Um 1% Crystal Violet Lösung vorzubereiten, mischen 0,25 Gramm Crystal Violet mit 25 ml destilliertem Wasser, bis es gelöst ist.
3. Um 1% Kongo Rote Lösung vorzubereiten, mischen 0,25 Gramm Kongo rot mit 25 ml destilliertem Wasser, bis gelöst.
4. Reinigen Sie Dias mit Labortüchern.
protokoll
1. Platz 10 L Kongo Rot auf Rutsche.
2. Mit einer Pipettenspitze eine Bakterienkolonie in den Farbstoff schmieren, um eine dünne gleichmäßige Schicht zu erzeugen.
3. Vollständig lufttrockenes Dia mit Farbstoff/Zell-Mischung, 5-7 Minuten.
  Hinweis: Nicht erhitzen fix, da das Erhitzen die Kapsel dehydrieren oder verzerren kann.
4. Den Abstrich mit 1% Crystal Violet für 1 Minute überfluten.
5. Spülen Sie überschüssigeflecken, indem Sie die Rutsche in einem Winkel halten und einen sanften, indirekten Wasserstrom auf die Rutsche spritzen und sie über die gefärbten Bakterien herunterlaufen lassen. Spritzen Sie wasser nicht direkt auf die Bakterien.
6. Halten Sie die Rutsche in einem 45-Grad-Winkel, bis sie vollständig luftgetrocknet ist.
7. Untersuchen Sie den Abstrich am Mikroskop unter Öl-Eintauchen mit einem 100-Fach-Objektiv.
Ergebnisse und Datenanalyse
1. Bakterielle Zellen färben violett.
2. Hintergrund der Folie wird dunkel färben.
3. Kapseln werden ein klarer Halo um Zellen vor einem dunklen Hintergrund sein.

3. Endospore Färbung (Schaeffer-Fulton-Methode)

gliederung
1. Tragen Sie Handschuhe und einen nicht brennbaren Labormantel, um Hände und Kleidung vor Farbstoffen und Flammen zu schützen.
2. Ein Bunsenbrenner wird verwendet, um die Bakterien zu erwärmen. Achten Sie beim Arbeiten mit Flammen auf; binden Sie lange Haare zurück.
3. Um 0,5% Malachit grüne Lösung vorzubereiten, mischen 0,125 Gramm Malachit Grün mit 25 ml destilliertem Wasser, bis gelöst.
4. Verwenden Sie die handelsübliche Safranin-Reagenzlösung von Gram.
5. Reinigen Sie Dias mit Labortüchern.
protokoll
1. Pipetten Sie 10 l Phosphat gepufferte Kochung (PBS) oder Kulturbrühe auf Folie.
2. Mit aseptischer Technik schmieren Sie eine Bakterienkolonie in die Flüssigkeit, um eine dünne gleichmäßige Schicht zu produzieren.
  Hinweis: Endosporen bilden sich in der Regel nicht in jungen Zellen, daher wird empfohlen, die Kultur zwischen 18 und 36 Stunden alt zu sein (9).
3. Vollständig lufttrockene Rutsche.
4. Wärmefix, indem Dia (Bakterien Seite nach oben) durch Flamme 4-5 mal passieren.
5. Um den Farbstoff einzudämmen, legen Sie ein Stück Linsenpapier (geschnitten, um den bakteriellen Abstrich zu passen) über die Hitze festen Abstrich.
6. Sättigen Sie Linsenpapier mit Malachite Green Lösung.
7. Legen Sie Schieben Sie auf Becher mit kochendem Wasser auf einer heißen Platte, und Dampfgleiten für 5 Minuten, halten Linsenpapier feucht durch Hinzufügen von mehr Farbstoff einen Tropfen zu einer Zeit auf eine Zeit wie nötig.
  Hinweis: Vermeiden Sie Überhitzung und Austrocknen der Farbstofflösung.
8. Entfernen Sie das Dia aus dem Becher, entfernen und entsorgen Linsenpapier, lassen Sie das Dia 2 Minuten abkühlen.
9. Halten Sie die Rutsche in einem Winkel, spülen Sie gründlich, indem Sie einen sanften, indirekten Wasserstrom auf die Rutsche spritzen, so dass es über Abstriche abfließen kann.
10. Halten Sie Rutschhöhe, Flutabstrich mit Safranin, lassen Sie 1 Minute stehen.
11. Spülen Sie überschüssiges Safranin wie in Schritt 3.2.9 oben.
12. Lufttrocknen lassen.
13. Untersuchen Sie das Dia auf dem Mikroskop unter Öl-Eintauchen mit einem 100X Objektiv.
Ergebnisse und Datenanalyse
1. Sporen färben grün.
2. Vegetative Zellen färben rot.
3. Einige vegetative Zellen enthalten Sporen; die Zellen färben rot, während die Endosporen grün färben.

Bakterien sind mikroskopisch kleine Lebewesen, die viele Unterscheidungsmerkmale wie Form, Anordnung von Zellen, ob sie Kapseln produzieren oder nicht, und wenn sie Sporen bilden. Diese Merkmale können alle durch Färbung und Hilfe bei der Identifizierung und Klassifizierung verschiedener Bakterienarten visualisiert werden.

Um die ersten beiden Eigenschaften der Zellform und -anordnung zu untersuchen, können wir eine einfache Technik namens Gram-Färbung verwenden. Hier wird Kristallviolett auf Bakterien aufgetragen, die auf einem Dia wärmefixiert wurden. Ein Decolorizer wird dann aufgetragen und alle Bakterien mit einer dicken Peptidoglykan-Schicht färben lila, da diese Schicht nicht leicht durch den Decolorizer durchdrungen werden kann. Diese Bakterien werden als Gram positiv bezeichnet.

Gram negative Bakterien haben eine dünnere peptidoglycan Schicht und wird den Decolorizer entfärben, verlieren die lila Farbe. Sie färben jedoch rötlich-rosa, wenn ein Safranin-Zählerfleck hinzugefügt wird, der an eine Lipopolysaccharidschicht an ihrer Außenseite bindet. Einmal gebeizt, können die Zellen für Morphologie, Größe und Anordnung beobachtet werden, z. B. in Ketten oder Clustern, was bei der Klassifizierung und Identifizierung weiter hilft.

Eine weitere nützliche Technik im Toolkit des Mikrobiologen ist der Kapselfleck, der verwendet wird, um externe Kapseln zu visualisieren, die einige Arten von Bakterienzellen umgeben. Aufgrund der nicht-ionischen Zusammensetzung der Kapseln und der Tendenz, Flecken abzustoßen, funktionieren einfache Färbemethoden nicht. Stattdessen wird eine negative Färbetechnik verwendet, die zunächst den Hintergrund mit einem sauren Farbstoff, wie Kongorot, färbt, bevor die Bakterienzellen mit Kristallviolett befleckt werden. Dadurch bleibt jede Kapsel als klarer Halo um die Zellen herum vorhanden.

Die letzte große Färbetechnik, die hier behandelt wird, kann helfen festzustellen, ob die untersuchten Bakterien Sporen bilden. Unter widrigen Bedingungen produzieren einige Bakterien Endosporen, ruhende, zähe, nicht-reproduktive Strukturen, deren primäre Funktion darin besteht, das Überleben von Bakterien durch Phasen von Umweltstress wie extremen Temperaturen oder Dehydrierung zu gewährleisten. Allerdings bilden nicht alle Bakterienarten Endosporen, und sie sind schwer mit Standardtechniken zu färben, weil sie für viele Farbstoffe undurchlässig sind. Die Schaeffer-Fulton-Methode verwendet Malachit-grünfleck, der auf die an einem Dia fixierten Bakterien aufgetragen wird. Die Rutsche wird dann mit Wasser gewaschen, bevor sie mit Safranin gebeizt wird. Vegetative Zellen erscheinen rosarot, während alle vorhandenen Endosporen grün erscheinen. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie diese gängigen bakteriellen Färbetechniken durchführen und dann die Färbeproben mit Der Lichtmikroskopie untersuchen.

Um den Eingriff zu beginnen, binden Sie lange Haare zurück und ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Labormantels und Handschuhen.

Reinigen Sie dann ein frisches Mikroskopschlitten mit einem Labortuch. Als nächstes pipette 10 Mikroliter 1X Phosphat gepuffert Saline auf den ersten Schlitten. Verwenden Sie dann eine sterile Pipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte auszuwählen. Schmieren Sie die Bakterienkolonie in der Flüssigkeit, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu produzieren. Stellen Sie die Rutsche auf die Bankspitze, und lassen Sie es vollständig lufttrocknen.

Nach dem Trocknen, lichten Sie einen Bunsenbrenner, um die Bakterien zu erhitzen. Mit Zangen, passieren Sie die Rutsche durch die Brennerflamme mehrmals, mit den Bakterien Seite nach oben, achten Darauf, nicht die Rutsche in der Flamme zu lange zu halten, die die Zellen verzerren kann.

Nun, über das Waschbecken arbeiten, halten Sie die Rutsche Ebene und wenden Sie mehrere Tropfen von Grams Kristallviolett, um vollständig den bakteriellen Abstrich zu decken und dann legen Sie die Rutsche auf die Bank für 45 Sekunden stehen. Halten Sie als nächstes die Folie in einem Winkel, und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrom auf die Oberseite der Rutsche, wobei Sie darauf achten, den bakteriellen Abstrich nicht direkt zu spritzen. Halten Sie nun die Rutschstufe wieder auf, tragen Sie Die Jodlösung von Gram auf, um die gefärbten Bakterien vollständig zu bedecken, und lassen Sie sie dann weitere 45 Sekunden stehen. Als nächstes spülen Sie das Jod vorsichtig von der Folie, wie zuvor gezeigt. Während Sie die Folie in einem Winkel halten, fügen Sie ein paar Tropfen von Grams Decolorizer auf die Folie, so dass es über die gefärbten Bakterien herunterlaufen, nur bis der Ablauf klar ist, für etwa 5 Sekunden. Sofort mit Wasser abspülen, wie zuvor gezeigt. Dadurch wird die Überfärbung des Abstrichs begrenzt. Als nächstes, halten Sie die Rutschebene wieder, tragen Sie Grams Safranin Gegenfleck, um die gefärbten Bakterien vollständig zu bedecken. Nach 45 Sekunden den Safranin vorsichtig mit Wasser aus der Rutsche spülen und dann mit Papiertüchern trocknen.

Fügen Sie schließlich einen Tropfen Tauchöl direkt auf den Schlitten, und untersuchen Sie dann das Dia mit einem Lichtmikroskop mit einer 100-fachen Ölobjektivlinse.

Um dieses Färbeprotokoll zu beginnen, legen Sie zuerst die richtige persönliche Schutzausrüstung auf und stellen Sie dann sicher, dass die verwendeten Glasgweise sauber sind.

Erstellen Sie als Nächstes die Lösungen. Um 1% kristallviolette Lösung herzustellen, 0,25 Gramm kristallviolettes Pulver mit 25 Millilitern destilliertem Wasser und Wirbel mischen, bis es gelöst ist. Dann bereiten 1% Kongo rote Lösung durch Mischen 0,25 Gramm Kongo rotes Pulver mit 25 Milliliter destilliertem Wasser und Wirbel, bis gelöst. Nun, Pipette 10 Mikroliter der Kongo roten Lösung auf der Rutsche. Wählen Sie mit einer sauberen, sterilen Pipettenspitze eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte aus. Dann schmieren Sie die Bakterienkolonie in den Farbstoff, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu produzieren. Vollständig lufttrocknen die bakterielle Rutsche für 5-7 Minuten. Sobald die Rutsche trocken ist, überfluten Sie den Abstrich mit genügend 1% Kristallviolett, um den Abstrich zu bedecken und lassen Sie es für 1 Minute sitzen. Halten Sie nun die Rutsche in einem Winkel und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrom auf die Oberseite der Rutsche, wobei Sie darauf achten, die Bakterien nicht direkt zu spritzen. Halten Sie die Rutsche in einem 45-Grad-Winkel, bis sie vollständig luftgetrocknet ist. Fügen Sie schließlich einen Tropfen Tauchöl direkt auf die Folie, und dann untersuchen Sie das Dia mit einem Lichtmikroskop mit einem 100-fachen Ölobjektiv.

Um Endospore Färbung durchzuführen, zuerst, bereiten Sie eine 0,5% Malachit grüne Lösung durch Mischen 0. 125 Gramm Malachit-Grünpulver mit 25 Milliliter n. Wasser, und dann wirbeln die Lösung, bis gelöst. Als nächstes Pipette 10 Mikroliter 1X PBS auf die Mitte des Schlittens. Verwenden Sie dann eine sterile Pipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte auszuwählen. Schmieren Sie die Bakterien in die Flüssigkeit, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu produzieren. Stellen Sie nun die Rutsche auf die Bankspitze und lassen Sie sie vollständig lufttrocknen. Nach dem Trocknen, lichten Sie einen Bunsenbrenner, um die Bakterien zu erhitzen. Passieren Sie die Rutsche durch die blaue Brennerflamme mehrmals, mit der Bakterienseite nach oben. Dann, sobald die Folie abgekühlt ist, legen Sie ein Stück vorgeschnittenes Linsenpapier über die Hitze fest Abstrich. Als nächstes schalten Sie eine Kochplatte auf die höchste Einstellung ein und bringen Sie einen Becher Wasser zum Kochen.

Sättigen Sie das Linsenpapier mit der Malachit-grünen Lösung und legen Sie mit Einer Zange die Rutsche auf den Becher mit kochendem Wasser, um 5 Minuten zu dampfen. Halten Sie das Linsenpapier feucht, indem Sie je nach Bedarf mehr Farbstoff, einen Tropfen nach dem anderen hinzufügen. Als nächstes, wieder mit Zange, nehmen Sie die Folie aus dem Becher und entfernen und entsorgen Sie das Linsenpapier. Lassen Sie die Folie für 2 Minuten abkühlen. Wenn Sie über das Waschbecken arbeiten, halten Sie die Folie in einem Winkel und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrom auf die Oberseite der Rutsche. Halten Sie nun die Folienebene und wenden Sie Safranin an, um die Folie vollständig abzudecken. Dann lassen Sie es für 1 Minute stehen. Halten Sie als Nächstes die Folie in einem Winkel und spülen Sie sie wie zuvor gezeigt. Lassen Sie die Rutsche auf der Bank oberseite trocknen. Fügen Sie schließlich einen Tropfen Tauchöl direkt auf die Folie, und dann untersuchen Sie das Dia mit einem Lichtmikroskop, mit einem 100-Fach-Ölobjektiv.

Im Gramm-Färbeprotokoll können zwei verschiedene farbige Flecken entstehen. Dunkelviolette Färbung zeigt an, dass die Bakterien grampositiv sind und dass sie den kristallvioletten Fleck beibehalten haben. Im Gegensatz dazu ist rötlich-rosa Färbung ein Merkmal von Gram-negativen Bakterien, die stattdessen durch den Safranin-Zählerfleck gefärbt werden. Zusätzlich können nach der Gram-Färbung verschiedene Formen und Anordnungen von Bakterien visualisiert werden. Zum Beispiel ist es möglich, Cocci, oder runde Bakterien, von stabförmigen Bacillus zu unterscheiden, oder Bakterien zu identifizieren, die Stränge bilden, im Vergleich zu denen, die typischerweise als Klumpen aggregieren, oder rein auftreten.

In einem Kapsel-gefärbten Mikroskopbild werden die Bakterienzellen in der Regel lila gefärbt, und der Hintergrund des Dias sollte dunkel gefärbt sein. Vor diesem dunklen Hintergrund erscheinen die Kapseln der Bakterien, wenn sie vorhanden sind, als klarer Halo um die Zellen herum.

Schließlich werden vegetative Zellen bei der Endosporenfärbung durch den Safranin-Zählerfleck rot gefärbt. Wenn Endosporen in der Probe vorhanden sind, behalten diese den malachitgrünen Fleck und erscheinen bläulich-grün in der Farbe.

Applications and Summary

Bakterien weisen Unterscheidungsmerkmale auf, die bei ihrer Identifizierung helfen können. Einige dieser Eigenschaften können durch Färbung und Lichtmikroskopie beobachtet werden. Drei Färbetechniken, die für die Beobachtung dieser Eigenschaften nützlich sind, sind Gram-Färbung, Kapselfärbung und Endospore-Färbung. Jede Technik identifiziert unterschiedliche Eigenschaften von Bakterien und kann verwendet werden, um Ärzten zu helfen, Behandlungen für Patienten zu empfehlen, potenzielle Verunreinigungen in Proben oder Lebensmitteln zu identifizieren und die Probensterilität zu überprüfen.

References

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Transcript

Bacteria are microscopic living organisms that have many distinguishing characteristics such as shape, arrangement of cells, whether or not they produce capsules, and if they form spores. These features can all be visualized by staining and aid in the identification and classification of different bacterial species.

To examine the first two characteristics of cell shape and arrangement, we can use a simple technique called Gram staining. Here, crystal violet is applied to bacteria, which have been heat-fixed onto a slide. Next, Gram’s iodine solution is added to the slide, resulting in the formation of an insoluble complex between the crystal violet and the Gram’s iodine solution. A decolorizer is then applied and any bacteria with a thick peptidoglycan layer will stain purple, as this layer is not easily penetrated by the decolorizer. These bacteria are referred to as Gram-positive.

Gram-negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and will de-stain the decolorizer, losing the purple color. However, they will stain reddish-pink when a safranin counterstain is added, which binds to a lipopolysaccharide layer on their outside. Once stained, the cells can be observed for morphology, size, and arrangement, such as in chains or clusters, which further aids in classification and identification.

Another useful technique in the microbiologist’s toolkit is the capsule stain, used to visualize external capsules that surround some types of bacterial cells. Due to the capsule’s non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods won’t work. Instead, a negative staining technique is used, which first stains the background with an acidic colorant, such as Congo red, before the bacterial cells are stained with crystal violet. This leaves any capsule present as a clear halo around the cells.

The final major staining technique covered here can help determine if the bacteria being studied forms spores. In adverse conditions, some bacteria produce endospores, dormant, tough, non-reproductive structures whose primary function is to ensure the survival of bacteria through periods of environmental stress, like extreme temperatures or dehydration. However, not all bacterial species make endospores, and they are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to many dyes. The Schaeffer-Fulton method uses malachite green stain, which is applied to the bacteria fixed to a slide. The slide is then washed with water before being counterstained with Safranin. Vegetative cells will appear pinkish-red, while any endospores present will appear green. In this video, you will learn how to perform these common bacterial staining techniques and then examine the staining samples using light microscopy.

To begin the procedure, tie back long hair and put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves.

Then, clean a fresh microscope slide with a laboratory wipe. Next, pipette 10 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto the first slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacterial colony in the liquid to produce a thin, even layer. Set the slide on the benchtop, and allow it to fully air dry.

Once dried, light a Bunsen burner to heat-fix the bacteria. Using tongs, pass the slide through the burner flame several times, with the bacteria side up, taking care not to hold the slide in the flame too long, which may distort the cells.

Now, working over the sink, hold the slide level and apply several drops of Gram’s crystal violet to completely cover the bacterial smear and then place the slide onto the bench to stand for 45 seconds. Next, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacterial smear directly. Now, holding the slide level again, apply Gram’s iodine solution to completely cover the stained bacteria and then allow it to stand for another 45 seconds. Next, carefully rinse the iodine from the slide, as shown previously. While holding the slide at an angle, add a few drops of Gram’s decolorizer to the slide, allowing it to run down over the stained bacteria, just until the run-off is clear, for approximately 5 seconds. Immediately, rinse with water as shown previously. This will limit over-decolorizing the smear. Next, holding the slide level again, apply Gram’s safranin counterstain to completely cover the stained bacteria. After 45 seconds, gently rinse the Safranin from the slide with water, as shown previously, and then blot dry with paper towels.

Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective lens.

To begin this staining protocol, first put on the correct personal protective equipment and then ensure that the glass slides that will be used are clean.

Next, prepare the solutions. To make 1% crystal violet solution, mix 0.25 grams of crystal violet powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Then, prepare 1% Congo red solution by mixing 0.25 grams of Congo red powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Now, pipette 10 microliters of the Congo red solution onto the slide. Using a clean, sterile pipette tip, select a single bacterial colony from the LB agar plate. Then, smear the bacterial colony into the dye to produce a thin, even layer. Completely air dry the bacterial slide for 5-7 minutes. Once the slide is dry, flood the smear with enough 1% crystal violet to cover the smear and let it sit for 1 minute. Now, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacteria directly. Continue holding the slide at a 45-degree angle until completely air-dried. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective.

To perform endospore staining, first, prepare a 0.5% malachite green solution by mixing 0. 125 grams of malachite green powder with 25 milliliters of distilled water, and then vortex the solution until dissolved. Next, pipette 10 microliters of 1X PBS onto the center of the slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacteria into the liquid to produce a thin, even layer. Now, set the slide on the benchtop, and allow it to fully air dry. Once dried, light a Bunsen burner to heat-fix the bacteria. Pass the slide through the blue burner flame several times, with the bacteria side facing up. Then, once the slide has cooled, place a piece of precut lens paper over the heat-fixed smear. Next, turn on a hotplate to the highest setting, and bring a beaker of water to a boil.

Saturate the lens paper with the malachite green solution and, using tongs, place the slide on top of the beaker of boiling water to steam for 5 minutes. Keep the lens paper moist by adding more dye, one drop at a time, as needed. Next, again using tongs, pick up the slide from the beaker and remove and discard the lens paper. Allow the slide to cool for 2 minutes. Working over the sink, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide. Now, hold the slide level and apply Safranin to completely cover the slide. Then, allow it to stand for 1 minute. Next, hold the slide at an angle and rinse as previously shown. Allow the slide to air dry on the benchtop. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then examine the slide with a light microscope, with a 100X oil objective.

In the Gram staining protocol, two different colored stains can result. Dark purple staining indicates that the bacteria are Gram-positive and that they have retained the crystal violet stain. In contrast, reddish-pink staining is a characteristic of Gram-negative bacteria, which instead will be colored by the Safranin counterstain. Additionally, different shapes and arrangements of bacteria can be visualized after Gram staining. For example, it is possible to differentiate Cocci, or round bacteria, from rod-shaped Bacillus, or identify bacteria, which forms strands, compared to those which typically aggregate as clumps or occur singly.

In a capsule stained microscope image, the bacterial cells will typically be stained purple, and the background of the slide should be darkly stained. Against this dark background, the capsules of the bacteria, if present, will appear as a clear halo around the cells.

Lastly, in endospore staining, Vegetative cells will be stained red by the Safranin counterstain. If endospores are present in the sample, these will retain the malachite green stain and appear bluish-green in color.

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