Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden

1. Versuchsaufbau für 3' RACE

1. Entwerfen Sie einen 5'-spezifischen Primer für ein Gen von Interesse (genspezifischer Primer 1, GSP-1). Er muss hochspezifisch sein, da er der einzige Primer ist, der Spezifität einführt. Daher wäre ein relativ langer Primer vorzuziehen (typische Länge um 24 Nukleotide, Tm im Bereich von 55-65°C).
2. Entwerfen Sie einen zweiten, verschachtelten Primer (GSP-2), d.h. der Primer sollte sich 3' von GSP-1 befinden. Dieser Schritt ist optional, aber die Durchführung einer zweiten PCR mit einem verschachtelten Primer erhöht die Ausbeute und Spezifität der PCR für das interessierende Gen. Die Primer, die zur Amplifikation von dSmad2-cDNAs verwendet werden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

2. Synthese von cDNA

1. Extrahieren Sie RNA aus Proben mit einer RNA-Extraktionsmethode oder einem RNA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Behandeln Sie die Proben mit DNase, um eine Amplifikation der genomischen DNA zu vermeiden. In unserem Beispiel haben wir RNA von 10 ganzen erwachsenen Fliegen extrahiert.
2. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer und stellen Sie sie bei Bedarf mit RNase-freiem Wasser auf maximal 100 ng/μl ein.
3. Bereiten Sie cDNA in einer reversen Transkriptionsreaktion (RT) unter Verwendung eines für RACE empfohlenen Kits vor. Bereiten Sie einen Mastermix mit den folgenden Reagenzien pro Probe vor:
   - 4 μl Puffer für reverse Transkription (5x)
   - 2 μl Oligo(dT)₂₀ Primer (ein Oligo bestehend aus 20 Desoxythymidinen)
   - 10 μl RNA (max. 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl reverse Transkriptase
   - GESAMT: 20 μl
4. Die Reaktion wird 90 Minuten lang bei 42 °C inkubiert. Es wird eine Negativkontrolle ohne reverse Transkriptase durchgeführt.
5. Inaktivieren Sie die reverse Transkriptase, indem Sie 5 Minuten lang bei 85ºC inkubieren.
6. Um den DNA-Gehalt für eine effiziente PCR zu verdünnen, fügen Sie 80 μl TE-Puffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 μl zu bringen.

3. Amplifikation von cDNA-Fragmenten

1. Bereiten Sie die PCR-Mischung der ersten Amplifikation mit einer High-Fidelity (HF) Taq-Polymerase vor:
   - 4 μl 5x HF Taq Polymerase Puffer
   - 0,4 μl dNTP-Mischung (je 10 mM)
   - 1 μl GSP1-Grundierung (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)20 Primer (10 μM)
   - 1 μl cDNA-Vorlage
   - 0,2 μl HF-Taq-DNA-Polymerase
   - 12,4 μl ddH2O
   - Gesamt: 20 μl
2. Führen Sie die PCR mit dem Programm PCR1 aus (Tabelle 1). Es wird eine Negativkontrolle mit dem ursprünglichen RNA-Produkt ohne RT als Vorlage aufgenommen. Darüber hinaus kann eine "No Primer"-Regelung enthalten sein.
3. Optional: Nested PCR zur Erhöhung der Spezifität und der Menge an cDNA-Produkten. 1 μl der PCR-Produkte und Negativkontrolle 1:20 in TE-Puffer verdünnen. Verwenden Sie sie als Vorlage für die zweiten PCR-Reaktionen:
   - 4 μl 5x HF Taq Polymerase Puffer
   - 0,4 μl dNTP-Mix (je 10 mM)
   - 1 μl GSP2-Grundierung (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)₂₀ Primer (10 μM)
   - 1 μl PCR-Produktvorlage
   - 0,2 μl HF-Taq-DNA-Polymerase
   - 12,4 μl ddH2O
   - Gesamt: 20 μl
4. Führen Sie die zweite PCR mit dem PCR2-Programm aus (Tabelle 1)

4. Isolierung von cDNA-Fragmenten

1. Bereiten Sie ein 1-2%iges Agarosegel mit TAE-Puffer vor, verwenden Sie Ethidiumbromid oder eine alternative DNA-Färbung.
2. Mischen Sie 5 μl Probe mit 1 μl 6x Gel-Ladepuffer.
3. Laden Sie die Proben und die 1kb DNA-Leiter als Marker und lassen Sie das Gel etwa 45 Minuten lang bei 120 V laufen oder bis die Farbstofffront ~75% des Weges nach unten auf dem Gel liegt. Stellen Sie sicher, dass die Proben nicht aus dem Gel laufen.
4. Überprüfen Sie die Gelbänder unter einer UV-Lampe. Verwenden Sie für die Weiterverarbeitung der Produkte UV mit geringer Intensität, lokalisieren Sie die verstärkten Banden und schneiden Sie sie mit einem Skalpell aus dem Gel.
5. Reinige die DNA aus dem Gel mit einer Methode wie Gefrierpressen oder einem Kit.
6. Lagern Sie die aufgereinigten cDNA-Fragmente bei -20 °C oder verwenden Sie sie sofort für weitere Anwendungen, wie z. B. Sequenzierung oder Klonierung.