Name: Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Lernen Sie das Mikrokontaktdrucken von Proteinen auf Oberflächen für die Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die präzise Musterung von Fibronektin auf Glas, um zelluläre Adhäsion zu untersuchen.

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1. Herstellung von Lösungen und Materialien Diese Schritte sollten durchgeführt werden, mehrere Tage im Voraus. <ol><li> Deckgläser. Wasser, bei einer 1 gemischt: Die Deckgläser wurden durch Untertauchen für 10 Minuten in eine Lösung von Linbro 7X Reinigungsmittel gesäubert 3-Verhältnis und unter Rühren erhitzt, bis klar. Deckgläser wurden ausgiebig mit deionisiertem Wasser gespült und anschließend bei 450 ° C für 6 Stunden gebacken. Loading Deckgläser in keramische Färbegestelle (siehe Reagenzien) vereinfacht diesen Prozess. </li><li> Protein-Lösung für Stanz. Rekonstituieren Fibronektin folgenden Anweisungen des Herstellers, um eine Stammlösung von 1 mg / ml Konzentration. </li></ol> 2. Cast Briefmarken aus der topologischen Meister Diese Schritte können durchgeführt werden, mehrere Tage im Voraus. Shop Briefmarken Muster-up in einer Schale mit Deckel, wie ein Gewebe Kulturschale. <ol><li> Entfernen Sie den Staub vom Meister mit einem Strom von Druckluft, gefilterte Luft oder Inertgas. </li><li> Setzen Sie den Meister, gemusterten Seite nach oben in den Boden einer Plastikschale nur größer als der Meister. 60 - oder 100-mm Gewebekulturschalen sind für diesen Zweck gut geeignet. </li><li> In einem Polystyrol 50 ml Zentrifugenröhrchen, kombinieren die Sylgard Komponenten in einem Verhältnis von Härter: Elastomer Basis von 1: 10 nach Gewicht. Nach gründlichem Mischen mit einem Kunststoff-Gerät, wie ein Einweg-Pipette. Bereiten Sie mindestens 0,2 ml aus Elastomer pro Quadratzentimeter Gericht Bereich. </li><li> Zentrifugieren Sie die 50 ml Tube mit 300 g für 5 min, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Gießen Sie das Elastomer über den Master, dann in einem Exsikkator Platz unter Vakuum für 30 Minuten. </li><li> Cure das Elastomer in einem Ofen bei 65 ° C für mindestens 2 Stunden. Aushärtung bei höheren Temperaturen und längeren Zeiten Ergebnisse in steifer Elastomer. Lassen Sie auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Separate das Blatt Briefmarken aus dem Master. </li></ol> 3. Mikrokontaktdruck von Fibronektin auf Glas <ol><li> Schneiden Sie einen einzigen Stempel. Briefmarken von 4 mm x 4 mm bis 1 cm x 1 cm groß und 1 bis 2 mm dick sind am einfachsten zu starten. Legen Sie Muster nach oben auf eine Glasplatte oder kleine Plastikschale. </li><li> Ort Stempel in einen Plasma-Reiniger und Verfahren unter Vakuum für 30 Sekunden. Ein Harrick Scientific Plasma-Reiniger (siehe Ausstattung), am höchsten Output Einstellung gesetzt wird machen die PDMS-Oberfläche hydrophil. Längere Zeiten führen zu Rissen des Elastomers. </li><li> Verdünnen Sie die Fibronektin-Lösung mit deionisiertem Wasser auf eine Stanz-Konzentration von 50 ug / ml. </li><li> Legen Sie einen kleinen Tropfen (10 bis 50 ul) von Stanz-Lösung auf den Stempel. Es wird über die hydrophile Oberfläche verteilt. Fügen Sie nur soviel Lösung, dass der Rückgang der Stempel deckt, aber nicht über die Kanten laufen. Lassen Protein adsorbieren für 5 Minuten zu stempeln. </li><li> Mit einem Kimwipe ® oder anderen sauberen Papiertuch, Docht aus die meisten der Protein-Lösung aus dem Stempel, ohne die strukturierten Gebiet. </li><li> Trocknen Sie die restliche Lösung aus der Stempel unter einem Strom von sauberen, trockenen, inerten Gas wie Stickstoff. </li><li> Mit Pinzette, entfernen Sie den Stempel aus der Glas-Objektträger, umzukehren, und in Kontakt mit dem gereinigten Deckglas (die Oberfläche strukturiert werden). Legen Sie ein Gewicht auf einen guten Kontakt zu fördern. Das spezifische Gewicht, dass die besten Strukturierung bietet, ist abhängig von den Stempel Größe und Muster; beginnen mit einem 5 g Gewicht und passen zwischen Stanzteile. Lassen Sie Stempel in Kontakt mit der Oberfläche für 1 Minute. </li><li> Vorsichtig zerlegen den Stack und separaten Stempel aus Deckglas. </li><li> Kräftig spülen gemusterten Deckglas in PBS, durch deionisiertes Wasser gefolgt, um Protein, das nicht an der Oberfläche adsorbiert ist zu entfernen. Dry Deckglas unter Stickstoffstrom. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Mikrokontaktdruck ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Strukturierung Molekülen auf Oberflächen. Dieser Prozess hat die Fähigkeit, Funktionen mit Abmessungen von zehn Mikrometern bis einigen hundert Nanometern zu schaffen; in Abb.. 1A, sind die Logos auf der linken Seite jeweils 200 pm in der Höhe, während die grünen Flecken in Abb. dargestellt. 1B 1 ​​um Durchmesser und Abstand bei 4 um Intervalle, gemessen von Mitte zu Mitte. Abb.. 1B zeigt auch eine leistungsfähige Immobilien Mikrokontaktprägen, nämlich, dass es ist und additiven Prozess. Mehrere Runden von Mikrokontaktdrucken kann eine einzelne Fläche in Mehrkomponenten-Systeme 3 erstellen angewendet werden. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Abbildung A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Abbildung B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Die Mikrokontaktdrucken Prozess ist konzeptionell einfach und sehr robust, dass die Strukturierung einer Vielzahl von Molekülen auf einer Vielzahl von Substraten aufgebracht. Allerdings bleibt dieser Prozess etwas wie eine Kunst. Die spezielle Geometrie des Musters erstellt werden soll, Eiweiß zu strukturierende, Auflagegewicht und Beschichtung / Stanzen Bedingungen wirken sich auf die Prägequalität. Zum Beispiel, zu wenig Gewicht, auf große Features, führt oft zu Lücken in der Muster wie in der oberen rechten Logo ersichtlich ist. 1A. Umge...

<table><tbody><tr><td>Plasmareiniger</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Trockenexsikkator</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Markierungs-Kit</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerhalter für Färbungen</td><td>Reagenz</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Reagenz</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Beugungsgitter</td><td>Reagenz</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrokontaktdrucken von proteinen für zellbiologie

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Die Fähigkeit, Muster Proteinen und anderen Biomolekülen auf Substrate ist für die Erfassung der räumlichen Komplexität der extrazellulären Umgebung wichtig. Entwicklung von Mikrokontaktdrucken durch die Whitesides Gruppe (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) In der Mitte der 1990er Jahre revolutioniert diesem Bereich, indem Mikroelektronik / Mikrofabrikationstechniken zugänglich Labors auf dem Gebiet Life Sciences fokussiert. Erste Implementierungen dieser Methode verwendet Polydimethylsiloxan (PDMS) Briefmarken, um Muster von funktionalisierten Chemikalien auf Materialoberflächen erstellen<sup&gt; 1</sup&gt;. Seitdem haben eine Reihe von innovativen Ansätzen, um Muster anderer Moleküle entwickelt worden, einschließlich Proteinen<sup&gt; 2</sup&gt;. Dieses Video zeigt den grundlegenden Prozess der Erstellung PDMS-Stempel und nutzt sie, um Muster Proteine, wie diese Schritte schwierig, genau in Worte zu fassen sind. Wir konzentrieren uns auf die Strukturierung der extrazellulären Matrix-Protein Fibronektin auf Deckgläschen als ein konkretes Beispiel der Musterung. Ein wichtiger Bestandteil des Mikrokontaktdrucken Prozess ist eine topologische Meister, von denen die Briefmarken abgegeben werden; das Heben und Senken Regionen der Meister in die Stempel gespiegelt und definieren die endgültige Muster. Typischerweise wird ein Kapitän eines Silizium-Wafers mit Fotolack beschichtet und dann strukturiert durch Photolithographie besteht, wie hier geschehen. Erstellung von Meistern, die ein bestimmtes Muster erfordert spezielle Ausrüstung und wird am besten in Absprache mit einem Fertigungszentrum oder Anlage angefahren. Allerdings kann fast jedes Substrat mit Topologie wie ein Meister, wie Kunststoff-Beugungsgitter (siehe Reagenzien für ein Beispiel) verwendet werden, und solche glückliche Meister geben leicht zugänglich, einfache Muster. Dieses Protokoll beginnt mit dem Punkt, der mit einem Master in der Hand.

Mikrokontaktdruck ausgiebig in die Muster von Proteinen und anderen Molekülen auf Materialoberflächen eingesetzt. Wir zeigen die wichtigsten Schritte dieses Prozesses, Stanz-Muster von Fibronektin auf Glas.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

Die Fähigkeit, Proteine und andere Biomoleküle auf Substraten zu patternen, ist entscheidend, um die räumliche Komplexität der extrazellulären Umgebung abzubilden.

Mikrokontaktdruck wird verwendet, um Proteine und andere Moleküle auf Materialoberflächen zu strukturieren und so die Komplexität extrazellulärer Umgebungen nachzubilden. Um mit dem Mikrokontaktdruck zu beginnen, wird zunächst eine topologische Vorlage hergestellt, und anschließend wird mittels weicher Lithographie ein Stempel aus dieser Vorlage aus Sylgard gegossen. Der Stempel kann mit einem Protein beschichtet und dann genutzt werden, um Proteine auf einer neuen Oberfläche aufzudrucken, an der Zellen haften können.Hallo, mein Name ist Chen. Ich komme aus dem Labor von Dr. Lance Camp im Fachbereich Biomedizinische Technik an der Columbia University. Hallo, ich bin GT aus dem Fachbereich Maschinenbau.Hallo, ich bin Lance Kem aus der Abteilung für Biomedizinische Technik an der Columbia University. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie Zellen auf komplexe Anordnungen von Proteinen in ihrer extrazellulären Umgebung reagieren. Es wurde Mitte der 1990er Jahre im Labor von George Whitesides entwickelt und hat sich zu einem weit verbreiteten und wertvollen Werkzeug entwickelt.Es gibt viele Variationen dieser Technik, aber heute werden G und Co U den grundlegenden Mikrokontaktdruck-Prozess demonstrieren. Beginnen wir also. Für den Mikrokontaktdruck sollten Sie die Deckgläser und die Proteiniösung zum Bedrucken bereits mehrere Tage im Voraus vorbereiten.Zunächst die Deckgläser 10 Minuten lang in die Limbo-Lösung geben und unter Erhitzen und Rühren belassen, bis die Lösung klar ist. Dieser Prozess sowie die folgenden Schritte zur Reinigung und Lagerung können vereinfacht werden, indem die Deckgläser in keramische Färbehalter geladen werden. Anschließend die Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser spülen und die gespülten Deckgläser sechs Stunden lang bei 45 Grad Celsius trocknen.Um die Proteiniösung herzustellen, rekonstituieren Sie Fibronectin gemäß den Herstelleranweisungen auf eine Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Diese Stammlösungen werden bei minus 20 Grad Celsius eingefroren gelagert. Arbeitsaliquote befinden sich vorübergehend bei vier Grad Celsius in der Lagerung.Gusstempel können mehrere Tage vor dem Experiment hergestellt werden. Diese Tempel können mit dem Muster nach oben in einer abgedeckten Schale, beispielsweise einer Zellkulturschale, aufbewahrt werden. Beginnen Sie zunächst damit, lose Partikel vom Master mithilfe eines Luftstroms aus komprimierter, gefilterter Luft oder einem Inertgas zu entfernen.Als Nächstes platzieren Sie das Mastermuster mit der Oberseite nach oben auf dem Boden einer Kunststoffschale, die etwas größer als das Mastermuster ist und mit Aluminiumfolie beschichtet sein sollte. Dazu eignen sich gut 60- oder 100-mm-Zellkulturschalen. In einem Polystyrol-Zentrifugenröhrchen mit 50 ml mischen Sie die Bestandteile des Cyl-Guards im Gewichtsverhältnis von einem Teil Härter zu zehn Teilen Elastomer-Grundmasse.Gründlich mit einem Einweg-Plastikwerkzeug wie einer Pipettenspitze mischen. Bereiten Sie so viel des Elastomers vor, dass mindestens 0,2 Milliliter Elastomer pro Quadratzentimeter der Schälchenfläche vorhanden sind. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 300 ×g für fünf Minuten.Um Luftblasen nach der Zentrifugation oder über dem Elastomer auf dem Master zu entfernen, setzen Sie es anschließend für 30 Minuten unter Vakuum, beispielsweise in einem Exsikkator. Danach härten Sie das Elastomer in einem Ofen bei 65 Grad Celsius mindestens zwei Stunden lang aus. Eine Aushärtung bei höheren Temperaturen und über längere Zeiträume führt zu einem steiferen Elastomer.Nach der Aushärtung lässt man die Negativform auf Raumtemperatur abkühlen. Abschließend trennt man das Stempelblatt von der Negativform und schneidet den Stempel auf die Abmessungen der Negativform für den Mikrokontakt zu. Drucken Sie zunächst Faser-Nin auf die Glasdeckgläser. Schneiden Sie eine einzelne Probe aus, die eine Fläche von vier Millimeter mal vier Millimeter bis ein Zentimeter mal ein Zentimeter und eine Dicke von ein bis zwei Millimeter aufweist; solche Größen eignen sich am besten für den Einstieg. Legen Sie die Probe mit der Musterseite nach oben auf einen Objektträger oder eine kleine Plastikschale. Anschließend platzieren Sie die Probe in einem Plasma-Reiniger und behandeln sie unter Vakuum für 30 Sekunden.Ein auf der höchsten Ausgangsleistung eingestellter Plasma-Reiniger von Herrick Scientific macht die PDMS-Oberfläche hydrophil. Bei längeren Behandlungszeiten kommt es zum Rissbildung im Elastomer. Verdünnen Sie die Fiber-Nin-Lösung mit PBS auf eine Auftragskonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter. Wenn die Lösung bereit ist, geben Sie einen kleinen Tropfen von etwa 10 bis 50 Mikrolitern der Stempellösung auf den Stempel. Die Lösung verteilt sich auf der hydrophilen Oberfläche. Geben Sie nur so viel Lösung hinzu, dass der Tropfen den Stempel bedeckt, aber nicht über die Kanten läuft.Lassen Sie das Protein fünf Minuten lang auf dem Stempel adsorbieren. Danach verwenden Sie ein Kim-Tuch oder ein anderes sauberes Papiertuch, um die Proteinlösung vom Stempel abzuziehen, ohne die strukturierte Region zu berühren. Trocknen Sie die restliche Flüssigkeit auf dem Stempel unter einem Strom sauberen, trockenen Inertgases wie etwa Stickstoff.Nach dem Trocknen das Stempel mit einer Pinzette von der Objektträgerplatte abheben, umdrehen und den Stempel in Kontakt mit der gereinigten Deckglasoberfläche bringen. Die zu strukturierende Oberfläche unterlegen. Ein Gewicht auf den Stempel legen, um einen guten Kontakt zu gewährleisten.Das spezifische Gewicht, das die beste Strukturierung ergibt, hängt von der Stempelgröße und dem Muster ab. Beginnen Sie mit dem fünf Gramm schweren Gewicht und passen Sie es zwischen den Abdrücken an. Lassen Sie den Stempel eine Minute lang mit der Oberfläche in Kontakt. Nach Beendigung vorsichtig den Stapel auseinandernehmen und den Stempel kräftig von der Deckglasabdeckung trennen. Das strukturierte Deckglas zur Entfernung nicht an der Oberfläche adsorbierter Proteine nacheinander mit PBS und dann mit entionisiertem Wasser spülen und anschließend das Deckglas unter einem Stickstoffstrom trocknen. Das Mikrokontaktdruckverfahren ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Erzeugung von Molekülstrukturen auf Oberflächen.In diesem Beispiel strukturieren wir fluoreszenzmarkiertes Fibronectin im Muster unseres Hochschullogos. Jedes Logo ist 200 Mikrometer hoch. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass mehrere Runden des Mikrokontaktdrucks auf einer einzigen Oberfläche kombiniert werden können, wie in diesem Beispiel mit zwei verschiedenen Antikörpern, die auf einer einzigen Oberfläche übereinander angeordnet sind.In diesem Fall messen die grünen Flecken einen Durchmesser von einem Mikrometer und sind in Abständen von vier Mikrometern angeordnet. Wir verwenden diese Oberflächen, um zu untersuchen, wie Zellen mehrere Signale der extrazellulären Umgebung integrieren. In diesem Film sind naive T-Zellen auf einem Array von Flecken angeordnet, die Antikörper gegen Oberflächenrezeptoren der Zellen enthalten.Zellen lokalisieren diese Strukturen und interagieren mit ihnen, wodurch sie unregelmäßige Anordnungen selbstorganisieren. Der Mikrokontaktdruck ist konzeptionell einfach und äußerst robust und wurde bereits zur Mustersetzung einer breiten Palette von Molekülen auf verschiedenen Substraten eingesetzt. Dennoch bleibt dieses Verfahren bis heute eher eine Kunst. Die spezifische Geometrie des zu erzeugenden Musters, das zu musterte Protein, das aufgebrachte Gewicht und die Bedingungen für das Beschichten und Abdrucken beeinflussen alle die Abdruckqualität. Wir demonstrieren das Mustern von Fibronectin auf Glas als zuverlässigen Ausgangspunkt, um diese Techniken zu erlernen. Soeben haben wir Ihnen die Grundlagen des Mikrokontaktabdrucks bei der Durchführung dieses Verfahrens gezeigt.Denken Sie immer daran, die Sicherheitsvorkehrungen im Labor einzuhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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