Name: Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Lernen Sie das Mikrokontaktdrucken von Proteinen auf Oberflächen für die Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die präzise Musterung von Fibronektin auf Glas, um zelluläre Adhäsion zu untersuchen.

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1. Herstellung von Lösungen und Materialien Diese Schritte sollten durchgeführt werden, mehrere Tage im Voraus. <ol><li> Deckgläser. Wasser, bei einer 1 gemischt: Die Deckgläser wurden durch Untertauchen für 10 Minuten in eine Lösung von Linbro 7X Reinigungsmittel gesäubert 3-Verhältnis und unter Rühren erhitzt, bis klar. Deckgläser wurden ausgiebig mit deionisiertem Wasser gespült und anschließend bei 450 ° C für 6 Stunden gebacken. Loading Deckgläser in keramische Färbegestelle (siehe Reagenzien) vereinfacht diesen Prozess. </li><li> Protein-Lösung für Stanz. Rekonstituieren Fibronektin folgenden Anweisungen des Herstellers, um eine Stammlösung von 1 mg / ml Konzentration. </li></ol> 2. Cast Briefmarken aus der topologischen Meister Diese Schritte können durchgeführt werden, mehrere Tage im Voraus. Shop Briefmarken Muster-up in einer Schale mit Deckel, wie ein Gewebe Kulturschale. <ol><li> Entfernen Sie den Staub vom Meister mit einem Strom von Druckluft, gefilterte Luft oder Inertgas. </li><li> Setzen Sie den Meister, gemusterten Seite nach oben in den Boden einer Plastikschale nur größer als der Meister. 60 - oder 100-mm Gewebekulturschalen sind für diesen Zweck gut geeignet. </li><li> In einem Polystyrol 50 ml Zentrifugenröhrchen, kombinieren die Sylgard Komponenten in einem Verhältnis von Härter: Elastomer Basis von 1: 10 nach Gewicht. Nach gründlichem Mischen mit einem Kunststoff-Gerät, wie ein Einweg-Pipette. Bereiten Sie mindestens 0,2 ml aus Elastomer pro Quadratzentimeter Gericht Bereich. </li><li> Zentrifugieren Sie die 50 ml Tube mit 300 g für 5 min, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Gießen Sie das Elastomer über den Master, dann in einem Exsikkator Platz unter Vakuum für 30 Minuten. </li><li> Cure das Elastomer in einem Ofen bei 65 ° C für mindestens 2 Stunden. Aushärtung bei höheren Temperaturen und längeren Zeiten Ergebnisse in steifer Elastomer. Lassen Sie auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Separate das Blatt Briefmarken aus dem Master. </li></ol> 3. Mikrokontaktdruck von Fibronektin auf Glas <ol><li> Schneiden Sie einen einzigen Stempel. Briefmarken von 4 mm x 4 mm bis 1 cm x 1 cm groß und 1 bis 2 mm dick sind am einfachsten zu starten. Legen Sie Muster nach oben auf eine Glasplatte oder kleine Plastikschale. </li><li> Ort Stempel in einen Plasma-Reiniger und Verfahren unter Vakuum für 30 Sekunden. Ein Harrick Scientific Plasma-Reiniger (siehe Ausstattung), am höchsten Output Einstellung gesetzt wird machen die PDMS-Oberfläche hydrophil. Längere Zeiten führen zu Rissen des Elastomers. </li><li> Verdünnen Sie die Fibronektin-Lösung mit deionisiertem Wasser auf eine Stanz-Konzentration von 50 ug / ml. </li><li> Legen Sie einen kleinen Tropfen (10 bis 50 ul) von Stanz-Lösung auf den Stempel. Es wird über die hydrophile Oberfläche verteilt. Fügen Sie nur soviel Lösung, dass der Rückgang der Stempel deckt, aber nicht über die Kanten laufen. Lassen Protein adsorbieren für 5 Minuten zu stempeln. </li><li> Mit einem Kimwipe ® oder anderen sauberen Papiertuch, Docht aus die meisten der Protein-Lösung aus dem Stempel, ohne die strukturierten Gebiet. </li><li> Trocknen Sie die restliche Lösung aus der Stempel unter einem Strom von sauberen, trockenen, inerten Gas wie Stickstoff. </li><li> Mit Pinzette, entfernen Sie den Stempel aus der Glas-Objektträger, umzukehren, und in Kontakt mit dem gereinigten Deckglas (die Oberfläche strukturiert werden). Legen Sie ein Gewicht auf einen guten Kontakt zu fördern. Das spezifische Gewicht, dass die besten Strukturierung bietet, ist abhängig von den Stempel Größe und Muster; beginnen mit einem 5 g Gewicht und passen zwischen Stanzteile. Lassen Sie Stempel in Kontakt mit der Oberfläche für 1 Minute. </li><li> Vorsichtig zerlegen den Stack und separaten Stempel aus Deckglas. </li><li> Kräftig spülen gemusterten Deckglas in PBS, durch deionisiertes Wasser gefolgt, um Protein, das nicht an der Oberfläche adsorbiert ist zu entfernen. Dry Deckglas unter Stickstoffstrom. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Mikrokontaktdruck ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Strukturierung Molekülen auf Oberflächen. Dieser Prozess hat die Fähigkeit, Funktionen mit Abmessungen von zehn Mikrometern bis einigen hundert Nanometern zu schaffen; in Abb.. 1A, sind die Logos auf der linken Seite jeweils 200 pm in der Höhe, während die grünen Flecken in Abb. dargestellt. 1B 1 ​​um Durchmesser und Abstand bei 4 um Intervalle, gemessen von Mitte zu Mitte. Abb.. 1B zeigt auch eine leistungsfähige Immobilien Mikrokontaktprägen, nämlich, dass es ist und additiven Prozess. Mehrere Runden von Mikrokontaktdrucken kann eine einzelne Fläche in Mehrkomponenten-Systeme 3 erstellen angewendet werden. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Abbildung A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Abbildung B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Die Mikrokontaktdrucken Prozess ist konzeptionell einfach und sehr robust, dass die Strukturierung einer Vielzahl von Molekülen auf einer Vielzahl von Substraten aufgebracht. Allerdings bleibt dieser Prozess etwas wie eine Kunst. Die spezielle Geometrie des Musters erstellt werden soll, Eiweiß zu strukturierende, Auflagegewicht und Beschichtung / Stanzen Bedingungen wirken sich auf die Prägequalität. Zum Beispiel, zu wenig Gewicht, auf große Features, führt oft zu Lücken in der Muster wie in der oberen rechten Logo ersichtlich ist. 1A. Umge...

<table><tbody><tr><td>Plasmareiniger</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Trockenexsikkator</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Markierungs-Kit</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerhalter für Färbungen</td><td>Reagenz</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Reagenz</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Beugungsgitter</td><td>Reagenz</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrokontaktdrucken von proteinen für zellbiologie

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Die Fähigkeit, Muster Proteinen und anderen Biomolekülen auf Substrate ist für die Erfassung der räumlichen Komplexität der extrazellulären Umgebung wichtig. Entwicklung von Mikrokontaktdrucken durch die Whitesides Gruppe (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) In der Mitte der 1990er Jahre revolutioniert diesem Bereich, indem Mikroelektronik / Mikrofabrikationstechniken zugänglich Labors auf dem Gebiet Life Sciences fokussiert. Erste Implementierungen dieser Methode verwendet Polydimethylsiloxan (PDMS) Briefmarken, um Muster von funktionalisierten Chemikalien auf Materialoberflächen erstellen<sup&gt; 1</sup&gt;. Seitdem haben eine Reihe von innovativen Ansätzen, um Muster anderer Moleküle entwickelt worden, einschließlich Proteinen<sup&gt; 2</sup&gt;. Dieses Video zeigt den grundlegenden Prozess der Erstellung PDMS-Stempel und nutzt sie, um Muster Proteine, wie diese Schritte schwierig, genau in Worte zu fassen sind. Wir konzentrieren uns auf die Strukturierung der extrazellulären Matrix-Protein Fibronektin auf Deckgläschen als ein konkretes Beispiel der Musterung. Ein wichtiger Bestandteil des Mikrokontaktdrucken Prozess ist eine topologische Meister, von denen die Briefmarken abgegeben werden; das Heben und Senken Regionen der Meister in die Stempel gespiegelt und definieren die endgültige Muster. Typischerweise wird ein Kapitän eines Silizium-Wafers mit Fotolack beschichtet und dann strukturiert durch Photolithographie besteht, wie hier geschehen. Erstellung von Meistern, die ein bestimmtes Muster erfordert spezielle Ausrüstung und wird am besten in Absprache mit einem Fertigungszentrum oder Anlage angefahren. Allerdings kann fast jedes Substrat mit Topologie wie ein Meister, wie Kunststoff-Beugungsgitter (siehe Reagenzien für ein Beispiel) verwendet werden, und solche glückliche Meister geben leicht zugänglich, einfache Muster. Dieses Protokoll beginnt mit dem Punkt, der mit einem Master in der Hand.

Mikrokontaktdruck ausgiebig in die Muster von Proteinen und anderen Molekülen auf Materialoberflächen eingesetzt. Wir zeigen die wichtigsten Schritte dieses Prozesses, Stanz-Muster von Fibronektin auf Glas.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

Die Fähigkeit, Proteine und andere Biomoleküle auf Substraten zu patternen, ist entscheidend, um die räumliche Komplexität der extrazellulären Umgebung abzubilden.

Mikrokontaktdruck wird verwendet, um Proteine und andere Moleküle auf Materialoberflächen zu strukturieren und so die Komplexität extrazellulärer Umgebungen nachzubilden. Um mit dem Mikrokontaktdruck zu beginnen, wird zunächst eine topologische Vorlage hergestellt, und anschließend wird mittels weicher Lithographie ein Stempel aus dieser Vorlage aus Sylgard gegossen. Der Stempel kann mit einem Protein beschichtet und dann genutzt werden, um Proteine auf einer neuen Oberfläche aufzudrucken, an der Zellen haften können.Hallo, mein Name ist Chen. Ich komme aus dem Labor von Dr. Lance Camp im Fachbereich Biomedizinische Technik an der Columbia University. Hallo, ich bin GT aus dem Fachbereich Maschinenbau.Hallo, ich bin Lance Kem aus der Abteilung für Biomedizinische Technik an der Columbia University. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie Zellen auf komplexe Anordnungen von Proteinen in ihrer extrazellulären Umgebung reagieren. Es wurde Mitte der 1990er Jahre im Labor von George Whitesides entwickelt und hat sich zu einem weit verbreiteten und wertvollen Werkzeug entwickelt.Es gibt viele Variationen dieser Technik, aber heute werden G und Co U den gru

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Eine Beschreibung der Methoden benutzt, um einen HP DeskJet 500 Drucker in einen bioprinter konvertieren. Der Drucker verarbeiten kann lebende Zellen, die transiente Poren in der Membran bewirkt. Diese Poren können verwendet werden, um kleine Moleküle, einschließlich fluoreszierender G-Actin, in die gedruckte Zellen einzubauen.

Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Diese 3D-Mikrofluidik-Drucktechnologie druckt Arrays von Zellen auf untergetauchte Oberflächen.  Wir beschreiben, wie Arrays von Zellen mikrofluidisch in 3D-Durchflusszellen auf untergetauchte Oberflächen gebracht werden.  Durch das Bedrucken von submersen Oberflächen wurden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und die Beurteilung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

Zellkultursubstrate, funktionalisiert mit mikroskaligen Mustern biologischer Liganden, haben einen immensen Nutzen im Bereich des Tissue Engineering. Hier demonstrieren wir die vielseitige und automatisierte Herstellung von Gewebekultursubstraten mit mehreren, mikrostrukturierten Poly(ethylenglykol)-Bürsten und präsentieren orthogonale Chemien, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung von biologischen Liganden ermöglichen.

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Unser übergeordnetes Ziel ist es zu verstehen, wie Zellen extrazelluläre Hinweise spüren, die zu einem gerichteten axonalen Wachstum führen. Hier beschreiben wir die Methodik der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen, die verwendet wird, um definierte Mikromuster von extrazellulären Matrixkomponenten zu produzieren, um spezifische Ereignisse zu untersuchen, die das Axonwachstum und die Pfadfindung steuern.

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Lernen Sie das Mikrokontaktdrucken von Proteinen auf Oberflächen für die Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die präzise Musterung von Fibronektin auf Glas, um zelluläre Adhäsion zu untersuchen.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

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