Name: Menschliche In-Vivo Bioassay für die Tissue-Specific Messung von nozizeptiven und Entzündungsmediatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Mikrodialyse zur Gewinnung von Interstitialflüssigkeit aus entzündeter Haut nach experimentellem Sonnenbrand. Diese Methode ermöglicht die Analyse nozizeptiver und entzündungsvermittelnder Mediatoren in vivo.

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Induktion der experimentellen Entzündung: <ol><li> Eine Verwandte ersten Grades Sonnenbrand ist in nicht-gegerbten Haut eines Oberschenkels mit Hilfe eines kalibrierten, UV-B-Quelle (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Deutschland) induziert. Der Sonnenbrand ist 24 Stunden vor Beginn einer Mikrodialyse Experiment, indem die dreifache Menge an UVB-Licht notwendig, um vollständige Rötung der Haut ausgesetzt, oder Dreifache der minimalen Erythem-Dosis (MED) verursachen induziert. Die MED ist in jedem Fach vor Beginn der Studie bestimmt. Genaue Lieferung von Energie ist mit versichert, ein UV-Messgerät (RM 12, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Deutschland). </li></ol> Katheterplatzierung und Probenentnahme: <ol><li> Bereiten Sie eine Staging-Bereich mit sterilen Handschuhen, 1 sterile Nadel Halter, 1cc Luer-Spritze mit einer 23 Gauge (G) Nadel, 1ml Spritze mit einer 30G Nadel, 1% Lidocain, Alkoholtupfer, 2x2 steriler Gaze-Pads, Mikrodialyse-Katheter an einem angeschlossenen Ende mit einer 4cm 23G Nadel (Dermal Dialyse, Erlangen, Deutschland) und 1,5 ml Microcent Sammelröhrchen (E &amp; K Scientific, Santa Clara, CA.) mit 4μl Protease-Inhibitor-Lösung pro 100 &amp;mgr; l Probe auf Trockeneis. Protease-Inhibitor-Lösung pro Anweisungen des Herstellers mit Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). </li><li> Bereiten Sie eine 1% Humanalbumin-Lösung in Ringer-Laktat-Lösung und ziehen es in die 1cc Luer Spritze, so dass es keine Luftblasen bleiben in der Spritze. </li><li> Legen Sie die Spritze mit der 1% Humanalbumin angereicherte Laktat-Lösung Ringer in die Wiege (Mikrodialyse multi-Spritze Rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) auf eine hohe Präzision Infusionspumpe (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA montiert ). Stellen Sie sicher, dass die Bar der Infusionspumpe Fahren Sie die Spritze in vollem Kontakt mit dem Kolben der Spritze ist. Stellen Sie die Pumprate nach der Bestätigung, dass die Spritze Durchmesser wurde genau in die Pumpe eingegeben. Häufig verwendete Infusionsraten Bereich zwischen 2 bis 4μl/min. </li><li> Definieren Sie den Bereich, den Sie planen, Ihre Probe aus zu sammeln. Bei der Entnahme aus einer künstlich geschaffenen entzündeten Bereich, wie der Sonnenbrand oben beschriebenen Plan beim Einsetzen des Katheters an den Rand der Sonnenbrand. </li><li> Reinigen Sie einen kleinen Bereich an gegenüberliegenden Rändern der Läsion oder Website, die Sie beabsichtigen, Ihre Probe aus zu sammeln, mit Alkohol. Diese gereinigten Flächen wird die beabsichtigte Einführung und Ausspeisepunkte für den Katheter werden. Inject gerade genug Lidocain intra-kutan (belegt durch Ausbleichen der Haut an der Injektionsstelle) an diesen Stellen zu einem sehr kleinen Bläschen (maximal 2 mm) zu schaffen. Injection einer solchen begrenzten intra-kutane Lidocain bei der Ein-und Ausspeisepunkte des Mikrodialysekatheter sollte keinen Einfluss auf die Ergebnisse des Bioassays aber die Einführung des Katheters deutlich weniger schmerzhaft für Studienteilnehmer zu machen. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen, legen Sie die Mikrodialyse-Katheter mit Hilfe des beigefügten 23G Nadel über die Länge der erforschten Hautpartien. Die Eintauchtiefe ist an der Schnittstelle zwischen Cutis und Subcutis. Insertion in ausreichender Tiefe kann optisch überprüft werden. Wie die Nadel und der beigefügten Katheters verschoben werden sollte die Nadel führen ein kleines up-Faltung der Haut sowie einige Ausbleichen der Haut. Kein Ausbluten auftreten sollten. Wenn die Blutung auftritt bedeutet dies, dass die Nadel tiefer als beabsichtigt ist und sich die Eintauchtiefe muss angepasst werden. Sobald die Nadel durch den Ausstieg der Haut geschoben worden ist, spülen Sie die Katheter mit 1% Albumin angereichert Lactat-Lösung Ringer, bis Sie Tröpfchen entlang der Länge des Katheters zu sehen. Dies geschieht durch vorsichtiges Einführen der Nadel Ende einer Spritze (23G Nadel) in das distale Ende des Mikrodialysekatheter, und langsam injizieren Lösung getan. </li><li> Nach dem Spülen des Katheters vorsichtig auf die Nadel auf die beigefügte Katheter durch die Haut zu ernähren. Schonende Behandlung ist erforderlich, weil der Katheter mit kleinem Durchmesser und damit zerbrechlich sind. Ziehen Sie den Katheter, bis sie vollständig durch die Haut threaded, berührt also die Basis des größeren Kunststoffschlauch Einbettung der distale Ende des Katheters die Haut an der Eintrittsstelle. Wie bereits erwähnt, bestätigt wenig bis gar keine Blutungen am Ende des Verfahrens eine optimale Platzierung von Kathetern. </li><li> Befestigen Sie das distale Ende des Katheters an der Spitze der 23G Nadel der Spritze Ruhe in das Rack der Infusionspumpe. Pflege erforderlich ist, um zu vermeiden Durchstechen der Nadel durch die Wand des Katheters, wäre die Ursache möglichen Leckagen. </li><li> Schneiden Sie die Nadel aus dem proximalen Ende des Katheters. </li><li> Mit ¼-Zoll-rosa Band, bringen Sie die vorbereiteten 1.5ml Microcent Sammelrohr an der Haut in der Nähe der Austrittsstelle des Katheters. Setzen Sie die Spitze des Katheters in die Sammlung Schlauch Sammlung von Mikrodialysat ermöglichen. Starten Sie den Perfusionspumpe an vorgegebenen raß und zeitweise prüfen, ob angeliefert und abgeholt Volumen übereinstimmen. Bei den Bänden nicht übereinstimmen, Leckage von der Haut entry site sollte ausgeschlossen werden (Sie können auch durch Ziehen der Teil des Katheters, die durch den Kunststoffschlauch eingebettet ist mehr fest auf der Haut Eintrag Ort behoben werden). Alternativ kann ein Katheter ersetzt werden müssen, wenn geliefert und Sammelbänden nicht übereinstimmen. </li><li> Nach Probenahme abgeschlossen ist, werden die Proben auf Trockeneis, bis Lagerung bei -80 º C gelegt </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der kombinierte Einsatz von Mikrodialyse Techniken und Multiplex-Immunoassay-Technologie ist eine wertvolle real-time, in-vivo-Bioassay Menschen einen Einblick in biochemische Vorgänge in Gewebe von Interesse. Kombiniert mit Verhaltenstests wie Schmerzen Tests erlaubt das Verfahren die Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen von Biochemikalien Vermittlung von Schmerzen und Entzündungen. Die Methode ist für 1 vielversprechend) identifiziert Gewebe spezifische Biomarker Vermittlung von Schmerzen und Entzündungen, 2) die Bereitstellung mec...

<table><tbody><tr><td>Microdialyseskatheter</td><td>Werkzeug</td><td>Dermale Dialyse</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pumpe 22</td><td>Werkzeug</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Werkzeug</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RM-12 IP-65 Radiometer</td><td>Werkzeug</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Vollständiger Proteaseinhibitor</td><td>Reagenz</td><td>Roche-Gruppe</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumin 5 %</td><td>Reagenz</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ringer-Laktatlösung</td><td>Reagenz</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocain-MPF</td><td>Sonstiges</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 1 mL</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

menschliche in-vivo bioassay für die tissue-specific messung von nozizeptiven und entzündungsmediatoren

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Diese in-vivo menschlichen Bioassay kann zur menschlichen Probanden und Patienten zu untersuchen. Die Proben werden von einschlägigen Gewebe-Sites wie die Haut über aseptisch eingefügt Mikrodialyse-Katheter (Dermal Dialyse, Erlangen, Deutschland) gesammelt. Illustrated in diesem Beispiel ist die Sammlung der interstitiellen Flüssigkeit aus experimentell entzündete Haut in menschlichen Freiwilligen. Probenentnahme kann mit anderen experimentellen Untersuchungen kombiniert werden. Zum Beispiel bietet die gleichzeitige Beurteilung von lokal freigesetzt Biochemikalien und subjektive Empfindlichkeit auf Schmerzreize in experimentell entzündete Haut der kritischen biochemischen Verhaltens-Link, um Biomarker von Schmerzen und Entzündungen zu identifizieren. Präsentiert Assay im lebenden menschlichen Organismus ermöglicht mechanistische Einblicke in Gewebe-spezifischen Prozessen zugrunde liegenden Schmerzen und / oder Entzündung. Das Verfahren ist auch gut geeignet, um die Wirksamkeit der bestehenden oder neuen Interventionen zu untersuchen - wie neue Wirkstoffkandidaten - gezielt zur Behandlung von schmerzhaften und / oder entzündlichen Zuständen. Dieser Artikel wird eine detaillierte Beschreibung über die Verwendung der Mikrodialyse-Techniken für die Erhebung der interstitiellen Flüssigkeit aus experimentell entzündete Haut Läsion des menschlichen Probanden liefern. Interstitiellen Flüssigkeit Proben sind in der Regel mit Hilfe von Multiplex-Bead Immunoassays ermöglicht Testen von bis zu 100 Analyten in Proben so klein im Volumen von 50 Mikroliter verarbeitet.

Eine Technik ist für die in-vivo-Sammlung der interstitiellen Flüssigkeit Proben aus relevanten Gewebe Seiten (hier experimentell entzündete Haut) für die Messung von Biochemikalien Vermittlung von Schmerzen und Entzündungen vor.

Menschliche In-Vivo Bioassay für die Tissue-Specific Messung von nozizeptiven und Entzündungsmediatoren

Dieser In-vivo-Human-Bioassay kann zur Untersuchung von menschlichen Probanden und Patienten eingesetzt werden. Proben werden von relevanten Gewebestellen wie der Haut mittels ... entnommen.

Dieses Video beginnt 24 Stunden nach der Induktion einer experimentellen Sonnenbrandreaktion am Oberschenkel eines Patienten mithilfe einer kalibrierten UV-Lichtquelle. Nach Applikation eines Lokalanästhetikums wird ein Mikrodialysiskatheter zwischen die Schnitte und subku eingeführt und anschließend durch die Haut gezogen. Eine Perfusionspritze wird am proximalen Ende des Katheters befestigt, und die Aktivierung der Perfusionspumpe bewirkt den Fluss und die Sammlung des Mikrolystats.Die gesammelten Proben können bis zur Analyse von nozizeptiven und entzündlichen Mediatoren bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Hallo, ich bin Martin Angst aus der Abteilung für Anästhesiologie der Stanford University. Und hallo, ich bin Martha Tingle, leitende Forschungskrankenschwester und Leiterin des Human Pain Laboratory, das Dr. Angst 1995 hier an der Stanford University gegründet hat.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Platzierung von Mikrodialysenkathetern in experimentell entzündeter Haut menschlicher Studienteilnehmer zur Gewinnung von Interstitialflüssigkeit. In unserem Labor verwenden wir diese Technik, um die gewebespezifische Freisetzung biochemischer Substanzen zu untersuchen, die für die Vermittlung von Schmerz und Entzündung entscheidend sind. Beginnen wir also.Ein Modell für experimentelle Hautentzündung ist der künstliche Sonnenbrand. Mithilfe einer kalibrierten Ultraviolett-B-Quelle wird ein Sonnenbrand ersten Grades erzeugt. Die genaue Abgabe der Energie wird mit einem UV-Messgerät sichergestellt.Sonnenschäden werden typischerweise durch die Anwendung von zwei bis drei Mal der Menge an UVB-Licht induziert, die notwendig ist, um Rötungen hervorzurufen. Bevor die Proben gesammelt werden, bereiten Sie einen Arbeitsbereich mit sterilen Handschuhen, einer sterilen Nadelhalterung und einer 1-ml-Luer-Spitzen-Spritze mit 23-Gauge- und 30-Gauge-Nadeln vor. Außerdem benötigen Sie Mikrodialyseskatheter, die an einem Ende mit einer 4 cm langen 23-Gauge-Nadel verbunden sind. Die Proben werden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, die vier Mikroliter Proteaseinhibitorlösung pro 100-Mikroliter-Probe enthalten. Die Proteaseinhibitorlösung wird gemäß Herstelleranweisung unter Verwendung von Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten hergestellt. Bereiten Sie eine 1-%-Humanalbuminlösung in Ringer-Laktatlösung vor, und ziehen Sie diese in die 1-ml-Luer-Spitzen-Spritze auf, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Luftblasen in der Spritze verbleiben. Befüllen Sie die Spritze mit der 1-%-Humanalbumin-haltigen Ringer-Laktatlösung in die Halterung, die an einer hochpräzisen Infusionspumpe befestigt ist. Mehrere Spritzen können geladen werden, um gleichzeitig Interstitialflüssigkeitsproben aus verschiedenen Stellen zu gewinnen.Stellen Sie sicher, dass die Stange der Spritzenpumpe, die den Kolben antreibt, vollständig mit dem Kolben der Spritze in Kontakt steht. Stellen Sie die Pumprate ein, nachdem Sie überprüft haben, dass der Spritzendurchmesser korrekt in die Pumpe eingegeben wurde. Übliche Infusionsraten liegen zwischen zwei und vier Mikrolitern pro Minute.Jetzt sind Sie bereit, den Katheter vor der Katheterplatzierung einzusetzen. Bei der Probenahme aus einem künstlich erzeugten entzündeten Bereich, wie beispielsweise einer experimentell induzierten Sonnenbrandstelle, muss der Bereich, aus dem Proben entnommen werden, genau festgelegt werden. Planen Sie die Einführung des Katheters am Rand der Sonnenbrandstelle ein.Reinigen Sie einen kleinen Bereich an gegenüberliegenden Rändern der Läsion oder des C-Sites, von dem Sie Ihre Probe entnehmen möchten, mit Alkoholtupfern. Diese gereinigten Bereiche dienen als vorgesehene Einstich- und Austrittsstellen für den Katheter. Injizieren Sie mit einer Ein-Kubikzentimeter-Spritze und einer 30-Gauge-Nadel 1 %iges Lidocain, erkennbar am Aufquellen der Haut nach der Injektion. Geben Sie gerade so viel Lidocain an diesen Stellen ab, dass ein sehr kleiner Bläschen entsteht, dessen maximale Größe zwei Millimeter beträgt. Die Injektion einer geringen Menge Lidocain an den Eintritts- und Austrittsstellen des Mikrodialysenkatheters macht die Katheterplatzierung für die Probanden weniger schmerzhaft, sollte jedoch die Ergebnisse der Bioanalyse nicht beeinflussen, unter Einhaltung aseptischer Techniken.Führen Sie die Mikrodialyseskatheter mithilfe der beigefügten Nadel mit 23 Gauge über die Länge des untersuchten Hautareals ein. Die Eindringtiefe liegt an der Grenzfläche zwischen der Haut und dem Unterhautgewebe. Eine ausreichende Penetration kann visuell überprüft werden, während die Nadel und der damit verbundene Katheter vorwärts bewegt werden.Die Nadel sollte eine leichte Aufwärtsfaltung der Haut sowie eine leichte Blässe der Haut verursachen. Es sollte kein Bluten auftreten; falls Bluten auftritt, befindet sich die Nadel tiefer, als beabsichtigt, und die Eindringtiefe muss angepasst werden.Nachdem die Nadel durch die Austrittsstelle der Haut gestoßen wurde, ziehen Sie vorsichtig an der Nadel, um den angeschlossenen Katheter durch die Haut zu führen. Ein schonendes Vorgehen ist entscheidend, da die Katheter einen geringen Durchmesser haben und sehr empfindlich sind. Ziehen Sie den Katheter, bis er vollständig durch die Haut hindurchgeführt ist, die die Basis des größeren Kunststoffrohrs bildet.Das distale Ende des Katheters sollte die Haut an der Einstichstelle berühren. Erneut sollte kaum bis kein Bluten auftreten, was darauf hinweist, dass der Katheter korrekt positioniert wurde. Um die Probenentnahme zu beginnen, spülen Sie die Katheter zunächst mit einer Ringerverschen-Lösung, die mit 1 % Albumin angereichert ist.Dies erfolgt durch vorsichtiges Einführen einer Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel in das distale Ende des Mikrodialysiskatheters und langsames Injizieren der Lösung. Spülen Sie den Katheter, bis Tropfen entlang der gesamten Länge des Katheters sowie an seiner Spitze sichtbar sind. Nach dem Spülen befestigen Sie das distale Ende des Katheters an der Spitze der 23-Gauge-Nadel der Spritze, die in der Halterung der Infusionspumpe ruht.Vermeiden Sie es, mit der Nadel durch die Wand des Katheters zu stechen, da dies zu einem potenziellen Austritt führen könnte, wenn ein 6-mm-breites rosa Klebeband verwendet wird. Befestigen Sie die vorbereitete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugen-Sammelröhrchen an der Haut in der Nähe der Austrittsseite des Katheters. Führen Sie die Katheterspitze in das Sammelröhrchen ein, um die Sammlung des Mikrolysat zu ermöglichen.Starten Sie die Perfusionspumpe mit der vorbestimmten Rate und überprüfen Sie intermittierend, ob das abgegebene und das gesammelte Volumen übereinstimmen, falls die Volumina nicht übereinstimmen. Prüfen Sie, ob eine Leckage an der Einstichstelle der Haut vorliegt. Lecks an der Einstichstelle können manchmal behoben werden, indem der Teil des Katheters, der durch das Plastikrohr fixiert ist, fester auf die Haut-Einstichstelle gezogen wird.Alternativ muss ein Katheter möglicherweise ersetzt werden, wenn die abgegebenen und gesammelten Volumina nach Abschluss der Probenahme nicht übereinstimmen. Die Proben werden auf Trockeneis aufbewahrt, bis sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Interstitialflüssigkeit aus experimentell entzündeter Haut mithilfe von Mikrodialysenkathetern gewinnt. Nun sind wir bereit, die gewonnenen Proben mittels Immunassays auf biochemische Marker für Schmerz und Entzündung zu analysieren. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, die Katheter äußerst vorsichtig zu handhaben, sie langsam voranzubewegen, dabei die Spannung an der Schlauchleitung zu vermeiden, und es kann hilfreich sein, die Katheter vor der Insertion leicht mit der sterilen Lösung zu benetzen, die Sie für die Infusionsphase der Studie vorbereitet haben.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biologie

Eine Technik zur Erfassung und Messung Operationswunde biochemischen Mediatoren zu bestimmten Zeitpunkten.

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Bestimmen Hitze und mechanische Schmerzschwelle in entzündeten Haut von Probanden

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