Name: Drosophila Larven NMJ Dissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Larven für die Immunhistochemie und Bildgebung der neuromuskulären Synapse. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Neurobiologie.

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Bevor Sie beginnen <ol><li> Alle Kulturen sollten bei 25 ° C gezüchtet werden </li><li> HL3.1 Dissektion Puffer kann im Voraus zubereitet werden. Nehmen Sie einen 50 ml Aliquot HL3.1 und bewahren Sie es auf Eis. </li><li> Bereiten Sie 15 ml frischer 3,5% Formaldehyd in HL3.1. Halten Sie es auf Eis. </li></ol> Larven Dissection <ol><li> Gib einen Tropfen des kalten HL3.1 auf der Dissektion Platte. Dies wird das Tier vor dem Austrocknen und betäuben das Tier macht es einfacher, mit der Arbeit zu halten. </li><li> Mit dem langen Pinzette, wählen Sie eine Wanderung dritten Larvenstadium Larve und legen Sie sie in den Tropfen HL3.1. </li><li> Verwenden Sie zunächst kurz Pinzette zu einem minutien pin zu erfassen. Legen Sie den Stift zwischen den hinteren Luftlöcher. Das Tier wird in der Regel versuchen, kriechen vom Stift erstreckt sich aus und macht es einfacher für Sie, einen Stift direkt in den Kopf der Larve der Nähe der Mündung Haken. Stretch das Tier in die Länge. Dies wird Ihnen helfen zu maximieren die Menge des exponierten Körpers Wand Sie beim Schneiden erreichen können. Hinweis: Wenn Sie auf den Kopf ersten Stift zu wählen, kann das Tier seinen Körper um den Stift wickeln oder Peitsche seinen Körper hin und her macht es schwierig, pin. Sie können in der Regel dem entgegenzuwirken, indem die HL3.1 und setzen ein frisches, kaltes Tropfen betäubt das Tier wieder. Die Rechts-und Linkshänder Wissenschaftler können auch einfach packen das Tier und halten es fest. </li><li> Mit Feder Schere einen horizontalen Schnitt knapp vor den hinteren Pin auf der Rückenseite der Larve. Legen Sie ein Blatt der Schere in den Schnitt und einen vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des rostralen Ende der Larve. Auf der Tribüne des Tieres machen horizontale Schnitte, die links und rechts des Stiftes. Hinweis: das fertige Ergebnis sollte wie ein I auf der Rückenseite der Larve entlang der rostrokaudalen Achse betrachten. </li><li> Entfernen Sie den Organen. Beginnen Sie, indem Sie einige zusätzliche Tropfen HL3.1 auf die Larve. Dies ermöglicht es den Organen zu schweben aus dem Körper so dass Sie diese viel leichter zu entfernen. Entfernen Sie zuerst den Tracheen. Zweitens nutzen die Zange, um den Rest der Organe zu packen und zu entfernen. </li><li> In Schritt 3 Sie machte eine linke Klappe und rechte Klappe in die Wand des Körpers. Pin die Klappen im Uhrzeigersinn achten Sie darauf, die Wand des Körpers sowohl horizontal als auch vertikal zu strecken. </li></ol> Fixierung Fix jedes Tier in 3,5% Formaldehyd in HL3.1 für 25 Minuten. Waschen Sie die Tiere zweimal in HL3.1 für 5 Minuten. Lagerung Entfernen Sie die Stifte und übertragen die Larven in ein 1,5 ml Röhrchen mit 1X PBS. Wenn Sie zum Bild der NMJ mit verschmolzen fluoreszierenden Markierungen planen, sollten Sie Bild der Tiere innerhalb von zwei Tagen. Sie sind berechtigt, die seziert Larven bis zu einer Woche bei 4 ° C. Repräsentative Ergebnisse Es gibt mehrere wichtige Komponenten, um ein richtig seziert Drosophila Larve. Zuerst muss man besonders vorsichtig nicht zu den Muskeln, vor allem Muskeln 4, 6 und 7 führen. Dies sind die beliebtesten Muskeln zu studieren und wenn sie beschädigt sind zu verwerfen das Filet prep und sezieren ein anderes Tier. Zweitens muss man darauf achten, dass das Tier maximal ist so gespannt, dass jeder Muskel und NMJ unterschieden werden können.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Die Dissektionstechnik in diesem Video gezeigt, kann zur Drosophila-Larven für eine Vielzahl von experimentellen Techniken vorzubereiten. Wenn fluoreszierende Protein-Tags vorhanden sind, können die Larven montiert und abgebildet sofort. Ansonsten kann Immunfärbung durchgeführt, um spezifische synaptische Fächer zu markieren. Darüber hinaus können Elektrophysiologie leicht auf der präparierten Larven durchgeführt werden, um das Funktionieren der Neurotransmission zu bewerten. Die NM...

HL3 Dissection Buffer: (in mm) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 Trehalose, 115 Saccharose und 5 HEPES, pH 7,3.<br /<br /&gt; Sylgard Dissecting Plate: Vorsichtig mischen (um Blasen zu vermeiden) 10:1 in ein Becherglas. Die Mischung in Petrischale (jeglicher Größe). Lassen Sylgard zu heilen über Nacht in 37C Inkubator.

drosophila larven nmj dissection

Drosophila Larval NMJ Dissection

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität eingesetzt. Die weit verbreitete Verwendung des<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor-System ist aufgrund seiner hohen Verfügbarkeit. Es kann mit Single-Cell-Auflösung analysiert werden. Es gibt 30 Muskeln pro hemisegment deren Anordnung innerhalb des peripheren Körper Wand bekannt sind. Insgesamt 35 Motoneuronen, diese Muskeln legen in ein Muster, das high fidelity hat. Mit Molekularbiologie und Genetik, kann man transgene Tiere oder Mutanten. Dann kann einer Studie der Entwicklung Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der NMJ. Um die NMJ für das Studium zuzugreifen, ist es notwendig, sorgfältig zu sezieren jeder Larve. In diesem Artikel zeigen wir, wie man richtig zerlegen<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven für das Studium der NMJ indem alle inneren Organe, während die Körper Wand intakt. Diese Technik eignet sich Larven für die Bildgebung, Immunhistochemie oder Elektrophysiologie vorzubereiten.

Dieses Protokoll zeigt, wie Sie sezieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Vorbereitung für die Immunhistochemie und / oder die Abbildung der neuromuskulären Synapse.

Drosophila Larven NMJ Dissection

Die neuromuskuläre Endplatte (NMJ) von Drosophila ist ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität. Die weite Verbreitung ...

Dieses Verfahren beginnt damit, dass man eine Larve des dritten Larvenstadiums auf die Präparationsplatte legt. Nadeln werden an den hinteren und vorderen Enden der Larve platziert. Mit einer Schere wird die Larve geöffnet und mit einer Pinzette werden die inneren Organe entfernt.Schließlich werden an jeder Ecke der Körperwand der Larve vier weitere Nadeln angebracht, um sie während der Fixierung straff zu halten. Hallo, ich bin Jonathan Brent aus dem Labor von Brian McCabe am Department für Physiologie und biophysikalische Wissenschaften am College of Physicians and Surgeons der Columbia University. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Dissektion von Drosophila-Larven und MJ.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die synaptische Entwicklung der neuromuskulären Junction zu untersuchen. Beginnen wir also. Bei Drosophila-Larven gibt es 30 Muskeln pro Hemi-Segment, deren Anordnung in der peripheren Körperwand bekannt ist.Insgesamt innervieren 35 Motoneurone diese Muskeln in einem hochgradig stereotypen Muster. Um die neuromuskuläre Junction oder NMJ zugänglich zu machen, ist es notwendig, jede Larve mit einer geeigneten Dissektion sorgfältig zu präparieren. Die NMJ kann für die Bildgebung mittels Immunhistochemie oder für elektrophysiologische Untersuchungen verwendet werden.Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie einen Tropfen HL-3.1-Puffer auf eine Dissektionsplatte geben. Der Puffer wird im Voraus hergestellt und auf Eis abgekühlt. Wählen Sie vorsichtig eine wandern­de Drittinstar-Larve von der Seite des Gefäßes mit großen Edelstahl-Forceps aus.Die Bewegung zeigt an, dass die Larve noch nicht in die Verpuppung eingetreten ist. Legen Sie die Larve mit der dorsalen Seite nach oben in den Puffertröpfchen auf der Präparationsplatte. Der kalte Puffer wird die Larve betäuben und sie mit Hilfe einer Pinzette ruhig halten. Platziere einen Mnuchin-Stift zwischen den hinteren Sphären, dann einen zweiten Stift nahe den dunklen Mundhaken, sodass die Larve gestreckt ist und zum Öffnen bereitsteht.Erstellen Sie mit einer Feder-Schere einen kleinen horizontalen Schnitt in Richtung des hinteren Endes der Larven. Führen Sie eine Klinge der Schere in den Sci ein und führen Sie einen Längsschnitt in Richtung des vorderen Endes der Larve aus. Anschließend führen Sie horizontale Schnitte am vorderen Ende der Larven links und rechts der Nadel durch.Um Organe wie den Darm zu entfernen, geben Sie mehrere Tropfen HL-3.1-Puffer zum Tier hinzu; der Darm und andere Organe steigen in die Lösung auf und können mit einer Pinzette vom Körper abgezogen werden. Entfernen Sie ebenfalls das Tracheensystem zusammen mit den anderen Organen. Legen Sie nun die inneren Körpermuskeln frei, indem Sie die durch die Schnitte entstandenen Klappen zurückklappen und mit Nadeln fixieren.Strecken Sie die Körperwände unbedingt horizontal und vertikal auseinander, während Sie die Klappen fixieren. Entfernen Sie alle verbleibenden Organreste und spülen Sie einmal ab. Indem frischer HL-3,1-Puffer hinzugegeben wird, ist die Larve nun bereit, mit frisch hergestelltem Formaldehyd fixiert zu werden, das in einem XPBS auf 3,5 % verdünnt wurde; die Larven und das Fixativ vollständig eintauchen lassen und 25 Minuten warten. Nach Ablauf der Fixierungszeit die Larven zweimal mit HL-3,1-Puffer jeweils drei Minuten lang waschen. Die Nadeln vorsichtig entfernen und die Larven bei Bedarf in 1,5-ml-Röhrchen mit einem XPBS überführen.Die Larven können bis zu zwei Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für optimale Ergebnisse sollten die präparierten Larven sofort verwendet werden. Es gibt mehrere wichtige Bestandteile einer korrekt präparierten Drosophila-Larve.Zunächst ist darauf zu achten, die Muskeln nicht zu beschädigen, insbesondere die Muskeln sechs, sieben und vier. Zweitens muss das Tier richtig ausgestreckt sein. Andernfalls ist die neuromuskuläre Verbindung möglicherweise nicht zugänglich oder unterscheidbar.Hier sehen Sie eine korrekt präparierte Larve. Die neuromuskuläre Junction ist deutlich sichtbar und das System ist nun bereit für Experimente. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Larve des Ösophagus präpariert, um die neuromuskuläre Junction zu untersuchen.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Muskeln intakt zu lassen. Wenn die Muskeln beschädigt werden, gibt es keine neuromuskulären Junctions, die untersucht werden könnten. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

In diesem Artikel werden wir zeigen, wie das zentrale Nervensystem aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll zeigt, wie Immunhistochemie auf seziert Drosophila Larve führen.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Drosophila melanogaster-Larven bieten ein ideales Modellsystem, um die Mechanismen der axonalen Transport innerhalb Larven segmentalen Nerven zu untersuchen. Mit diesem Verfahren können 3 rd Larvenstadium, die verschiedene Mutationen zu Wildtyp-Larven verglichen werden.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Betäubung und Bildgebung von...

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

In situ Patch Clamp Messungen sind für elektrophysiologische Charakterisierung von Neuronen im intakten Schaltung verwendet. In der Drosophila genetische Modell Patch-Clamp ist schwierig, weil das ZNS ist klein und umgeben von einer robusten Hülle. Dieser Artikel beschreibt die Vorgehensweise, um die Scheide und sauber Neuronen für nachfolgende Patch Clamp Messungen entfernen.

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

Morphologie, Größe und Lage intrazellulärer Organellen sind evolutionär konserviert und scheinen ihre Funktion direkt zu beeinflussen. Die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen, ist zu einem wichtigen Ziel der modernen Biologie geworden. Hier zeigen wir, wie diese Studien durch die Anwendung quantitativer Techniken erleichtert werden können.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Hier beschreiben wir eine einfache und weit zugängliche Methode, um die Segmentnerven in Drosophila- Larven zu verletzen, um die Neurodegeneration von motorischen Neuronen an der neuromuskulären Kreuzung (NMJ) der dritten Larven der Larven zu visualisieren und zu quantifizieren.

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

Wir beschreiben eine Dissektionstechnik, die die Architektur der neuromuskulären Verbindung bewahrt und eine detaillierte immunzytochemische Untersuchung von Motoneuronen im adulten Drosophila-Bein ermöglicht.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Larven für die Immunhistochemie und Bildgebung der neuromuskulären Synapse. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Neurobiologie.

Drosophila Larven NMJ Dissection

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