Drosophila Larven NMJ Dissection
4. Februar 2009
Dieses Protokoll zeigt, wie Sie sezieren Drosophila Larven in Vorbereitung für die Immunhistochemie und / oder die Abbildung der neuromuskulären Synapse.
Dieses Verfahren beginnt mit dem Platzieren einer dritten Larve im Stadium auf der Sezierplatte. Stecknadeln werden in das hintere und vordere Ende der Larven gesteckt. Mit einer Schere werden die Larven aufgeschnitten und mit einer Pinzette die inneren Organe entfernt.
Zum Schluss werden in jeder Ecke der Larvenkörperwand vier weitere Stifte platziert, um sie während der Fixierung straff zu halten. Hallo, ich bin Jonathan Brent vom Labor von Brian McCabe in der Abteilung für Physiologie und Solo-Biophysik am Columbia University College of Physicians and Surgeons. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Dissektion von Drosophila-Larven und MJ.
Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die synaptische Entwicklung der neuromuskulären Verbindung zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Bei Drosophila-Larven gibt es 30 Muskeln pro Hemisegment, deren Anordnung innerhalb der peripheren Körperwand bekannt ist.
Insgesamt 35 Motoneuronen innervieren diese Muskeln in einem stark stereotypen Muster. Um Zugang zur neuromuskulären Verbindung oder NMJ zu erhalten, ist es notwendig, jede Larve sorgfältig zu präparieren und richtig zu dissektionieren. Das NMJ kann zur Bildgebung der Immunhistochemie oder Elektrophysiologie verwendet werden.
Beginnen Sie den Vorgang, indem Sie einen Tropfen HL 3.1 Puffer auf eine Sezierplatte geben. Der Puffer wird im Voraus hergestellt und auf Eis gekühlt. Nimm vorsichtig eine wandernde Larve des dritten Endsterns mit einer großen SS-Pinzette von der Seite des Fläschchens.
Die Bewegung zeigt an, dass die Larven nicht in die Verpuppung eingedrungen sind. Legen Sie die Larven mit der Rückenseite nach oben in den Puffertropfen auf der Sezierplatte. Der kalte Puffer betäubt die Larven und hält sie mit einer Pinzette ruhig. Platzieren Sie eine Mnuchin-Nadel zwischen den hinteren Kugeln, dann platzieren Sie eine zweite Nadel in der Nähe der dunklen Maulhaken, so dass die Larven ausgestreckt und bereit sind, sich zu spreizen.
Machen Sie mit einer Federschere einen kleinen horizontalen Schnitt in Richtung des hinteren Endes der Larven. Führen Sie eine Klinge der Schere in den Sci ein und machen Sie einen Längsschnitt in Richtung des vorderen Endes der Larve. Machen Sie dann horizontale Schnitte am vorderen Ende der Larven links und rechts von der Stecknadel.
Um Organe wie den Darm zu entfernen, geben Sie einige Tropfen HL 3.1 Puffer in das Tier, der Darm und andere Organe schwimmen in die Lösung und können mit einer Pinzette vom Körper weggezogen werden. Entfernen Sie auch das Trachealsystem mit den anderen Organen. Legen Sie nun die inneren Körpermuskeln frei, indem Sie die durch die Schnitte entstandenen Lappen zurückstecken.
Achten Sie darauf, die Körperwände horizontal und vertikal zu öffnen. Beim Feststecken der Klappen. Entfernen Sie alle restlichen Organteile und waschen Sie sich einmal.
Durch Zugabe von frischem HL 3.1-Puffer ist die Larve nun bereit, mit frisch hergestelltem Formaldehyd, verdünnt auf 3,5%, fixiert zu werden. Tauchen Sie die Larven und das Fixiermittel vollständig ein und warten Sie 25 Minuten. Wenn die Fixierzeit abgelaufen ist, waschen Sie die Larven zweimal drei Minuten lang mit HL 3.1 Puffer. Entfernen Sie vorsichtig die Stifte und geben Sie die Larven bei Bedarf in 1,5-mil-Röhrchen, die ein XPBS enthalten.
Die Larven können bis zu zwei Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für ein optimales Ergebnis verwenden Sie die präparierten Larven sofort. Es gibt mehrere Schlüsselkomponenten für eine richtig sezierte Drosophila-Larve.
Achten Sie zunächst darauf, die Muskeln nicht zu beschädigen, insbesondere die sechs, sieben und vier. Zweitens muss das Tier richtig ausgestreckt sein. Andernfalls ist die neuromuskuläre Verbindung möglicherweise nicht zugänglich oder unterscheidbar.
Hier sieht man eine ordentlich sezierte Larve. Das NMJ ist gut sichtbar und das System ist nun bereit für Experimente. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Speiseröhrenlarven sezieren können, um die neuromuskuläre Verbindung zu untersuchen.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Muskeln intakt zu führen. Wenn die Muskeln geschädigt sind, gibt es keine neuromuskulären Verbindungen, die untersucht werden müssen. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll zeigt, wie man Drosophila-Larven präpariert, um sie für die Immunhistochemie und/oder die Abbildung der neuromuskulären Verbindung vorzubereiten. Das Verfahren beinhaltet ein sorgfältiges Positionieren von Nadeln sowie die Verwendung von Schere und Pinzette, um die Larven für weitere Analysen vorzubereiten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Drosophila-Larven werden häufig in neurobiologischen Studien verwendet.
- Die neuromuskuläre Verbindung ist ein entscheidender Bereich zur Untersuchung der synaptischen Übertragung.
- Einwandfreie Dissektionstechniken sind entscheidend für eine erfolgreiche Bildgebung und Analyse.
- Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode für die Larvaldissektion bereit.
Zweck der Studie
- Vorbereitung von Drosophila-Larven für die immunhistochemische Analyse.
- Vereinfachung der Bildgebung der neuromuskulären Verbindung.
- Standardisierung von Dissektionsmethoden zur Reproduzierbarkeit in der Forschung.
Verwendete Methoden
- Platzierung der Nadeln zur Stabilisierung der Larven während der Dissektion.
- Verwendung von Scheren, um die Larven zu öffnen.
- Entfernung der inneren Organe mit einer Pinzette.
- Fixierung der Körperwand zu Abbildungszwecken.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Dissektion ermöglicht die klare Visualisierung der neuromuskulären Verbindung.
- Standardisierte Methoden verbessern die Konsistenz zwischen Experimenten.
- Erleichtert weitere Untersuchungen zur synaptischen Funktion und Entwicklung.
- Bietet eine Grundlage für zukünftige Forschung in der Drosophila-Neurobiologie.
Schlussfolgerungen
- Die Dissektion von Drosophila-Larven ist ein entscheidender Schritt für die neurobiologische Forschung.
- Richtige Techniken verbessern die Qualität der immunhistochemischen Analyse.
- Dieses Protokoll stellt eine wertvolle Ressource für Forscher auf diesem Gebiet dar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die neuromuskuläre Junction (NMJ) der Drosophila-Larve dient als genetisch zugängliches Modell zur Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität und bietet eine hohe Zugänglichkeit sowie Einzelzellauflösung. Dieses Präparationsprotokoll ermöglicht die reproduzierbare Aufbereitung der NMJ für nachgeschaltete Anwendungen wie Bildgebung, Immunhistochemie und Elektrophysiologie und unterstützt so die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Durch die Bereitstellung einer standardisierten Methode zur Isolierung und Visualisierung synaptischer Strukturen erhöht das Verfahren das Vorhersagevertrauen bei der neurobiologischen Zielstrukturbeurteilung und der Aufklärung von Signalwegen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit synaptischen Funktionen und neurodevelopmentalen Wegen verbunden sind.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch hochpräzise Visualisierung der Innervationsmuster zwischen Motoneuronen und Muskulatur.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Beurteilung genetischer oder pharmakologischer Interventionen hinsichtlich der NMJ-Morphologie und -Funktion.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet standardisierte biologische Systeme für die Wirkstoff-Screening mit konsistenter Zugänglichkeit der neuromuskulären Junction (NMJ) vor.
- Quantitative Auswertung: Ermöglicht die Messung der Anzahl und Größe synaptischer Boutonen sowie der Proteinlokalisation als phänotypische Endpunkte.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die parallele Verarbeitung von Larven für Screening-Kampagnen mit mittlerer Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert konservierte synaptische Mechanismen, die für die Validierung von Zielstrukturen bei neurodegenerativen und neuromuskulären Erkrankungen relevant sind.
- Translationale Kontinuität: Verbindet genetische Befunde aus Drosophila mit der synaptischen Biologie von Säugetieren über konservierte Signalwege.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Ermöglicht die frühe Bewertung der Zielstrukturenbindung und der Modulation von Signalwegen in einem lebenden, intakten System.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Dissektionsworkflow integriert sich in die frühe Entdeckungsphase, indem er Hypothesentests ermöglicht, führt über zur Identifizierung von Leitstrukturen anhand quantifizierbarer synaptischer Phänotypen und unterstützt die präklinische Validierung durch krankheitsrelevante phänotypische Screening-Verfahren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung synaptischer Signalwege und die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch direkte Visualisierung der neuromuskulären Junction (NMJ).
- Screening: Bereitstellung von assaysbereiten Präparationen mit reproduzierbaren strukturellen und fluoreszenten Messwerten zur Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Erzeugung quantitativer morphologischer und immunhistochemischer Daten zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet synaptische Mechanismen in Drosophila mit präklinischen Modellen über konservierte molekulare Signalwege.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von Neurozielen über mehrere Entdeckungskampagnen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in synaptischen Studien reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der NMJ-Präparation über verschiedene Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühe Erkennung synaptischer Toxizität oder Zielinteraktion ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Neurozielen basierend auf funktionellen synaptischen Ergebnissen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in Mikrochirurgie und in der Fluoreszenzmikroskopie.
- Benötigt Dissektionsplatten, Insektennadeln, Feder-Scheren, Pinzetten und HL-3,1-Puffer.
- Erfordert die Standardisierung der Nadelspannung und der Pufferbedingungen zwischen verschiedenen Anwendern.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind unterschiedliche Larvenstadien und genetische Hintergründe, die die Muskelintegrität beeinflussen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in den Anforderungen an die Feinmotorik und in möglichen Muskelverletzungen bei ungenauer Dissektion.
