Name: Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie Immunhistochemie an Drosophila-Larven zur Visualisierung von Proteinen an der neuromuskulären Synapse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Regulationsmechanismen der Synapsenbildung.

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Bevor Sie beginnen <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: PBT (0,1% Triton X100 in 1X PBS), PBTB (0,2% BSA in PBT) und PBTN (2% NGS in PBTB). </li><li> Dissect Drosophila-Larven. Bitte beachten Sie Drosophila Larven NMJ Dissection. </li></ol> Immunhistochemie <ol><li> Bewegen sich die Larven in ein 1,5 ml Röhrchen mit PBT. Waschen Sie die Larven zweimal für 15 Minuten in der PBT. Hinweis: um sich zu waschen, statt der 1,5-ml-Tube auf einem Kolbenpendel Mischer. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem pippetor und ersetzen sie durch frische Flüssigkeit. </li><li> Entfernen Sie die PBT. Wash in PBTB zweimal für 30 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die PBTB. Wash in PBTN zweimal für 15 Minuten. </li><li> Inkubieren in Primärantikörper in PBTN bei Raumtemperatur verdünnt für 1 Stunde oder bei 4 º C über Nacht. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBTB. Hinweis: Um hinzuzufügen Lösung spülen und entfernen schnell. </li><li> Zweimal waschen für 15 Minuten in PBTB. </li><li> Wash in PBTN für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren in Sekundär-Antikörper (und konjugierte Primärantikörper, wenn Sie eines verwenden) in PBTN verdünnt. </li><li> Cover in Alufolie und Inkubation für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBTB. </li><li> Zweimal waschen für 15 Minuten mit PBTB. </li><li> Gehen Sie zur Montage. </li></ol> Montage Hinweis: Mount in Glycerin, wenn die Proben sofort abgebildet werden. Berg in Prolong Gold-, wenn die Proben vor der Belichtung gespeichert werden soll (für mehr als eine Woche) oder, wenn die Proben müssen mehrfach abgebildet werden. Um zu verwenden, statt eine Flasche zu verlängern, 65 º C Wasserbad für 2-3 Minuten. Nehmen Sie ein Aliquot verlängern Gold und halten in einer Wärme-Block bei 45-50 º C. <ol><li> Gießen gefärbt preps in PBT in einem Uhrglas. </li><li> Legen Sie einige Glycerin auf einen sauberen Glasobjektträger für die Verarbeitung. </li><li> Bewegen Sie den Tieren auf die Verarbeitung von Bild Kommissionierung sie aus dem Uhrglas durch eine Ecke mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, sie sind Kutikula nach unten. </li><li> Entfernen Sie den Kopf und Schwanz mit einer frischen Rasierklinge auf die Bearbeitung von Glas gleiten. Ein exacto-Messer mit Klinge Nr. 16 eignet sich gut dafür. </li><li> Auf einem anderen Bild (Montage Folie), legte einen kleinen Tropfen Glycerin / verlängern und breitete sie mit sauberen Pinzette. </li><li> Bewegen Sie den sezierten Tiere an der Montageplatte schieben durch ihre Kante, kümmert sich nicht um sie zu invertieren. Versuchen Sie, sie in Reihen in der gleichen Ausrichtung zu montieren. Berg 6-8 Tieren pro Folie. </li><li> Drop ein Deckglas auf, indem eine Kante in die Glycerin / Verlängern und langsam loslassen. </li><li> Verschließen Sie die Folie mit Nagellack. Hinweis [Nicht Bild, bis der Lack trocken ist. Dies dauert in der Regel 10 Minuten. Für die Proben in Verlängerung Gold montiert, lassen Sie die Folien trocken für mindestens drei Stunden vor dem Versiegeln oder Bildgebung.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Immunhistochemie (IHC) ist von entscheidender Bedeutung für das Studium der Biologie, weil es NMJ Visualisierung der NMJ ermöglicht. Dies wird durch die Verwendung von Antikörpern, dass die neuronalen Membran (zB HRP), der Präsynapse (zB CSP, SYT), und / oder die Postsynapse (zB DLG) erkennen erreicht. Signalmoleküle, Strukturproteine, oder neuartige Proteine ​​von Interesse kann auch gefärbt werden. Dann können Gene mutiert oder missexpressed werden, und IHC können Störung der synaptischen Struktur und / oder neuronale...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; Nutator-Mischer</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsmesser Nr. 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Klingen Nr. 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larven nmj immunhistochemie

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität eingesetzt. Die weit verbreitete Verwendung des<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor-System ist aufgrund seiner hohen Verfügbarkeit. Es kann mit Single-Cell-Auflösung analysiert werden. Es gibt 30 Muskeln pro hemisegment deren Anordnung innerhalb des peripheren Körper Wand bekannt sind. Insgesamt 31 Motoneuronen, diese Muskeln legen in ein Muster, das high fidelity hat. Mit Molekularbiologie und Genetik, kann man transgene Tiere oder Mutanten. Dann kann einer Studie der Entwicklung Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der NMJ. Immunhistochemie kann eindeutig Bild die Komponenten des NMJ verwendet werden. In diesem Artikel zeigen wir, wie Antikörper-Färbung verwenden, um die Visualisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven NMJ.

Dieses Protokoll zeigt, wie Immunhistochemie auf seziert Drosophila Larve führen.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Die neuromuskuläre Endplatte (NMJ) von Drosophila ist ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität. Die weite Verbreitung ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie man immunhistochematische Färbungen an dissezierten Gsof-Larven durchführt, um Proteine sichtbar zu machen, die an der Synapsenentwicklung beteiligt sind. Während des gesamten Verfahrens wird ein 1,7-mil-Röhrchen für die Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern sowie für die Waschschritte verwendet. Anschließend werden die Larven auf einen Bearbeitungsobjektträger überführt, wo sie mit einem Präzisionsmesser zurechtgeschnitten werden; die Präparate werden dann in einen Tropfen Antifading-Reagenz verbracht.Auf einem Objektträger wird ein Deckglas abschließend mit Nagellack versiegelt. Hallo, ich bin Jonathan Brent aus dem Labor von Brian McCade an der Abteilung für Physiologie und zelluläre Biophysik am College of Physicians and Surgeons der Columbia University. Wir verwenden dieses Verfahren, um die genetische Regulation der Synapsenbildung an der neuromuskulären Verbindung und am sich entwickelnden Axonknoten zu untersuchen.Beginnen wir also. Bevor Sie die Immunhistochemie am Gsof-Larven-NMJ durchführen, müssen Sie zunächst die Larven korrekt dissezieren. Um dieses Verfahren zu erlernen, sehen Sie sich den begleitenden Videoartikel mit dem Titel Drosophila Larva N MJ Dissection an.Um das Verfahren zu beginnen, bereiten Sie drei frische Lösungen vor. Stellen Sie zunächst die PBT-Lösung her, indem Sie Tensid zu frisch hergestelltem PBS hinzufügen. Nehmen Sie als Zweites eine Aliquot aus Rinderserumalbumin und geben Sie es zu einer PBT-Lösung hinzu.Um PBTB Drittel herzustellen, nehmen Sie ein normales Ziegenserum in aqua und geben es zu der PB TB-Lösung hinzu, um die PBTN-Lösung zu erhalten. Nach der Zubereitung dieser Lösungen überführen Sie die Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen, das ein ml PBT enthält. Dies ist die erste Waschung.Jeder Waschschritt beinhaltet das Austauschen der Lösung, in der sich die Larven befinden, gefolgt von einer Inkubation der Larven auf einem langsam rotierenden Mischgerät. Überführen Sie die Larven nicht von einem Röhrchen ins andere, da dies sie beschädigen könnte. Dieser erste Waschschritt dauert 15 Minuten bei Raumtemperatur.Nach 15 Minuten Mischen ersetzen Sie das PBT mit frischem PBT unter Verwendung einer Pipette und waschen die Larven weitere 15 Minuten lang. Beim Wechseln der Waschlösungen achten Sie stets darauf, die Larven nicht zu beschädigen. Wenn die PBT-Waschungen abgeschlossen sind, waschen Sie die Larven 30 Minuten lang in PBTB.Wiederholen Sie diese Waschung mit frischer Lösung weitere 30 Minuten lang. Mit der PBTB-Waschung ist der Vorgang abgeschlossen. Waschen Sie zweimal mit PBTN je 15 Minuten lang.Während des zweiten Waschschritts kann der Primärantikörper in PBTN in der gewünschten Arbeitskonzentration verdünnt werden. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Larven eine Stunde lang bei vorsichtiger Mischung bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius in dieser Antikörpermischung. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, saugen Sie die Primärantikörperlösung ab und spülen die Larven mehrmals schnell mit PBTB aus, um verbliebene Antikörper zu entfernen.Um die Larven auf die nächste Antikörperinkubation vorzubereiten, waschen Sie sie einmal 15 Minuten lang in PBTB und zweimal je 30 Minuten in PBTN. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper in PBTN auf die gewünschte Arbeitskonzentration und inkubieren Sie die Larven eineinhalb Stunden in dieser Mischung. Bei Raumtemperatur müssen die Larven abgedeckt werden, um eine Lichteinwirkung zu verhindern und eine Verbleichung von Floor Four zu minimieren.Nach anderthalb Stunden die Sekundärantik&ouml;rperl&ouml;sung entfernen und die Larven mehrmals erneut in PBTB sp&uuml;len. Anschlie&szlig;end die Larven zweimal je 15 Minuten in PBTV waschen. S&auml;mtliche weiteren Waschschritte und die Aufbewahrung der Larven sollten mit m&ouml;glichst geringer Lichtexposition erfolgen, achten Sie daher darauf, sie abgedeckt aufzubewahren.Überführen Sie die Larven aus dem 1,5-ml-Röhrchen in PBT auf einem Glas-Präparationsobjektträger. Die Larven sind nun bereit zur Montage, um die gefärbten Larven in der Heat-ProLonged-Gold-Lösung in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten zu montieren. Danach nehmen Sie ein Eloqua und lassen es auf einem Heizblock, der auf 50 Grad Celsius eingestellt ist, stehen.Tragen Sie etwas PB TB auf einen Bearbeitungsträger auf. Überführen Sie die Larven in das PB tb. Drehen Sie die Larven mit einem Exakto-Messer mit Klinge Nummer 16 so, dass die Cuticula-Seite nach unten zeigt, und schneiden Sie die Köpfe und Schwänze der Larven ab.Sie können für diesen Schritt auch ein Rasiermesser verwenden. Bereiten Sie nun den Montageobjektträger vor, indem Sie 40 µL ProLong Gold von der erhitzten Aliquot auf einen sauberen Objektträger geben und mit sauberen Pinzetten verteilen. Verwenden Sie dazu Pinzetten.Übertragen Sie vorsichtig sechs bis acht der vorbereiteten Larven von der Bearbeitungsschiebe auf die Montageschiebe. Achten Sie darauf, dass sie dieselbe Orientierung beibehalten, und legen Sie sie mit der Cuticula-Seite nach unten, um die Larven zu montieren. Geben Sie einen Deckglaser über die verlängerte Lösung.Platzieren Sie es an einer Kante am Rand des verlängerten Tümpels und lassen Sie die Deckglasabdeckung vorsichtig über die Proben gleiten. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Ihrer bevorzugten Farbe aus dickem, preisgünstigem Nagellack. Lassen Sie den Objektträger mindestens drei Stunden trocknen.Wenn die Objektträger nur einmal und unmittelbar nach der Herstellung bildlich erfasst werden, kann die verlängerte Goldlösung durch Glycerin ersetzt werden. Dann beträgt die Trocknungszeit des Nagellacks und des Glycerins nur etwa 10 Minuten, im Gegensatz zu drei Stunden bei jedem Färbeprotokoll. Das Ziel ist ein hoher spezifischer Signalwert in Kombination mit geringem Hintergrund.Dies wird durch die Verwendung hochwertiger Antikörper sowie durch sorgfältige Durchführung der Blockier- und Waschschritte erreicht. Diese Bilder zeigen Wildtyp-Synapsen sowie Synapsen einer Fliegenstamms, der einen mutierten Typ-II-BMP-Rezeptor exprimiert, der als „wishful thinking“ oder „witch“-Mutante bekannt ist. Die neuronale Membran ist mit einem Antikörper gegen Harnstoff-Peroxidase blau angefärbt.Synaptische Vesikel, die rot dargestellt sind, wurden mit einem anti-synaptischen Antikörper angefärbt. Die postsynaptische Struktur, die grün dargestellt ist, wurde mit einem Antikörper gegen discs large angefärbt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Mutation des Typ-II-BMP-Rezeptors wit zu einem Phänotyp mit unzureichendem synaptischem Wachstum führt.Dieser Mutant war entscheidend für die Festlegung von BMPs als retrograde Signale, die die Anzahl der synaptischen Endknöpfchen regulieren. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Immunhistochemie an einer larvalen neuromuskulären Verbindung der Speiseröhre durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens.Es ist wichtig, das Verfahren mit der richtigen zeitlichen Abstimmung durchzuführen, um eine maximale Reproduzierbarkeit und einen geringen Hintergrund zu gewährleisten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biologie

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Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und...

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

Die Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) wird als Modell verwendet, um die Morphologie und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Dieses Video beschreibt wichtige Merkmale, die Forscher quantifizieren, um das NMJ zu charakterisieren. Das Beispielprotokoll demonstriert eine Software, die in der Lage ist, die Quantifizierung automatisch durchzuführen.

Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Verbindung (NMJ): Eine Methode zur Beurteilung der synaptischen Morphologie und Funktion

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Morphologie, Größe und Lage intrazellulärer Organellen sind evolutionär konserviert und scheinen ihre Funktion direkt zu beeinflussen. Die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen, ist zu einem wichtigen Ziel der modernen Biologie geworden. Hier zeigen wir, wie diese Studien durch die Anwendung quantitativer Techniken erleichtert werden können.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

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