Name: Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Lernen Sie die Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Dynamik und neuronaler Entwicklung in vivo.

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Wir danken Mark Terasaki für Erstberatung mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um lokale Gewebeschäden, Kathy Joubin um Rat Halterung für Zeitraffer-Imaging und der Sagasti und Portera-Cailliau Labors für Diskussionen zu schaffen. Erste Versuche wurden von AS als Grass Foundation Fellow am Marine Biological Labs in Woods Hole, MA durchgeführt. Die Arbeit im Labor war Sagasti durch Zuschüsse aus dem Whitehall-Stiftung, die Klingenstein Foundation, und ein Burroughs Wellcome Fund Career Award in den biologischen Wissenschaften unterstützt.

Teil 1: Montieren Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung <ol><li> Bereiten Sie 1% niedrig schmelzende Agarose-Lösung für die Einbettung. Lösen Sie Agarose in DI-Wasser durch Erhitzen in der Mikrowelle, Aliquot in kleine Röhrchen und lagern in einem Heizblock bei 42 Grad Celsius. </li><li> Wählen Embryonen für die Bildgebung und entfernen ihre Chorion durch leichtes Ziehen des Chorion auseinander mit einer Pinzette. Embryonen können in eine 5% PTU Ringers Lösung bei 22-24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) platziert werden, um die Bildung von Pigment zu hemmen. Dies verbessert die Klarheit der Bildgebung und ist essentiell für die Durchführung der Zwei-Photonen axotomies sensorischer Axone. Wenn das natürliche Pigment zu bilden erlaubt ist, verdeckt Autofluoreszenz Axone über die Zwei-Photonen-Mikroskop. Ringers Lösung für Zebrafisch enthält 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, und 5 mM HEPES, pH 7,2. </li><li> Anesthetize Embryonen, die durch Zugabe von ~ 0,02% Tricaine der PTU Ringers. Stellen Sie sicher, Tiere sind nicht ansprechbar, bevor Sie fortfahren berühren. </li><li> Bereiten Sie die langfristige Bildgebung Kammer durch Anlegen von Vakuum Fett auf der einen Seite einer Glas-oder Teflon-Ring und Fixieren auf ein Deckglas. </li><li> Transfer eines Embryos in die 42 Grad Agarose-Lösung mit einer Glaspipette, dabei nicht zu viel von der PTU Ringers zu übertragen, dann Transfer des Embryos mit einem Tropfen Agarose auf eine vorbereitete Deckglas. </li><li> Position der Embryo wie gewünscht als die Agarose erstarrt. Denken Sie daran, dass die Bildgebung Kammer wird umgedreht, wenn Sie fertig sind, so dass das Deckglas wird die Oberseite werden. </li><li> Wenn Sie einen motorisierten Tisch und Bild mehrere Standorte auf einmal, wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,6 für jeden Embryo. </li><li> Lassen Sie die Agarose vollständig erstarren, dann füllen Sie den Ring mit 0,02% Tricaine PTU Ringers. </li><li> Bewerben Vakuumfett auf die andere Seite des Rings (s), dann decken die Ring (e) mit einem Glasträger. Klappen Sie den verschlossenen Kammer (n) über. Diese Kammern können für die Bildgebung auf aufrechte oder inverse Mikroskope verwendet werden. </li></ol> Teil 2: Zwei-Photonen-Axotomie mit einem speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop mit einer Chameleon Ti-Saphir-Laser <ol><li> Bereiten Sie für die Bildgebung. Setzen Sie den montierten Embryo (s) auf einem Objektträger-Halter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit einem 40X (0,8 NA) Wasser Ziel. Schalten Sie den Laser. Wir konnten reproduzierbar zu visualisieren und zu Schäden GFP-exprimierenden Neuronen mit den folgenden Parametern. Zur Visualisierung Axone an einer nicht-schädigenden Kraft gesetzt Laser mit einer Wellenlänge von 910 Nanometern (nm) und einer Leistung von 30 Milliwatt (mW aufgeführt sind die Höhe der Leistung bei der Probe). Öffnen Sie die Imaging-Software. Wir verwenden scanimage Software in Karel Svoboda Labor 2, 3 entwickelt. </li><li> Drücken Sie den Fokus auf den Embryo mit der Zwei-Photonen-Laser-Scan, suchen Sie das Axon Sie wollen axotomize und Aufnehmen eines Bildes dieses Axon. Markieren Sie die erste und die letzte Z-Positionen, erwerben Sie das Bild, und eine maximale Projektion der Z-Stapel. </li><li> Zoom in 70X auf dem Ast des Axons Sie wollen axotomize und aufhören zu scannen. Erhöhen Sie die mW an der Probe, um die schädlichen Leistung von 180 mW, und führen Sie einen einzigen Scan mit dem Laser. Wir tun dies, indem die Anzahl der Z Scheiben auf 1 und drücken Sie &quot;Grab&quot;. Dies sollte ausreichen, um das Axon zu durchtrennen. Siehe die Diskussion für Methoden, um diesen Vorgang für Ihr Mikroskop und experimentelle Ziel zu optimieren. </li><li> Zoom, verringern Sie die Leistung auf 30 mW und der Aufnahme eines Bildes. </li></ol> Teil 3: Zwei-Photonen-Axotomie am Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen-Mikroskop <ol><li> Ort montiert Embryo auf die Bühne und bringen sie in den Fokus mit einem 25X Wasser objektiven oder einem anderen geeigneten Ziel. </li><li> Schalten Sie die Zwei-Photonen-(910 nm) und Argon (488 nm) Laser in einem Multi-Track-Einstellung, so dass es möglich ist, von einem zum anderen wechseln. Obwohl beide Laser verwendet werden, um GFP erkennen, ist die Zwei-Photonen-Emissions visualisiert mit roten, und der Argon-Laser-Emission mit grüner, die beiden zu unterscheiden. </li><li> Verwenden Sie den Argon-Laser zu einem Axon zu verletzen identifizieren. Unter Z-Einstellungen markieren Sie die erste und die letzte optische Schnitte. Werfen Sie einen konfokalen Bild und schaffen eine maximale Projektion der Z-Stack. </li><li> Wählen Sie die Region des Axons verletzt zu sein und bringen diese Region in den Fokus. Schalten Sie den Argon-Laser und schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser. Scan der Probe mit der Zwei-Photonen in einem Laser-Intensität von ~ 9% Transmission um sicherzustellen, dass das Axon noch im Fokus ist. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Stop&quot;-Taste, so dass die Ernte-Tool zur Verfügung stehen. Verwenden Ernte heranzoomen auf den Bereich von Interesse. Normalerweise haben wir auf ~ 70X (Zoom kann im Rahmen der &quot;mode&quot;-Reiter kontrolliert werden) Zoom. Unter dem Reiter &quot;Kanäle&quot; ändern die Intensität der Zwei-Photonen von ~ 9% Transmission zu 15-20% Transmission. </li><li> Um sever ein Axon aktivieren Sie die &quot;schnellen XY&quot;-Taste für ca. 1 Sekunde und drücken Sie die Stopp-Taste, um überschüssige Schäden zu vermeiden. Das Axon ist als verstreute Trümmer zu sehen, wenn das Verfahren gearbeitet. </li><li> Um sicherzustellen, dass das Axonbeschädigt wurde wieder auf das 488 nm Argon-Laser, nehmen Sie ein anderes konfokale Abbildung, und erstellen Sie eine maximale Projektion. </li></ol> Teil 4: Konfokale Zeitraffer-Imaging am Zeiss LSM 510 <ol><li> Bereiten Sie für die Bildgebung. Wenn Sie mit einem beheizten Stadium befinden, sollten Sie es auf mindestens 30 Minuten einschalten, bevor die Einrichtung Ihres Zeitraffer-Film. Setzen Sie den montierten Embryo (s) auf einem Objektträger-Halter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit den gewünschten Luft Ziel. Wir verwenden ein 20X, 0,5 NA Ziel. Öffnen Zeiss LSM 510 Imaging-Software. Schalten Sie auf den entsprechenden Laser und richten Sie die gewünschte Konfiguration. Wir beschreiben jetzt ein detailliertes Protokoll für die langfristige Bildgebung mit Zeiss LSM Multi Time Software. Diese Methoden können für die Verwendung auf Ihrem eigenen Mikroskop mit Ihrer Bildbearbeitungssoftware angepasst werden. </li><li> Definieren Sie die Position und die Konfiguration Ihrer ersten Embryo in der Multi Zeitfenster. Öffnen Sie die Scan-, Bühnen-und Multi Zeitfenster. Aktivieren schnellen Scan auf dem Scan-Fenster. Bewegen Sie die Bühne, um die gewünschte XY-Position. Markieren Sie die erste und die letzte Z-Positionen in der Scan-Fenster. Drücken Sie Stop, dann Mid, auch in das Scan-Fenster. Warten Sie, bis der Scan der Mitte Z Scheibe zu beenden, drücken Sie die markierte Position in der Bühne Fenster. Wenn Sie nur Bildgebung ein Embryo sind, auf der &quot;Single Location&quot;-Tab klicken Sie in der Multi Zeitfenster. Klicken Sie auf &quot;Ersetzen XYZ&quot; und dann auf &quot;Save Configuration&quot;. Zustimmen, wenn gefragt, um die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Gehen Sie auf 4,4 Schritt. Wenn Sie eine mechanisierte Bühne haben, können Sie sich mehrere Standorte zu Bild mehrere Embryonen. In diesem Fall sollten Sie die &quot;Multiple Locations&quot; tab vor der Festlegung der XYZ und Konfiguration für Ihren ersten Standort zu wählen. Auch immer sicherstellen, dass die Pull-Down-Menü direkt unter dem &quot;Multiple Locations&quot; Registerkarte auf Platz 1 ist, und dass die Pull-Down-Menü bei der Projektierung, sagt multi loc 1, bevor Sie klicken Sie auf Konfiguration speichern. </li><li> Definieren Sie die Position und die Konfiguration Ihres restlichen Embryonen in die Multi Zeitfenster. Suchen Sie Ihren nächsten Embryo, und drücken Sie dann schnell zu scannen, bewegen sich die Bühne in die gewünschte Position XY, und markieren Sie Ihre erste und die letzte Z-Positionen in der Scan-Fenster. Drücken Sie Stop, dann Mid, auch in das Scan-Fenster. Warten Sie, bis der Scan der Mitte Z Scheibe zu beenden, drücken Sie die markierte Position in der Bühne Fenster. Klicken Sie auf &quot;Ersetzen XYZ&quot;. Prüfen Sie, ob das Pull-Down-Menü direkt unter dem &quot;Mehrere Standorte&quot; auf die Registerkarte Standort 2 ist, und dass die Pull-Down-Menü in der Konfiguration Abschnitt multi loc 2 sagt, dann klicken Sie auf &quot;Save Configuration&quot;. Zustimmen, wenn gefragt, um die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Embryonen. </li><li> Stellen Sie die Parameter für die Bildaufnahme in der Multi Loc Fenster. Wählen Sie die GR-GL-Option in der &quot;List of Blocks&quot; Abschnitt, und geben Sie dann die gewünschte Anzahl der Wiederholungen Gruppe. Dies ist die Anzahl, wie oft der konfokalen ein Bild an jedem Ort erwerben. Geben Sie die gewünschte Warteintervall im Abschnitt Parameter. Dies ist die Zeit, die von Anfang an von einem Imaging-Wiederholung zu Beginn der nächsten Wiederholung. Wählen Sie &quot;ZStackXY&quot; in der Konfiguration Abschnitt. Geben Sie Basisdateinamen im unteren Bereich. Klicken Sie auf &quot;Bild auswählen DB&quot; und wählen Sie Ihre mdb. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Optionen&quot;. Wählen Sie Ihre mdb Ordner temporäre Dateien zu speichern. Check &quot;zu halten endgültige Bild öffnen&quot;, &quot;save endgültige Bild&quot; und &quot;Mitte des z-Stapel&quot;. Wählen Sie warten Intervall. Klicken Sie auf OK, um die Optionen zu schließen. Klicken Sie auf &quot;Start time&quot;. Lassen Sie Multi Zeitfenster offen für die Dauer der Bildgebung. </li><li> Analysieren Sie Ihre Daten. Wenn der Zeitraffer-Imaging abgeschlossen ist, wird der Multi Time Software kompilieren alle temporären Dateien in eine zusammengefasste Datei für jeden Standort. Wenn Sie den Film stoppen, bevor es beendet ist möchten, müssen Sie auf &quot;Fertig stellen&quot; drücken, anstatt &quot;Stop&quot;, so dass eine Zusammenfassung erstellt werden. Die temporären Dateien und Zusammenfassung Dateien sollten automatisch an den bezeichneten mdb Ordner gespeichert werden. Von der LSM Software-Menü auf &quot;3D View&quot; klicken, dann &quot;Projektion&quot;. Mit Ihrer Zusammenfassung Datei im Pulldown-Menü ausgewählt wird, auf &quot;Apply&quot; klicken. Dies erzeugt maximale Projektionen der Z-Stack für jeden konfokalen Bild. Auf der LSM Software-Menü auf &quot;Datei&quot; klicken und dann &quot;Export&quot;. Speichern Sie die maximale Projektionen als eine Reihe von tif-Dateien. Sie können dann erstellen Sie einen Film aus der Reihe von tif-Dateien mit ImageJ oder QuickTime Pro. Axone in den LSM Bilder können in drei Dimensionen mit Bildanalyse-Software (zB Neurolucida aus MicroBrightfield), um detaillierte quantitative Informationen über Axon Morphologie erzeugen zurückverfolgt werden. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Ein erfolgreiches Experiment wird in eine genaue Darstellung der zellulären Dynamik Ergebniss von Axon Erholung von Verletzungen. Ihre Embryonen werden nach der Bebilderung gesund, ohne sichtbare Degeneration und eine starke Herzschlag. Die Axotomie sollte präzise Schäden führen, nur Durchtrennen des definierten Zweig der Axon. Es sollte keine Schäden am umliegenden Axonen und minimal Zelltod werden. Wir glauben, sehen wir den Tod eines einzigen Epidermiszelle direkt über die Website von Axotomie in ~ 50% der Experimente. Wenn Sie mehr Schaden zu beobachten, sollten Sie optimieren Ihre Zwei-Photonen-Protokoll wie in der Diskussion beschrieben.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

Wir haben die Methoden beschrieben, um genau axotomize peripheren sensorischen Axonen und direkt zu beobachten Regeneration im lebenden Zebrafisch-Embryos verwendet. Langfristige Zeitraffer-konfokale Bildgebung in Zebrafisch kann verwendet werden, um viele Entwicklungsprozesse in vivo zu beobachten. Die Zwei-Photonen-Axotomie beschriebene Verfahren kann für viele verschiedene experimentelle Ziele modifiziert werden. Wir haben die gleiche allgemeine Verfahren zur gesamten Trigeminus sensorischen Neurons Zellkörp...

zwei-photonen-axotomie und zeitraffer-konfokale bildgebung in lebenden zebrafisch-embryonen

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafische sind seit langem verwendet, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung von Zeitraffer-Bildgebung des lebendigen transparent Embryo zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zebrafisch-Embryos für die langfristige Bildgebung montieren und zu demonstrieren, wie die Erfassung von Zeitraffer-Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop zu automatisieren. Wir beschreiben eine Methode, um den kontrollierten, präzisen Schäden an einzelnen Zweigen der peripheren sensorischen Axone im Zebrafisch mit dem Schwerpunkt Kraft eines Femtosekunden-Laser auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop montiert erstellen. Die Parameter für eine erfolgreiche Zwei-Photonen-Axotomie muss für jedes Mikroskop optimiert werden. Wir werden Zwei-Photonen-Axotomie sowohl auf custom built Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen auf zwei Beispiele geben zu demonstrieren. Zebrafisch Trigeminus sensorischen Neuronen können in einer transgenen Linie, die GFP durch ein sensorisches Neuron spezifischen Promotor 1 angetrieben visualisiert werden. Wir haben diese Zebrafisch Trigeminus-Modell angepasst, um direkt zu beobachten sensorischen Axonregeneration in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Die Embryonen werden betäubt mit Tricaine positioniert und in einem Tropfen Agarose als sie erstarrt. Immobilisierte Embryonen werden in einem bildgebenden Kammer mit Phenylthioharnstoff (PTU) Ringers gefüllt versiegelt. Wir haben festgestellt, dass Embryonen kontinuierlich in diesen Kammern werden für 12-48 Stunden abgebildet. Ein einziger konfokalen Bild wird dann erfasst, um die gewünschte Stelle des Axotomie bestimmen. Die Region von Interesse ist auf der Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Abbildung der sensorischen Axone bei niedrigen, nicht-schädliche Macht entfernt. Nach dem Zoomen in die gewünschte Stelle des Axotomie, wird die Leistung erhöht und einen einzigen Scan des definierten Bereichs ist ausreichend, um das Axon zu durchtrennen. Mehrere Lage Zeitraffer-Imaging wird dann auf einem konfokalen Mikroskop direkt beobachten axonalen Erholung von Verletzungen gesetzt.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafische werden seit langem eingesetzt, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung mittels Time-Lapse-Imaging des lebenden, transparenten Embryos zu untersuchen.

Um Axone mittels In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie zu schneiden, positionieren Sie anästhesierte Zebrafischembryonen in einem Tropfen Aros, während dieser in einer speziellen Kammer aus einer TEFL-Wäsche und einem Deckglas aushärtet. Eine Glaslampe wird auf die Kammer gesetzt, die dann vor der Exotomie auf den Kopf gestellt wird. Nehmen Sie ein Bild des Axons, das Sie schneiden möchten, bei 40-facher Vergrößerung auf und zoomen Sie dann auf den Bereich, den Sie exomisieren möchten, mit 70-facher Vergrößerung heran.Und bei ausgeschaltetem Laser erhöhen Sie die Laserleistung. Schalten Sie den Laser kurz ein. Im Nachbild des Axons sehen Sie verstreute axonale Trümmer, falls die Exotomie erfolgreich war.Hallo, ich bin Georgia O'Brien. Hallo, ich bin Sandra Rigo. Und ich bin Shauna Martin.Und wir stammen aus dem Labor von Alvarez TI aus der Abteilung für molekulare Zell- und Entwicklungsbiologie an der University of California, Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die Zwei-Photonen-Exsodomy und die zeilückige konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafischembryonen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Degeneration und Regeneration peripherer somatosensorischer Axone zu untersuchen.Beginnen wir also. Zunächst bereiten wir eine 1 %ige Low-Melt-Agarose-Lösung zum Einbetten vor. Wir lösen die Agarose in zweifach destilliertem Wasser durch Erhitzen in der Mikrowelle, geben sie anschließend portionsweise in kleine Röhrchen und lagern sie in einem Heizblock bei 42 Grad Celsius.Zunächst können die Embryonen 22 bis 24 Stunden nach der Befruchtung in eine 5 %ige PTU-Ringer-Lösung gegeben werden, um die Bildung von Pigmenten zu hemmen, die stark autofluoreszierend sind und die Axone im Zwei-Photonen-Mikroskop überlagern würden. Danach wählen wir Embryonen zur Bildgebung aus und entfernen ihre Chorion durch vorsichtiges Auseinanderziehen mit einer Pinzette. Sobald die Embryonen ausgewählt sind, werden sie durch Zugabe von etwa 0,02 % Trica anästhesiert.Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Tiere nicht auf Berührung reagieren. Bereiten Sie die Langzeit-Bildgebungs-Kammer vor, indem Sie Vakuumfett auf eine Seite eines Glas- oder Teflonrings auftragen und diesen auf einem Glas-Deckel fixieren. Achten Sie darauf, so wenig wie möglich von dem PTU-Ringer-Lösung zu übertragen.Überführen Sie ein Embryo mit einer Glaspipette in die 42 Grad warme Agrolösung. Anschließend übertragen Sie das Embryo zusammen mit einem Tropfen Agros auf einen vorbereiteten Deckgläser. Nach der Übertragung positionieren Sie das Embryo entsprechend den Wünschen, während das Agros aushärtet.Beachten Sie, dass die Abbildungskammer nach Abschluss umgedreht wird, sodass die Kupferscheibe die obere Oberfläche bildet. Wenn Sie über einen motorisierten Probentisch verfügen und mehrere Positionen gleichzeitig abbilden können, wiederholen Sie diese Schritte für jedes Embryo. Lassen Sie die Agarrosen vollständig erstarren. Dann füllen Sie den Ring mit 0,02 % Tri-Canine-PTU-Ringerlösung. Tragen Sie anschließend Vakuumfett auf die andere Seite der Ringe auf. Bedecken Sie sie dann mit einem Glasdeckel.Drehen Sie die Dichtungskammern um. Jetzt sind wir bereit für die Vier-Tonnen-Exotomie-Bildgebung. Zum Vorbereiten der Bildgebung platzieren Sie die montierten Embryonen auf einem Objektträgerhalter unter dem Mikroskop.Konzentrieren Sie sich auf ein Embryo mit einem 40x 0,8 numerischen Apertur-Wasserobjektiv. Schalten Sie dann den Laser ein. Stellen Sie den Laser auf eine Wellenlänge von 910 Nanometern und eine Leistung von 30 Milliwatt ein.Öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Wir verwenden die von Corals für das Boar's Laboratory entwickelte ScanImage-Software. Bei dieser Leistung kann man das Feld nach einem Kandidatenaxon durchsuchen, das durchtrennt werden soll.Wenn das Zielaxon gefunden ist, machen Sie ein Bild davon. Markieren Sie die erste und letzte Z-Position, nehmen Sie die Aufnahme auf und erstellen Sie eine Maximum-Projektion der Z-Stapel. Anschließend zoomen Sie 70× in den Axonast, den Sie genauer untersuchen möchten.Erhöhen Sie die Leistung auf 180 Milliwatt und stellen Sie die Anzahl der Z-Schnitte auf eins ein. Führen Sie einen einzelnen Scan mit einem Laser durch, indem Sie „grab“ drücken. Dies sollte ausreichen, um das Axon zu durchtrennen; es ist jedoch erforderlich, dieses Verfahren an Ihr Mikroskop und Ihr experimentelles Ziel anzupassen.Schließlich herauszoomen. Reduzieren Sie die Leistung auf 30 Milliwatt und nehmen Sie ein Bild unseres neu durchtrennten Axons auf. Falls ein selbstgebautes Zwei-Photonen-Mikroskop in Ihrem Labor nicht verfügbar ist, kann auch das Zes fünf 10 konfokale Zwei-Photonen-Mikroskop zum Durchtrennen von Axonen verwendet werden.Wir beginnen damit, das präparierte Embryo auf den Objekttisch zu platzieren und es mit einem 25x-Wasserobjektiv scharfzustellen. Anschließend schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser in Argonlasern in einer Multispur-Einstellung ein, sodass ein Wechsel zwischen beiden möglich ist. Obwohl beide Laser zur Detektion von GFP verwendet werden, wird die Zwei-Photonen-Emission in Rot und die Argonlaser-Emission in Grün visualisiert.Um die beiden zu unterscheiden, verwenden Sie den Argonne-Laser, um ein Axon unter Z-Einstellungen zu identifizieren, das belastbar ist. Markieren Sie den ersten und letzten optischen Schnitt. Erstellen Sie ein konfokales Bild und erzeugen Sie eine maximale Projektion des Zack.Schalten Sie den Argonlaser aus und schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser-Scan mit einer Intensität von etwa 9 % Transmission ein. Um sicherzustellen, dass sich das Axon noch im Fokus befindet, klicken Sie auf die Schaltfläche „Stop“, damit das Zuschneidewerkzeug verfügbar wird. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um den Bereich von Interesse zu vergrößern.Normalerweise zoomen wir auf etwa 70x heran. Wählen Sie den zu verletzenden Bereich des Axons aus und bringen Sie diesen Bereich in den Fokus. Die Vergrößerung kann unter der Registerkarte „Modus“ überprüft werden.Danach wechseln Sie unter der Registerkarte „Channels“ die Intensität der Zwei-Photonen-Anregung von etwa 9 % Transmission auf 15 bis 30 % Transmission. Um die neuen Einstellungen zu aktivieren, klicken Sie auf die Taste „Fast XY“ und danach schnell auf „Stop“. Um übermäßige Schäden zu vermeiden, sollte das Axon als verstreute Trümmer sichtbar sein, falls das Verfahren erfolgreich war.Schließlich, um sicherzustellen, dass das Axon tatsächlich beschädigt wurde, wechseln Sie zurück zum 488 Nanometer Argonlaser. Erstellen Sie ein weiteres konfokales Bild und erzeugen Sie eine maximale Projektion der Z-Achse. Nachdem wir Ihnen nun zwei Methoden gezeigt haben, Axone mithilfe der Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie zu durchtrennen, betrachten wir nun die konfokale Zeitrafferaufnahme der Regeneration unter Verwendung des Zeiss LSM 510.Um die Zeitrafferaufnahme vorzubereiten, schalten Sie die beheizte Probebühne mindestens 30 Minuten vor dem Einrichten Ihrer Zeitrafferaufnahme ein. Platzieren Sie die montierten Embryonen auf einem Objektträgerhalter unter dem Mikroskop. Fokussieren Sie einen Embryo mit dem gewünschten Luftobjektiv.Wir verwenden ein Objektiv mit einer numerischen Apertur von 20 x 0,5, öffnen die Zeiss LSM 510 Bildgebungssoftware und schalten dann die entsprechenden Laser ein sowie die gewünschte Konfiguration einrichten. Öffnen Sie das Scan-Stage- und Multi-Time-Fenster. Falls Sie über die Multi-Time-Software verfügen, definieren Sie die Position und Konfiguration Ihres ersten Embryos im Multi-Time-Fenster.Aktivieren Sie den Schnellscan im Scan-Fenster und bewegen Sie dann den Tisch in die gewünschte XY-Position. Markieren Sie die erste und letzte Z-Position im Scan-Fenster. Drücken Sie im Scan-Fenster zuerst „Stop“ und dann „Mitte“, und warten Sie, bis der Scan der mittleren Z-Schicht abgeschlossen ist.Dann drücken Sie im Bühnenfenster auf Position markieren. Wenn Sie nur einen Embryo abbilden, klicken Sie im Multizeitfenster auf den Reiter „Einzelposition“. Klicken Sie anschließend auf X, y, Z ersetzen. Danach klicken Sie auf Konfiguration speichern.Stimmen Sie zu, wenn Sie aufgefordert werden, die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Nun können Sie die Parameter für die Bildaufnahme im Multi-Lo-Fenster einrichten. Wenn Sie einen motorisierten Tisch haben, können Sie mehrere Positionen einrichten, um mehrere Embryonen abzubilden.Wählen Sie in diesem Fall vor der Definition von X, Y, Z und der Konfiguration für Ihren ersten Ort die Registerkarte „Mehrere Orte“. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Dropdown-Menü direkt unter der Registerkarte „Mehrere Orte“ auf „Ort eins“ eingestellt ist und dass das Dropdown-Menü im Konfigurationsbereich „Multi Lo Eins“ anzeigt. Bevor Sie auf „Konfiguration speichern“ klicken, definieren Sie die Position und Konfiguration Ihrer verbleibenden Embryonen im Multizeit-Fenster.Suchen Sie Ihren nächsten Embryo-Druck-Schnellscan, bewegen Sie dann die Probe in die gewünschte XY-Position und markieren Sie Ihre erste und letzte Z-Position im Scan-Fenster. Drücken Sie Stop. Danach ebenfalls in der Mitte im Scan-Fenster warten, bis der Scan der mittleren Z-Schicht abgeschlossen ist.Dann drücken Sie „Position markieren“. Klicken Sie im Fenster „Stage“ auf „X, Y, Z ersetzen“. Stellen Sie sicher, dass das Dropdown-Menü direkt unterhalb des Tabs „Mehrere Positionen“ auf „Position zwei“ und das Dropdown-Menü im Konfigurationsabschnitt auf „Multilobus zwei“ eingestellt ist. Klicken Sie dann auf „Konfiguration speichern“. Bestätigen Sie. Wenn Sie aufgefordert werden, die vorherige Konfiguration zu überschreiben, wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Embryonen.Richten Sie die Parameter für die Bildaufnahme im Multi-Lo-Fenster ein. Wählen Sie in der Liste der Blockabschnitte die Option GR GL aus. Geben Sie anschließend die gewünschte Anzahl an Gruppenwiederholungen ein.Dies ist die Anzahl der Wiederholungen, mit denen das konfokale Mikroskop an jeder Position ein Bild aufnimmt. Geben Sie das gewünschte Zeitintervall im Parameterabschnitt ein. Dies ist die Zeitspanne vom Beginn einer Bildaufnahme bis zum Beginn der nächsten Bildaufnahme.Wählen Sie im Konfigurationsbereich Zack XY aus. Geben Sie Ihren Basisdateinamen im unteren Bereich ein. Klicken Sie auf „Bilddatenbank auswählen“ und wählen Sie Ihre Datenbank aus.Klicken Sie auf die Optionsschaltfläche und wählen Sie dann Ihren MDB-Ordner aus, um auch temporäre Dateien zu speichern. Aktivieren Sie die Option, das endgültige Bild geöffnet zu lassen. Speichern Sie das endgültige Bild, wählen Sie die Mitte des Zack und legen Sie das Gewichtsintervall fest.Klicken Sie auf „Okay“, um das Optionsfenster zu schließen, dann klicken Sie auf Startzeit. Lassen Sie das Multizeitfenster während der gesamten Aufnahme geöffnet. Nun ist es an der Zeit, Ihre Daten zu analysieren.Wenn die Zeitraffer-Aufnahme abgeschlossen ist, wird die Multizeit-Software alle temporären Dateien in einer Zusammenfassungsdatei für jeden Standort zusammenführen. Falls Sie den Film beenden möchten, bevor er vollständig ist, drücken Sie unbedingt „Beenden“ statt „Stopp“, damit eine Zusammenfassungsdatei erstellt wird.Die temporären Dateien und Zusammenfassungsdateien sollten automatisch im vorgesehenen MDB-Ordner gespeichert werden. Hier ist ein repräsentatives Beispiel eines Zeitraffer-Konfokalmikroskopie-Videos nach einer Exotomie 54 Stunden nach der Befruchtung. Der erste Frame zeigt eine dorsale Ansicht des Axons vor der Exotomie, wobei ein gelber Pfeil in der folgenden Aufnahme auf die Exotomiestelle zeigt.Der Zeitrafferfilm beginnt innerhalb einer Stunde nach der Exotomie und dauert 12 Stunden an. Alle 20 Minuten wurde ein konfokaler Stack aufgenommen. Dieser Zeitraffer-Konfokalfilm wird mit denselben Parametern 78 Stunden nach der Befruchtung aufgezeichnet.Der erste Frame zeigt eine Seitenansicht des Axons vor der Exsodomy, wobei ein gelber Pfeil auf die Exsodomy-Stelle zeigt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man gezielte Gewebeschädigungen erzeugt und lebende Zebrafischembryonen mittels Zweiphotonen-Sodomy und zeilupenmikroskopischer Konfokalbildgebung in Echtzeit visualisiert. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, die verwendete Leistung des Zweiphotonenlasers für die Exsodomy optimal einzustellen, um übermäßige Schäden zu vermeiden.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Dieses Video beschreibt die Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Axotomie und der Beobachtung der axonalen Erholung von Verletzungen.

Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

Quelle: Williams, A. L., et al. Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Entwicklung in Echtzeit: Visualisierung von wandernden Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll, um die Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo in Echtzeit mit hoher Auflösung zu visualisieren.

Visualisierung der Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffer-Bildgebung

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Wir demonstrieren eine Methode, die die Vorteile der schnellen konfokalen Rastermikroskopie nutzt, um Live-Bildgebung von Mikrogliazellen im sich entwickelnden optischen Tectum des Zebrafisches durchzuführen und so die Dynamik dieser Zellen in vivo zu analysieren.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Lernen Sie die Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Dynamik und neuronaler Entwicklung in vivo.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

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