Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Um Axone mittels In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie zu schneiden, positionieren Sie anästhesierte Zebrafischembryonen in einem Tropfen Aros, während dieser in einer speziellen Kammer aus einer TEFL-Wäsche und einem Deckglas aushärtet. Eine Glaslampe wird auf die Kammer gesetzt, die dann vor der Exotomie auf den Kopf gestellt wird. Nehmen Sie ein Bild des Axons, das Sie schneiden möchten, bei 40-facher Vergrößerung auf und zoomen Sie dann auf den Bereich, den Sie exomisieren möchten, mit 70-facher Vergrößerung heran.

Und bei ausgeschaltetem Laser erhöhen Sie die Laserleistung. Schalten Sie den Laser kurz ein. Im Nachbild des Axons sehen Sie verstreute axonale Trümmer, falls die Exotomie erfolgreich war.

Hallo, ich bin Georgia O'Brien. Hallo, ich bin Sandra Rigo. Und ich bin Shauna Martin.

Und wir stammen aus dem Labor von Alvarez TI aus der Abteilung für molekulare Zell- und Entwicklungsbiologie an der University of California, Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die Zwei-Photonen-Exsodomy und die zeilückige konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafischembryonen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Degeneration und Regeneration peripherer somatosensorischer Axone zu untersuchen.

Beginnen wir also. Zunächst bereiten wir eine 1 %ige Low-Melt-Agarose-Lösung zum Einbetten vor. Wir lösen die Agarose in zweifach destilliertem Wasser durch Erhitzen in der Mikrowelle, geben sie anschließend portionsweise in kleine Röhrchen und lagern sie in einem Heizblock bei 42 Grad Celsius.

Zunächst können die Embryonen 22 bis 24 Stunden nach der Befruchtung in eine 5 %ige PTU-Ringer-Lösung gegeben werden, um die Bildung von Pigmenten zu hemmen, die stark autofluoreszierend sind und die Axone im Zwei-Photonen-Mikroskop überlagern würden. Danach wählen wir Embryonen zur Bildgebung aus und entfernen ihre Chorion durch vorsichtiges Auseinanderziehen mit einer Pinzette. Sobald die Embryonen ausgewählt sind, werden sie durch Zugabe von etwa 0,02 % Trica anästhesiert.

Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Tiere nicht auf Berührung reagieren. Bereiten Sie die Langzeit-Bildgebungs-Kammer vor, indem Sie Vakuumfett auf eine Seite eines Glas- oder Teflonrings auftragen und diesen auf einem Glas-Deckel fixieren. Achten Sie darauf, so wenig wie möglich von dem PTU-Ringer-Lösung zu übertragen.

Überführen Sie ein Embryo mit einer Glaspipette in die 42 Grad warme Agrolösung. Anschließend übertragen Sie das Embryo zusammen mit einem Tropfen Agros auf einen vorbereiteten Deckgläser. Nach der Übertragung positionieren Sie das Embryo entsprechend den Wünschen, während das Agros aushärtet.

Beachten Sie, dass die Abbildungskammer nach Abschluss umgedreht wird, sodass die Kupferscheibe die obere Oberfläche bildet. Wenn Sie über einen motorisierten Probentisch verfügen und mehrere Positionen gleichzeitig abbilden können, wiederholen Sie diese Schritte für jedes Embryo. Lassen Sie die Agarrosen vollständig erstarren.

Dann füllen Sie den Ring mit 0,02 % Tri-Canine-PTU-Ringerlösung. Tragen Sie anschließend Vakuumfett auf die andere Seite der Ringe auf. Bedecken Sie sie dann mit einem Glasdeckel.

Drehen Sie die Dichtungskammern um. Jetzt sind wir bereit für die Vier-Tonnen-Exotomie-Bildgebung. Zum Vorbereiten der Bildgebung platzieren Sie die montierten Embryonen auf einem Objektträgerhalter unter dem Mikroskop.

Konzentrieren Sie sich auf ein Embryo mit einem 40x 0,8 numerischen Apertur-Wasserobjektiv. Schalten Sie dann den Laser ein. Stellen Sie den Laser auf eine Wellenlänge von 910 Nanometern und eine Leistung von 30 Milliwatt ein.

Öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Wir verwenden die von Corals für das Boar's Laboratory entwickelte ScanImage-Software. Bei dieser Leistung kann man das Feld nach einem Kandidatenaxon durchsuchen, das durchtrennt werden soll.

Wenn das Zielaxon gefunden ist, machen Sie ein Bild davon. Markieren Sie die erste und letzte Z-Position, nehmen Sie die Aufnahme auf und erstellen Sie eine Maximum-Projektion der Z-Stapel. Anschließend zoomen Sie 70× in den Axonast, den Sie genauer untersuchen möchten.

Erhöhen Sie die Leistung auf 180 Milliwatt und stellen Sie die Anzahl der Z-Schnitte auf eins ein. Führen Sie einen einzelnen Scan mit einem Laser durch, indem Sie „grab“ drücken. Dies sollte ausreichen, um das Axon zu durchtrennen; es ist jedoch erforderlich, dieses Verfahren an Ihr Mikroskop und Ihr experimentelles Ziel anzupassen.

Schließlich herauszoomen. Reduzieren Sie die Leistung auf 30 Milliwatt und nehmen Sie ein Bild unseres neu durchtrennten Axons auf. Falls ein selbstgebautes Zwei-Photonen-Mikroskop in Ihrem Labor nicht verfügbar ist, kann auch das Zes fünf 10 konfokale Zwei-Photonen-Mikroskop zum Durchtrennen von Axonen verwendet werden.

Wir beginnen damit, das präparierte Embryo auf den Objekttisch zu platzieren und es mit einem 25x-Wasserobjektiv scharfzustellen. Anschließend schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser in Argonlasern in einer Multispur-Einstellung ein, sodass ein Wechsel zwischen beiden möglich ist. Obwohl beide Laser zur Detektion von GFP verwendet werden, wird die Zwei-Photonen-Emission in Rot und die Argonlaser-Emission in Grün visualisiert.

Um die beiden zu unterscheiden, verwenden Sie den Argonne-Laser, um ein Axon unter Z-Einstellungen zu identifizieren, das belastbar ist. Markieren Sie den ersten und letzten optischen Schnitt. Erstellen Sie ein konfokales Bild und erzeugen Sie eine maximale Projektion des Zack.

Schalten Sie den Argonlaser aus und schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser-Scan mit einer Intensität von etwa 9 % Transmission ein. Um sicherzustellen, dass sich das Axon noch im Fokus befindet, klicken Sie auf die Schaltfläche „Stop“, damit das Zuschneidewerkzeug verfügbar wird. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um den Bereich von Interesse zu vergrößern.

Normalerweise zoomen wir auf etwa 70x heran. Wählen Sie den zu verletzenden Bereich des Axons aus und bringen Sie diesen Bereich in den Fokus. Die Vergrößerung kann unter der Registerkarte „Modus“ überprüft werden.

Danach wechseln Sie unter der Registerkarte „Channels“ die Intensität der Zwei-Photonen-Anregung von etwa 9 % Transmission auf 15 bis 30 % Transmission. Um die neuen Einstellungen zu aktivieren, klicken Sie auf die Taste „Fast XY“ und danach schnell auf „Stop“. Um übermäßige Schäden zu vermeiden, sollte das Axon als verstreute Trümmer sichtbar sein, falls das Verfahren erfolgreich war.

Schließlich, um sicherzustellen, dass das Axon tatsächlich beschädigt wurde, wechseln Sie zurück zum 488 Nanometer Argonlaser. Erstellen Sie ein weiteres konfokales Bild und erzeugen Sie eine maximale Projektion der Z-Achse. Nachdem wir Ihnen nun zwei Methoden gezeigt haben, Axone mithilfe der Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie zu durchtrennen, betrachten wir nun die konfokale Zeitrafferaufnahme der Regeneration unter Verwendung des Zeiss LSM 510.

Um die Zeitrafferaufnahme vorzubereiten, schalten Sie die beheizte Probebühne mindestens 30 Minuten vor dem Einrichten Ihrer Zeitrafferaufnahme ein. Platzieren Sie die montierten Embryonen auf einem Objektträgerhalter unter dem Mikroskop. Fokussieren Sie einen Embryo mit dem gewünschten Luftobjektiv.

Wir verwenden ein Objektiv mit einer numerischen Apertur von 20 x 0,5, öffnen die Zeiss LSM 510 Bildgebungssoftware und schalten dann die entsprechenden Laser ein sowie die gewünschte Konfiguration einrichten. Öffnen Sie das Scan-Stage- und Multi-Time-Fenster. Falls Sie über die Multi-Time-Software verfügen, definieren Sie die Position und Konfiguration Ihres ersten Embryos im Multi-Time-Fenster.

Aktivieren Sie den Schnellscan im Scan-Fenster und bewegen Sie dann den Tisch in die gewünschte XY-Position. Markieren Sie die erste und letzte Z-Position im Scan-Fenster. Drücken Sie im Scan-Fenster zuerst „Stop“ und dann „Mitte“, und warten Sie, bis der Scan der mittleren Z-Schicht abgeschlossen ist.

Dann drücken Sie im Bühnenfenster auf Position markieren. Wenn Sie nur einen Embryo abbilden, klicken Sie im Multizeitfenster auf den Reiter „Einzelposition“. Klicken Sie anschließend auf X, y, Z ersetzen. Danach klicken Sie auf Konfiguration speichern.

Stimmen Sie zu, wenn Sie aufgefordert werden, die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Nun können Sie die Parameter für die Bildaufnahme im Multi-Lo-Fenster einrichten. Wenn Sie einen motorisierten Tisch haben, können Sie mehrere Positionen einrichten, um mehrere Embryonen abzubilden.

Wählen Sie in diesem Fall vor der Definition von X, Y, Z und der Konfiguration für Ihren ersten Ort die Registerkarte „Mehrere Orte“. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Dropdown-Menü direkt unter der Registerkarte „Mehrere Orte“ auf „Ort eins“ eingestellt ist und dass das Dropdown-Menü im Konfigurationsbereich „Multi Lo Eins“ anzeigt. Bevor Sie auf „Konfiguration speichern“ klicken, definieren Sie die Position und Konfiguration Ihrer verbleibenden Embryonen im Multizeit-Fenster.

Suchen Sie Ihren nächsten Embryo-Druck-Schnellscan, bewegen Sie dann die Probe in die gewünschte XY-Position und markieren Sie Ihre erste und letzte Z-Position im Scan-Fenster. Drücken Sie Stop. Danach ebenfalls in der Mitte im Scan-Fenster warten, bis der Scan der mittleren Z-Schicht abgeschlossen ist.

Dann drücken Sie „Position markieren“. Klicken Sie im Fenster „Stage“ auf „X, Y, Z ersetzen“. Stellen Sie sicher, dass das Dropdown-Menü direkt unterhalb des Tabs „Mehrere Positionen“ auf „Position zwei“ und das Dropdown-Menü im Konfigurationsabschnitt auf „Multilobus zwei“ eingestellt ist. Klicken Sie dann auf „Konfiguration speichern“. Bestätigen Sie. Wenn Sie aufgefordert werden, die vorherige Konfiguration zu überschreiben, wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Embryonen.

Richten Sie die Parameter für die Bildaufnahme im Multi-Lo-Fenster ein. Wählen Sie in der Liste der Blockabschnitte die Option GR GL aus. Geben Sie anschließend die gewünschte Anzahl an Gruppenwiederholungen ein.

Dies ist die Anzahl der Wiederholungen, mit denen das konfokale Mikroskop an jeder Position ein Bild aufnimmt. Geben Sie das gewünschte Zeitintervall im Parameterabschnitt ein. Dies ist die Zeitspanne vom Beginn einer Bildaufnahme bis zum Beginn der nächsten Bildaufnahme.

Wählen Sie im Konfigurationsbereich Zack XY aus. Geben Sie Ihren Basisdateinamen im unteren Bereich ein. Klicken Sie auf „Bilddatenbank auswählen“ und wählen Sie Ihre Datenbank aus.

Klicken Sie auf die Optionsschaltfläche und wählen Sie dann Ihren MDB-Ordner aus, um auch temporäre Dateien zu speichern. Aktivieren Sie die Option, das endgültige Bild geöffnet zu lassen. Speichern Sie das endgültige Bild, wählen Sie die Mitte des Zack und legen Sie das Gewichtsintervall fest.

Klicken Sie auf „Okay“, um das Optionsfenster zu schließen, dann klicken Sie auf Startzeit. Lassen Sie das Multizeitfenster während der gesamten Aufnahme geöffnet. Nun ist es an der Zeit, Ihre Daten zu analysieren.

Wenn die Zeitraffer-Aufnahme abgeschlossen ist, wird die Multizeit-Software alle temporären Dateien in einer Zusammenfassungsdatei für jeden Standort zusammenführen. Falls Sie den Film beenden möchten, bevor er vollständig ist, drücken Sie unbedingt „Beenden“ statt „Stopp“, damit eine Zusammenfassungsdatei erstellt wird.

Die temporären Dateien und Zusammenfassungsdateien sollten automatisch im vorgesehenen MDB-Ordner gespeichert werden. Hier ist ein repräsentatives Beispiel eines Zeitraffer-Konfokalmikroskopie-Videos nach einer Exotomie 54 Stunden nach der Befruchtung. Der erste Frame zeigt eine dorsale Ansicht des Axons vor der Exotomie, wobei ein gelber Pfeil in der folgenden Aufnahme auf die Exotomiestelle zeigt.

Der Zeitrafferfilm beginnt innerhalb einer Stunde nach der Exotomie und dauert 12 Stunden an. Alle 20 Minuten wurde ein konfokaler Stack aufgenommen. Dieser Zeitraffer-Konfokalfilm wird mit denselben Parametern 78 Stunden nach der Befruchtung aufgezeichnet.

Der erste Frame zeigt eine Seitenansicht des Axons vor der Exsodomy, wobei ein gelber Pfeil auf die Exsodomy-Stelle zeigt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man gezielte Gewebeschädigungen erzeugt und lebende Zebrafischembryonen mittels Zweiphotonen-Sodomy und zeilupenmikroskopischer Konfokalbildgebung in Echtzeit visualisiert. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, die verwendete Leistung des Zweiphotonenlasers für die Exsodomy optimal einzustellen, um übermäßige Schäden zu vermeiden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.