Name: Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Lernen Sie eine einfache und kostengünstige Methode zur ortsspezifischen Mutagenese ganzer Plasmide. Diese Technik ermöglicht präzise Basensubstitutionen für die molekularbiologische Forschung.

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Das Prinzip der Methode: Die Mutagenese des gesamten Plasmide erklärt in diesem Video ist eine Mutagenese-Methode, die Sie zu einem geklonten Zielgen durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid ändern können. Es funktioniert durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die die gewünschten Mutation in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid, werden in die neu synthetisierte Plasmid integriert. Nach dem Entfernen des ursprünglichen Plasmid aus der Reaktion des mutierten Plasmid wird in E. verwandelt coli. Die folgenden Schritte sind für Screening-Zwecke nur, weil die Mutation Effizienz dieser Methode ist nicht 100%. Die ganze Prozedur dauert drei Tage, aber der größte Teil innerhalb eines Tages durchgeführt werden. 1,0 Tag eins: 1,1 Thermocycling Reaktion: Original-Plasmid: Diese Mutagenese-Protokoll funktioniert am besten mit Plasmiden bis zu 10kb. Größere Plasmide sind ein bisschen schwierig, mit dieser Methode mutieren und etwas Geduld und Anpassung der Thermocycling Bedingungen und / oder der zuständigen Zellen. Außerdem das Plasmid, das Sie mit muss von einem Damm + Bakterienstamm isoliert werden. Für die Thermocycling Reaktion, die Sie benötigen 10 bis 60 ngs des Plasmids Sie mutieren. Grundierungen: Bevor Sie einrichten können Ihre Thermocycling Reaktion müssen Sie Ihre Primer zur Hand haben. Sie benötigen etwa 150 ng eines jeden mutagene Primer. Es ist ok, wenn man 1,5 ul einer 1:10 verdünnten 100 pM Bilanz zu ziehen. Es gibt ein paar einfache Richtlinien, die Sie bei der Gestaltung Ihrer mutagene Primer muss: <ul><li> Die Primer sollten komplementär zueinander </li><li> Die Primer sollten zwischen 25 und 45 Nukleotide lang sein </li><li> Die Mutationen in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid muss in beide Primer enthalten sein </li><li> Das Missverhältnis sollte in der Grundierung zentriert und flankiert von mindestens 8 Nukleotiden auf jeder Seite </li><li> Die Primer sollten eine GC-Gehalt von mindestens 40% </li><li> Die Primer sollten 5 prime und 3 prime mit einem oder mehreren Gs oder Cs Ende </li><li> Die Primer müssen nicht phosphoryliert werden, noch müssen sie FPLC oder PAGE gereinigt, lediglich entsalzt sie sein sollten. </li><li> Für die Berechnung der Tm Sie brauchen keine Formel, sondern Tm auf den Versand-Zertifikat sollte höher sein als 60 ° C. </li><li> Für Screening-Zwecke ist es praktisch, einfügen oder löschen Restriktionsstelle mit Ihrem Mutation. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes gibt es viele Möglichkeiten, um eine Restriktionsschnittstelle mit Ihrem gewünschten Mutation einfügen. Die Website des New England Biolabs bietet ein Werkzeug, um eine solche geeignete Restriktionsschnittstelle zu finden. Geben Sie einfach Ihre Primer-Sequenz kodierend für die Aminosäuresequenz Sie es wünschen, mit der Mehrdeutigkeit Code für DNA. Das Enzym-Finder-Tool wird Ihnen sagen, welche Restriktionsstellen parallel zu Ihrem gewünschten Mutation eingeführt werden. Wenn Sie nicht finden können, eine mögliche oder praktische Restriktionsstelle durch diese Weise können Sie neue Restriktionsschnittstelle ohne Bezug auf den genetischen Code an der Stelle der Mutation einfügen. Danach können Sie mit diesem Plasmid als Template für eine Reihe von Mutationen in dem dieser Restriktionsstelle durch Einfügung des neuen mutagene Primer gelöscht werden. Dieser Ansatz kann sehr praktisch, wenn Sie planen, eine Reihe von Mutationen an der gleichen Stelle des Plasmids zu tun haben. </li></ul> DNA-Polymerase: Für dieses Verfahren benötigen Sie eine thermostabile DNA-Polymerase, die 3&#39;-5 &#39;Exonuklease-Aktivität aufweist und schafft stumpfen Enden. Wir verwenden immer rekombinante Pfu-Polymerase von Fermentas. Wenn Sie Probleme mit der Verstärkung Schritte haben Sie vielleicht versuchen, eine höhere Qualität Polymerase, aber für die meisten Zwecke der Standard Pfu genug sein. Vervollständigen Sie die Reaktion mit dNTPs, Polymerase-Puffer und Wasser. 1,2 Thermocycling Bedingungen Die Thermocycler sollte in folgender Weise eingestellt werden. Die erste und wiederkehrende Denaturierung Phase ist es, 30sec bei 95 ° C eingestellt Die Annealingtemperatur der Primer darf nicht mit komplizierten Formeln berechnet werden. Wir in der Regel legen Sie die Annealingtemperatur auf 55 ° C und die Glühzeit zu einer Minute. Für Primer 25 bis 30 Nukleotiden, die Sie verwenden werden meistens funktioniert dies für uns 95% der Zeit. Jedenfalls, wenn dies nicht funktionieren sollte, versuchen Sie einfach die Variation der Annealing-Temperatur zwischen 50 - und 60 ° C. Die Dehnung ist abhängig von der Polymerase die Sie benutzen. In dieser Demonstration verwenden wir die Pfu-Polymerase von Fermentas, die für eine Dehnung Temperatur von 72 ° C nennt Die Dehnung der Zeit variiert je nach Größe des Plasmids. Wir sind immer zu berechnen 1 min pro kb, und fügen Sie eine zusätzliche Minute an, dassZeit. Zum Beispiel für eine 9kb Plasmid wir wählen würden 10min als Dehnung der Zeit. 18 Zyklen ausreichend sind, um zu schaffen genug mutierte Plasmid für die weitere Verwendung. Keeping die Anzahl der Zyklen gering ist, spart auch Zeit. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="287" /> 1,3 Gelcheck nach thermischer Reaktion Die erfolgreiche Amplifikation sollte mittels einer Elektrophorese überprüft werden. Direkt nach dem Radfahren beendet ist, laden 5 ul der Reaktion auf ein 1% TAE-Agarosegel. Wenn die Verstärkung erfolgreich war, sollten Sie eine deutliche Bande. Allerdings, wenn das neu synthetisierte DNA ist nicht deutlich sichtbar auf dem Gel, können Sie versuchen, Niederschlag der ganzen Reaktion und verwenden es für die Transformation in den nächsten Schritt. Für uns hat nur selten gearbeitet, aber es lohnt sich zu versuchen. Das Beste, was zu tun ist, wenn die Reaktion nicht funktioniert ist die Glühtemperatur anzupassen. 1,4 DpnI Verdauung: Vor Transformation der ursprünglichen Plasmid, das als Vorlage diente müssen aus der Reaktion auf starken Hintergrund zu verhindern entfernt werden. Dies wird durch Restriktionsverdau mit DpnI getan. Diese Restriktionsendonuklease schneidet nur methylierte Plasmid. Seine Anerkennung und Restriktionsstelle wird die Sequenz GATC, während A hat methyliert werden. Wenn Verdau mit DpnI nur das Original nicht mutierten Plasmid, das von einem Damm isoliert + Stamm geschnitten wird, ist das neu synthetisierte mutierte Plasmid, das nicht methylierte nicht durch DpnI betroffen. Einfach geben Sie 1-2 pl DpnI, um die Reaktion und inkubieren sie mindestens eine Stunde bei 37 °. Bei Verwendung des Schnell verdauen DpnI die Inkubationszeit kann bis etwa 15 Minuten verringert werden. Die Qualität Ihrer DpnI und die Inkubationszeit dieser Restriktionsverdau stark bestimmt, wie stark Ihr Hintergrund mit mutierten Plasmid wird. 1,5 Transformation: Nach DpnI Verdauung des Plasmids ist bereit für die Umwandlung in die zuständige E. coli-Zellen. Fügen Sie einfach 5 pl vom DpnI Abbaureaktion in die kompetenten Zellen und die Transformation wie in Ihrem Labor empfohlen. In unserem Fall verwenden wir das Hitzeschock-Verfahren durch Inkubation der Bakterien-Plasmid-Mischung auf Eis für 30 min und dann Hitzeschock es bei 42 ° C für 90 sek. Nach Zugabe von 200 ul SOC-Lösung werden die Bakterien inkubiert, kräftiges Schütteln bei 37 ° C für 1 h. Nach 1 Stunde werden die Bakterien auf die Auswahl-Agar ausplattiert. 2,0 Tag zwei 2.1 Abschirmung der Klone Teil 1: Auswahl der Klone Da die Mutation Effizienz ist nicht 100% Sie brauchen, um für Ihre Mutanten Bildschirm. Wir tun dies durch Restriktionsverdau, in denen wir prüfen für An-oder Abwesenheit der Restriktionsschnittstelle, die wir hinzugefügt oder gelöscht durch Primer-Integration. Zu diesem Zweck haben wir in der Regel abholen acht Kolonien und wachsen sie über Nacht für Plasmid-Präparation auf den nächsten Tag. 3,0 Tag drei 3,1 Screening der Klone Teil 2: Restriktionsverdau mit Markerenzym Am dritten Tag Sie eine Mini Prep und anschließende Restriktionsverdau mit Ihrem Markerenzym. Auf dem Gel können Sie dann sehen, welche Ihrer Klone tragen die gewünschte Mutation und welche nicht. Das Screening-Verfahren mit Restriktionsverdau funktioniert sehr gut. Dennoch sollten Sie Ihre erfolgreiche Mutation durch Sequenzierung bestätigt.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Seite Mutagenese ist eine Mutagenese-Verfahren, das eine schnelle Möglichkeit, ein Gen von einem Plasmid durchgeführt mutieren zur Verfügung stellt. Die gesamte Reaktion kann in nur einem Tag durchgeführt werden. Mit dieser Methode wird es brauchen nur ein Paar kostenlose Primer, die die gewünschten Mutationen und das Korrekturlesen Polymerase wie Pfu-Polymerase. Die neu synthetisierte Plasmid kann von den Eltern Plasmid durch Verdauen der Reaktion mit dem Restriktionsenzym DpnI getrennt werden. Dieses Enzym verdaut nur...

<table><tbody><tr><td>Pfu-Polymerase (rekombinant oder nativ)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 or EP0501</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix 10 mM </td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI oder DpnI Fast digest</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>entsalzt</td></tr></tbody></table>

hausgemachte mutagenese von whole plasmide

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Mit dieser Methode wird die geklonte Zielgen kann durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid verändert werden. Es funktioniert einfach durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die das gewünschte Mutation in die neu synthetisierte Plasmid integriert. In diesem Video-Tutorial zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid einzuführen. Das Protokoll arbeitet mit Standard-Reagenzien und ist unabhängig von kommerziellen Kits, die oft sehr teuer. Anwendung dieses Protokolls können die Gesamtkosten einer Reaktion auf ein Achtel von dem, was es kostet mit einigen der kommerziellen Kits reduzieren. In diesem Video, das wir auch auf kritischen Schritte Kommentar während des Prozesses und geben detaillierte Anweisungen, wie die mutagene Primer-Design.

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid mit Standard-Reagenzien einzuführen.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Die ortsspezifische Mutagenese ganzer Plasmide ist eine einfache Methode, um leicht unterschiedliche Varianten eines ursprünglichen Plasmids zu erzeugen. Mit dieser Methode wird das geklonte ...

Hallo. Mein Name ist Mark Blo. Ich bin Doktorand der Biologie an der Universität Mines in Deutschland. Heute möchten mein Freund Kajo und ich Ihnen zeigen, wie man eine hausgemachte, gezielte Neurogenese durchführt.Die Methode wurde ursprünglich von Ethal entwickelt und von vielen anderen angepasst. Wenn man heute im Internet nachsieht, findet man zahlreiche unterschiedliche Protokolle, die sich in mehr oder weniger bedeutenden Punkten unterscheiden. Heute möchten wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zeigen, die für uns gut funktioniert.Beginnen wir also. Für dieses Experiment benötigen Sie eine thermostabile, korrekturlesende DNA-Polymerase. Wir verwenden immer die PFU-Polymerase von fermenters.Logically.Sie benötigen außerdem den Polymerasepuffer, dNTP, Pufferlösung und Wasser. Des Weiteren benötigen Sie das Restriktionsenzym DpnI, kompetente E. coli-Zellen, eine Agarplatte, bakterielle Kulturbrühe und eine Reihe von Zahnstochern. Der wichtigste und entscheidende Teil dieses Verfahrens ist die Gestaltung der mutagenen Primer.Es gibt einige einfache Richtlinien, die Sie bei der Gestaltung Ihres Primerpaares beachten müssen. Die Primer sollten komplementär zueinander

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Forschung

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Biologie

Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

Quelle: Tomás, J. M., et al. Generierung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen bei der bakteriellen Motilität. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die initiatorabhängige Amplifikation eines Suizidplasmids in E. coli. Das Plasmid, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, repliziert sich nur in Gegenwart eines Initiatorproteins, das vom Wirt kodiert wird. Nach der Elektroporation und Inkubation in Rückgewinnungsmedium wird das Gemisch auf antibiotikahaltigen...

Amplifikation eines Suizidplasmids in einem bakteriellen Wirt

Quelle: Lea-Smith, D. J., et al. Generierung von markierten und markerlosen Mutanten in Modell-Cyanobakterienarten. J. Vis. Exp. (2016)Das Video zeigt eine Methode zur Erzeugung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien. Das Protokoll beginnt mit der Kultivierung von Cyanobakterien, gefolgt von Zentrifugations- und Waschschritten, bei denen die Oberflächen-Pili erhalten bleiben. Anschließend wird ein Plasmid eingeführt, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, das von homologen...

Generierung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien durch homologe Rekombination

Wir stellen ein Protokoll für die funktionelle Bewertung umfassender single-site Sättigungsmutagenese Bibliotheken von Proteinen Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet. Wichtig ist, nutzt dieser Ansatz orthogonalen Primerpaare Bibliothek Konstruktion und Sequenzierung zu multiplexen. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von TEM-1 β-Lactamase in klinisch relevanter Dosierung von Ampicillin ausgewählt werden bereitgestellt.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Erweiterung des genetischen Codes dient als ein mächtiges Werkzeug für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich Protein Acetylierung zu studieren. Hier zeigen wir, dass eine einfache Protokoll nutzen diese Technik zur Erzeugung von homogen Proteine an bestimmten Standorten in Escherichia coli Zellen acetyliert.

Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

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Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

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Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt neue Werkzeuge für SPR-Bindungsassays zur Untersuchung der CV-N-Bindung an HA, S-Glykoprotein, verwandte Hybrid-Glykane und High-Mannose-Oligosaccharide. SPR wird verwendet, um das KD für die Bindung von entweder dimerem oder monomerem CV-N an diese Glykane zu bestimmen.

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Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

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