Name: Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die optische Abbildung von Aktionspotentialen an Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit dem potentiometrischen Farbstoff Di-8-ANEPPS. Diese hochauflösende Methode ermöglicht die detaillierte Analyse der elektrischen Aktivität auf der Herzoberfläche.

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Und Beiträge an die Reizleitung Fund an der Kinderklinik Boston; Diese Arbeit wird durch Forschungsmittel von den National Institutes of Health (HL088206 HL068915) unterstützt.

Teil 1: Bereiten Sie Lösungen und der isoliert perfundierten Herzen System <ol><li> Am Morgen des Experiments beträgt 4,0 L von Krebs-Henseleit-Lösung hergestellt wie zuvor beschrieben [5, 6] beschrieben. </li><li> 11 mmol / L 2,3-Butandion Monoxim (BDM) ist in 1,0 L von Krebs-Henseleit-Lösung aus dem Perfusat in Schritt 1.1 hergestellten dekantiert aufgelöst. </li><li> Eine zusätzliche 150 ml Krebs-Henseleit ist aus dem Perfusat in Schritt 1.1 hergestellten entfernt und mit 5 mol / l di-8-ANEPPS (verdünnt aus einer 10 mmol / L Lager in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst). </li><li> 5% CO 2-Gas; Diese 3 Lösungen sind auf Wasser-ummantelten Glas Reservoire (Radnoti), wo sie sind auf 41,0 ° C vorgewärmt und mit Sauerstoff mit einem getauchten Bubbler (Radnoti) mit 0,2 um-gefiltert 95% O 2 übertragen. Lösungen aus den 3 stock Stauseen an der Wand montiert Langendorff-System mit Masterflex ™ L / S Schlauchpumpen und Low-Absorption Silikonschlauch (Cole-Parmer) gepumpt. </li><li> Vor der Montage ist die Langendorff System Glaswaren (Radnoti) sorgfältig mit E-TOXA-CLEAN-Reagenz (Sigma-Aldrich) gewaschen und gründlich mit 0,1 M / L HCl, 100% Ethanol und destilliertem Wasser gespült. </li><li> Die Nicht-Rückführung Langendorff-Apparatur wurde konstruiert, um 70 mm Hg bei konstantem Druck von 3 separate Sauerstoff Stauseen, die aus dem Herzen mit Wassermantel Heizschlangen und Blasenfallen getrennt zu liefern (Radnoti) [7]. Die 3 unabhängigen Perfusion Linien oberhalb des Herzens in zwei 3-Wege-Hähne konvergieren, so dass wir genau kontrollieren Lieferung der Lösungen in Schritten von 1,1 bis 1,3 zubereitet. Wasser-ummantelte Glas wird in Reihe mit Masterflex PharMed BPT-Schläuche (Cole-Parmer) angeschlossen und erwärmt auf 39 ° C mit destilliertem Wasser mit zwei E100-Umwälzpumpen (Lauda). Der Wärmeverlust durch die platin-veredelten Silikonschlauch (Cole-Parmer), dass der Druck-Kopf-Reservoirs verbindet sich mit dem Heizschlangen und Blasenfallen resultierte in einer 37 ° C Perfusat bis ins Herz reichen. </li></ol> Teil 2: Harvest der Ratte Herz und Set-up Langendorff Perfusion <ol><li> Um tiefe allgemeine Betäubung in 200-250 g Lewis Ratten zu induzieren, ist 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin in die Bauchhöhle injiziert. Zu dieser Mischung, fügen wir 500 U / kg Heparin auf die Blutgerinnung und Myokardischämie während der Explantation Verfahren zu verhindern. </li><li> Für einen einfachen Zugriff auf das Herz und die großen Gefäße, ist die vordere Brustwand entfernt. Danach wird das umliegende Gewebe sorgfältig seziert und die pericardial Sack öffnete. </li><li> Nach der Identifizierung der unteren Hohlvene, ist dieses Schiff mit 5-0 Seide (Ethicon) und das gesamte Herz-Lungen-Block ist explantierten ligiert. Das Gewebe wird sofort in eiskaltem Krebs-Henseleit-Lösung in einem 50 mL Becherglas auf Eis enthielt. </li><li> Die aufsteigende Aorta ist schnell identifiziert und seziert aus dem umgebenden Gewebe. Eine ausreichend große Kanüle (Harvard Apparatus) ist in die Aorta eingeführt, wobei darauf zu achten unterbrechen obligatorischen Perfusion der Koronararterien durch Einsetzen der Kanüle zu weit in die Aortenwurzel. Die Kanüle ist an der aufsteigenden Aorta mit 5-0 Seide (Ethicon) gesichert. </li><li> Die Ratte Herz wird dann auf der Langendorff-Apparatur, ohne dabei Luftblasen in die Kanüle gelegt. Retrograde koronaren vaskulären Perfusion ist nun mit dem warmen, sauerstoffreichen Krebs-Henseleit-Lösung aus der Druck-Kopf in Schritt 1.6 beschrieben aufgebaut. </li><li> Extra-Gewebe, einschließlich der Lunge, ist nun entfernt und das Herz für 20 Minuten perfundiert, um Wiederherstellung der Funktion zu ermöglichen und stabilisieren den Rhythmus. Während dieser Zeit ist eine sehr dünne Thermoelement Temperaturfühler (Cole-Parmer) in die linke Herzkammer Kavität eingebracht und vernäht mit 5-0 Prolene Naht (Ethicon). Die Sonde ist mit einer thermo-Regler (Digi-Sense) angeschlossen, um die Temperatur des Herzens zu gewährleisten ist bei 37 ° C durch eine Anpassung der Einstellungen des Wassers Kreislauf pumpen. Motion von Perfusat tropft von der Herzspitze ist, indem ein Stück Gaze in das Abwasser Behälter minimiert. </li></ol> Teil 3: Load Herz mit potentiometrischer Farbstoff und erwerben elektrografischen und optische Signale <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) ist in das Herz durch die Umstellung auf die Perfusion Zeile mit dem Krebs-Henseleit gemischt mit dem Fluoreszenzfarbstoff mit einem Hahn geladen. Darüber hinaus ist eine 18G Kanüle in der linken und / oder rechten Vorhof und zusätzlich 50 ml Farbstofflösung gelegt wird langsam in jeder dieser Kammern verabreicht, weil sie nicht ausreichend mit Farbstoff durch die Koronararterien eingeführt perfundiert. </li><li> Während des Ladevorgangs werden 3 EKG-Ableitungen (Harvard Apparatus) sanft auf der Oberfläche des Herzens, die nicht in die Richtung der Optik für die Projektion verwendet gelegt. Electrode N o 1 ist auf der hinteren apikalen Teil des linken Ventrikels, N o 2 auf dem linken Vorhof und N positioniert <su> p&gt; o 3 als Referenz-Elektrode auf der Aortenwurzel (Abbildung 1). Die atriale und ventrikuläre elektrografischen Signale werden anschließend verstärkt, digitalisiert und angezeigt neben optischen Signalen mit Hilfe der Software (Redshirt Imaging) (Abbildung 2). Ein Oszilloskop (Tektronix TDS Modell 1002) wird auch verwendet, um die Oberflächen-EKG s in Echtzeit zu visualisieren und zu angemessenen Tempo zu gewährleisten. </su></li><li> EKG-Verstärker (Hugo Sachs Elektronik) Einstellungen: High Pass Filter: 0,1 Hz Low Pass Filter: 150 Hz </li><li> Die CMOS-Kamera (Redshirt Imaging) und Makroskop positioniert ist mit der XYZ Anpassungen, so dass die Oberfläche des Herzens im Fokus ist und zentriert in der Akquisition Rahmen. Die Kamera und Optik sind auf einer Schwingungsisolierung Tabelle (Minus K Technology), um Resonanzfrequenzen zu minimieren montiert. Zur gleichen Zeit, einen koaxialen Stimulationselektrode (Harvard Apparatus) mit einem isolierten, S48 Elektro-Stimulation Einheit (Grass) kontrolliert wird, ist auf dem rechten Vorhof platziert und das Herz ist Tempo bei 300 Schlägen pro Minute (Abbildung 1). </li><li> Elektrische Stimulation (Grass) Einstellungen: Rate: 5 Impulse pro Sekunde Delay: 0,2 ms Dauer: 2 ms Volt: 6-12 V Modus: Wiederholen Pulse: Single </li><li> Für optische Aufnahmen, die Bewegungsartefakte Mangel von Kontraktion, muss das Herz elektromechanisch abgekoppelt werden. Wir tun dies, indem wieder Einschalten Perfusion Zeilen Krebs-Henseleit-Lösung, die 11 mmol / L BDM enthält. Zwischen Akquisitionen, ist das Herz mit unverfälschten Krebs-Henseleit perfundierten zur Erhaltung Lebensfähigkeit der Zubereitung. </li><li> Die Aufnahme-Parameter werden mit Hilfe der Software (Redshirt Imaging) mit folgenden Einstellungen Akquisition: Konfiguration: 2.000 Hz; 128x128 Pixel-Array Frame Interval: 0,5 ms Kamera Amplifier Gain: 5x On-Chip Gain: 8x-12Me-well Shutter: 500 ms Verzögerung Anzahl der Frames: 4000 Dauer: 2000 ms </li><li> Alle Zimmer und Ausstattung Lichter ausgeschaltet oder abgeschirmt, um Hintergrundgeräusche während der Aufnahme zu vermeiden. Die LED-Beleuchtung des Herzens nur bei der optischen Aufnahme auf Foto-Bleich-und Farbstoff Toxizität zu verringern. Die Lichtquelle Verschluss ist mit einem 5-V-Impuls über das Control Panel durch ein D-to-A Board in den Rechner (Redshirt Imaging) geliefert gesteuert. </li></ol> Teil 4: Analysieren Akquisition Informationen über Redshirt Imaging Software <ol><li> Nach dem Erwerb werden die Daten verarbeitet mit verschiedenen Filter-Einstellungen. Wir verwenden in der Regel die Standardeinstellungen außer bei der Einstellung der Band Stop / Pass-Filter, der mit der linken Grenze bei 44,0 und den rechten Rand auf 98,0 eingestellt ist. Danach werden die aufgenommenen Informationen verarbeitet und ein Film erzeugt wird (Redshirt Imaging). </li><li> Daten aus einer Akquisition entspricht der lokalen elektrischen Aktivierung bei 16.384 Seiten im Herzen Oberfläche über einen Zeitraum von 2 Sekunden. Die Software ermöglicht es, diese lokalen Signale direkt miteinander und mit der atrialen und ventrikulären elektrografischen Aufnahmen verglichen werden. Die Daten werden dann visualisiert Mapping lokalen elektrischen Aktivierung, um Farbe und Darstellung dieser Informationen als Animation zeigt die raumzeitliche elektrischen Aktivierung der kardialen Oberfläche. Zum Erstellen einer solchen Animation, verwenden wir die Software an: <ul><li> zeitlich und / oder räumlich die Daten filtern </li><li> wählen Sie eine Start-und Endzeit für die Animation </li><li> Karte optische Signale in Farbe auf ruhenden Lichtintensität der einzelnen Pixel auf </li><li> Overlay die resultierende Farbe von Daten mit einem Bild des Herzens </li><li> erzeugen die Animation </li></ul></li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Wenn der perfundierten Herzen Vorbereitung war unbeweglich während der Aufnahme, zeigen die optischen Signale eine gesonderte Spitze für jedes Pixel in einer Veränderung der Emissionsintensität von di-8-ANEPPS beteiligt. Die entsprechenden Filme (Abbildungen 3 und 4) zeigen eine Anregung Wellenfront ausbreitet über die epikardialen Oberfläche des Herzens sowie die gleichzeitig erworbene elektrografischen Aufnahmen (Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Langendorff-Herz-Setup-Diagramm für die Herzstimulationsstudie, wobei nummerierte Komponenten hervorgehoben sind." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Foto von einer Langendorff-perfundierten Herzen Vorbereitung der Darstellung der Positionen der Stimulationselektrode auf den rechten Vorhof und die EKG-Ableitungen, wie in Schritt 3.2 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Biologisches Prozessdiagramm mit Signalen; Datenanalyse der Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative optische Signale und elektrografischen Aufnahmen von einer perfundierten Lewis Ratte Herzen. Panel A zeigt ein Bild der epikardialen Oberfläche für die optische Bildgebung verwendet. Die Position der Pixel ausgewählt, um die Veränderungen in der Fluoreszenz-Emission im Laufe der Zeit in Panel B zeigen, sind durch farbige Pfeile angedeutet. Elektrographische Signale werden in Panel C mit der roten Linie, die atriale Aktivierung und die hellblaue Linie entspricht der ventrikulären Signal angezeigt. Bitteve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt; Klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild zu sehen.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses im Kinderkrankenhaus Boston gesetzt durchgeführt.

Die Entfernung des Herzens von narkotisierten Ratten müssen schnell durchgeführt werden, um Myokardischämie zu vermeiden. Wenn Ischämie oder unzureichender Koronarperfusion auftritt, wird das Herz wahrscheinlich entwickeln Arrhythmien und kann sich Infarkt. Darüber hinaus wird diese Herzen zeigen unzureichende Fluoreszenzemission für informative Aufnahmen und anschließende Analysen. Vor dem Einlegen der Farbstoff, müssen Herzmuskelzellen in angemessener Weise mit Krebs-Henseleit-Lösung perfundiert werden zur Schaffung u...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Ausstattung</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CardioPlex-Software</td><td>Ausstattung</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle LUXEON LED 460–490 nm</td><td>Ausstattung</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>ECG-Verstärker Typ 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Ausstattung</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Dichroischer Spiegel 505 nm</td><td>Ausstattung</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emotionsfilter 605 nm Langpass</td><td>Ausstattung</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Sideways</td><td>Ausstattung</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Kugelgelenkhalter</td><td>Ausstattung</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Stimulations-Elektroden-Sets</td><td>Ausstattung</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>BM-6 Tischplattform zur Schwingungsisolierung</td><td>Ausstattung</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Monopolare EKG-Elektrode</td><td>Ausstattung</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Rollenpumpe SCI 400</td><td>Ausstattung</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Rollenpumpe MasterFlex Easy Load II</td><td>Ausstattung</td><td>Cole-Parmer</td><td>Modell 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch Marprene #14</td><td>Ausstattung</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex-Schlauch</td><td>Ausstattung</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>S48 Rechteckimpuls-Stimulator</td><td>Ausstattung</td><td>Grass Technologies</td><td>Modell S48</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 HF-TRANSFORMATOR-ISOLATIONSEINHEIT</td><td>Ausstattung</td><td>Grass Technologies</td><td>Modell SIU5</td><td></td></tr><tr><td>5-Liter-Wassermantelreservoir</td><td>Ausstattung</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Liter-Wassermantelreservoir</td><td>Ausstattung</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>0,5-Liter-Wassermantelreservoir</td><td>Ausstattung</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>0,25-Liter-Wassermantelreservoir</td><td>Ausstattung</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>10-ml-Heizspule</td><td>Ausstattung</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Komplianz-Blasenfalle</td><td>Ausstattung</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Trennkatheter</td><td>Ausstattung</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwegehahn, FLL auf MLT, ohne Portabdeckungen</td><td>Ausstattung</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Thermoelement-Thermometer</td><td>Ausstattung</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine flexible Mikrosonde der IT-Serie</td><td>Ausstattung</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop Tektronix TDS 1002</td><td>Ausstattung</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandionmonoxim</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin HCl</td><td>Reagenz</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Reagenz</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

optische abbildung von langendorff-perfundierten rattenherzen

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optische Abbildung der Herz-Oberfläche mit Spannungs-Fluoreszenzfarbstoffe ist zu einem wichtigen Werkzeug, um elektrische Erregung in experimentellen Modellen zu untersuchen, die Reichweite in der Skala von Zellkulturen ganzen Organe<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Mit State-of-the-art optische bildgebende Systeme, Entstehung und Ausbreitung der Aktionspotentiale während des normalen Herzrhythmus oder über Einleitung und Aufrechterhaltung von Herzrhythmusstörungen können visualisiert werden fast augenblicklich<sup&gt; [1]</sup&gt;. Die neuesten im Handel erhältlichen Systeme können Informationen auf außerordentlich hohe räumlich-zeitliche Auflösungen bieten und waren auf custom-built Geräte zunächst entwickelt wurde, um die Hindernisse um mehr konventionellen elektrophysiologischen Methoden verhängt überwinden<sup&gt; [1]</sup&gt;. Fortschritte in hoher Auflösung und High-Speed-komplementäre Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS)-Kameras und intensiv helle, Licht emittierende Dioden (LEDs) sowie spannungsabhängigen Farbstoffen, Optik und Filter haben damit begonnen, elektrisches Signal Akquisition machen praktisch für Herz-Kreislauf-Zell-Biologen, die mehr daran gewöhnt, die Arbeit mit Mikroskopen sind. Obwohl die neueste Generation von CMOS-Kameras 10.000 Frames pro Sekunde auf einem 16.384 Pixel-Array, abhängig von der Art der Probenvorbereitung erwerben können, seit langem etablierten Fluoreszenz Erwerb Technologien wie Fotodioden-Arrays, Laser-Scanning-Systeme und gekühlten Charged-Coupled Device (CCD Kameras) noch einige deutliche Vorteile in Bezug auf Dynamik, Signal-Rausch-Verhältnis und Quanteneffizienz<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. In der vorliegenden Studie wurden Lewis Rattenherzen perfundierten<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mit einer kristalloiden Perfusat (Krebs-Henseleit-Lösung) bei 37 ° C auf einer modifizierten Langendorff-Apparatur. Nach einer 20 minütigen Stabilisierungsphase wurden die Herzen zeitweise mit 11 mmol / L 2,3-Butandion Monoxim perfundierten zur Kontraktion-assoziierte Bewegung während der Bildaufnahme zu beseitigen. Für die optische Abbildung, luden wir Herzen mit dem schnell ansprechenden potentiometrische Sonde di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) und kurz beleuchtet die Vorbereitung mit 475 ± 15 nm Anregungslicht. Während eines typischen 2 Sekunden Dauer der Beleuchtung, war&gt; 605 nm Licht von der kardialen Vorbereitung emittiert mit einem High-Speed ​​CMOS-Kamera angeschlossen, um eine horizontale Makroskop abgebildet. Für diese Demonstration wurden Herzen schritt bei 300 Schlägen pro Minute mit einem koaxialen Elektrode verbunden, um eine isolierte elektrische Stimulation Einheit. Gleichzeitige bipolaren elektrografischen Aufnahmen wurden erworben und zusammen mit der Spannungssignale mit leicht verfügbaren Software analysiert. Auf diese Weise können Aktionspotentiale auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen werden visualisiert und registriert mit elektrografischen Signale.

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Das optische Mapping der Herzoberfläche mit spannungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffen hat sich zu einem wichtigen Instrument für die Untersuchung der elektrischen Erregung in ...

Hallo, ich bin Yon Ziv aus dem Labor von Dr. Cohen in der Abteilung für Anästhesiologie am Kinderkrankenhaus und der Howard Medical School. Heute werden wir ein Verfahren zur optischen Abbildung in über den LAD perfundierten isolierten Herzen zeigen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Ausbreitung elektrischer Aktivität auf der Herzoberfläche zu untersuchen.Beginnen wir also. Am Morgen des Experiments bereiten Sie vier Liter Krebs-Henselit-Lösung zu. Nach dem Ansetzen der Lösung entfernen Sie ungelöste Partikel mittels Vakuumfiltration durch einen 200-Mikron-Filter.Zunächst lösen Sie 11 Millimol BDM in einem Liter der hergestellten Krebs-Henzel-Lite-Lösung. Danach geben Sie 10 Millimolar D8-NFS in DMSO in eine weitere Portion von 100 Milliliter Krebs-Henzel-Lite, um eine Endkonzentration von 5 Mikromolar D8-Annex in der Lösung zu erreichen. Die mit Wasser gefüllten Glasreservoirs, der Befeuchter und das hier verwendete Glasmaterial stammen alle von red.Naughty.Überführen Sie die beiden Lösungen in die Reservoire, die auf 41 Grad Celsius vorgewärmt wurden. Sauerstoffen Sie die Lösungen mit einem 0,2-Mikron-gefilterten Gas unter Verwendung einer untergetauchten Bubblervorrichtung. Leiten Sie die Lösungen aus den drei Vorratsreservoiren mithilfe peristaltischer Pumpen und Silikonschläuchen mit geringer Absorption durch das an der Wand befestigte Ling-Endorf-System, um das Rattenherz zu gewinnen. Führen Sie zunächst eine intraperitoneale Injektion eines 200 bis 250 Gramm schweren Lewis-Rattens mit Ketamin und Xylazin durch, um eine tiefe Vollnarkose zu induzieren, sowie mit Heparin, um Blutgerinnung und myokardiale Ischämie während der Entnahme zu verhindern.Sobald die Ratte vollständig anästhesiert ist und nicht auf einen Zehenquetschreiz reagiert, entfernen Sie das Herz. Beginnen Sie die Operation, indem Sie zuerst die vordere Brustwand entfernen, um leichteren Zugang zum Herzen und den großen Gefäßen zu erhalten. Danach dissezieren Sie vorsichtig das umliegende Gewebe und öffnen die Perikardhöhle.Nachdem die untere Hohlvene identifiziert wurde, wird dieses Gefäß mit fünf 0-Proline-Nähten ligiert und der gesamte Herz-Lungen-Block entnommen. Das Gewebe sofort in eiskalte Krebs-Henseleit-Lösung in einem 50-Milliliter-Becher auf Eis legen, rasch die aufsteigende Aorta identifizieren und von dem umgebenden Gewebe freilegen. Eine passend dimensionierte Kanüle in die Aorta einführen.Darauf achten, die Kanüle nicht zu tief in die Aortenwurzel einzuführen und dadurch die obligatorische Perfusion der Koronararterien zu unterbrechen. Die Kanüle an der aufsteigenden Aorta befestigen. Anschließend das Rattenherz am Ling-Endorf-Apparat platzieren, wobei Luftblasen in der Kanüle vermieden werden müssen.Die retrograde koronare Gefäßperfusion erfolgt nun mit der warmen, oxygenierten Krebs-Henseleit-Lösung. Entfernen Sie vom Druckkopf des Ling-Endorf-Apparats nach der Reinigung zusätzliches Gewebe einschließlich der Lunge und perfundieren Sie das Herz 20 Minuten lang, um die Wiederherstellung der Funktion zu ermöglichen und den Rhythmus zu stabilisieren, während das Herz perfundiert wird. Führen Sie eine sehr dünne Thermoelement-Temperatursonde in den linken Ventrikelhohlraum ein.Nähen Sie die Sonde mit fünf 0-Prolen-Nähten an Ort und Stelle und stellen Sie die Einstellungen der Wasserkreislaufpumpen so ein, dass die Temperatur des Herzens bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Minimieren Sie Bewegungen, die durch das Tropfen der Perfusate vom Herzscheitelpunkt verursacht werden. Indem ein Stück Mull in den Abflussbehälter gelegt wird, ist das Herz nun bereit, mit dem potentiometrischen Farbstoff beladen zu werden, um elektrografische und optische Signale aufzuzeichnen und den potentiometrischen Farbstoff Dye 8 NEPs in das Herz einzubringen.Wechseln Sie zur Perfusionsleitung, die Krebs enthält, also Licht, gemischt mit fluoreszierendem Farbstoff. Da die Vorhöfe nicht ausreichend mit Farbstoff, der über die Koronararterien eingeleitet wird, perfundiert werden, wird eine Kanüle mit 18 Gauge in den linken und/oder rechten Vorhof platziert. Zusätzlich werden langsam jeweils 50 Milliliter Farbstofflösung in diese Kammern verabreicht.Während des Beladungsverfahrens platzieren Sie vorsichtig drei EKG-Ableitungen auf der Oberfläche des Herzens, und zwar auf der Seite, die nicht den für die Abbildung verwendeten Optiken zugewandt ist. Die erste Elektrode wird am hinteren apikalen Bereich des linken Ventrikels positioniert.Der zweite wird am linken Vorhof platziert und der dritte dient als Referenzelektrode an der Aortenwurzel. Die elektrografischen Signale von Vorhof und Ventrikel werden anschließend verstärkt, digitalisiert und mithilfe der Software als optische Signale dargestellt. Ein Oszilloskop wird ebenfalls verwendet, um die Oberflächen-EKGs in Echtzeit zu visualisieren und eine ausreichende Stimulation sicherzustellen.Stellen Sie den EKG-Verstärker auf 0,1 Hertz für den Hochpassfilter und auf 150 Hertz für den Tiefpassfilter ein. Positionieren Sie die Kamera für die CMOs mithilfe der X-, Y-, Z-Verstellungen. Ein Glasstück, das in der Fokusebene der Kamera positioniert ist, wird auf die Oberfläche des Herzens gelegt, sodass der interessierende Bereich scharf und mittig im Aufnahmerahmen liegt. Die Kamera und die Optik sind auf einem vibrationsgedämpften Tisch montiert, um Resonanzfrequenzen zu minimieren.Gleichzeitig platzieren Sie auf dem rechten Vorhof eine koaxiale Pacing-Elektrode, die über eine isolierte elektrische Stimulationsvorrichtung S 48 gesteuert wird. Damit wird das Herz mit 300 Schlägen pro Minute stimuliert. Stellen Sie die elektrische Stimulation wie folgt ein.Die Frequenz sollte fünf Impulse pro Sekunde betragen, mit einer Verzögerung von 0,2 Millisekunden, einer Stimulationsdauer von zwei Millisekunden und einer Stärke von sechs bis 12 Volt sowie dem Modus „Wiederholung“ und „Einzelimpuls“. Um optische Aufnahmen zu erhalten, die keine Bewegungsartefakte durch Kontraktion aufweisen, muss das Herz elektromechanisch entkoppelt werden. Dies erreichen Sie erneut, indem Sie die Perfusionsleitungen auf eine Krebs-Henseleit-Lösung umschalten, die 11 Millimolar BDM enthält.Zwischen den Aufnahmen. Perfundieren Sie das Herz mit unverfälschter Krebs-HENSELEIT-Lösung, um die Lebensfähigkeit des Präparats zu erhalten. Konfigurieren Sie die Software-Aufnahmeparameter auf 2000 Hertz mit einem 128 × 128 Pixel umfassenden Array.Das Bildintervall sollte auf 0,5 Millisekunden eingestellt werden, und die Verstärkungen sollten auf fünf x für den Kamera-Verstärker und acht x für die On-Chip-Verstärkung gesetzt werden. Die On-Chip-Verstärkung sollte außerdem auf 12 eingestellt werden. Stellen Sie in der Software die Kamerasteuerung auf eine Verschlussverzögerung von 500 Millisekunden ein und nehmen Sie 4.000 Bilder mit einer Dauer von 2000 Millisekunden auf.Schalten Sie alle Raum- und Gerätebeleuchtungen aus oder verdecken Sie diese, um Hintergrundrauschen während der Aufnahme zu vermeiden; das LED-Licht erhellt das Herz nur während der optischen Aufnahme. Um die Photoausbleichung und die Toxizität des Farbstoffs zu reduzieren, steuern Sie den Verschluss der Lichtquelle mittels eines fünf Volt-Impulses, der über die Steuerungseinheit über eine D/A-Karte im Computer nach der Aufnahme übertragen wird. Verarbeiten Sie die Daten mit unterschiedlichen Filtereinstellungen.Die Standardeinstellungen werden im Allgemeinen verwendet, mit Ausnahme der Anpassung des Bandstoppfilters, der mit der linken Grenze bei 44,0 und der rechten Grenze bei 98,0 festgelegt wird. Anschließend werden die aufgezeichneten Informationen verarbeitet und zur Erstellung eines Films genutzt. Die Daten einer Aufnahme entsprechen der lokalen elektrischen Aktivierung an 16.384 Stellen auf der Herzoberfläche über einen Zeitraum von zwei Sekunden.Die Software ermöglicht es, diese lokalen Signale direkt miteinander sowie mit den elektrografischen Ableitungen von Vorhof und Ventrikel zu vergleichen, indem die lokale elektrische Aktivierung farblich dargestellt und als Animation der räumlich-zeitlichen elektrischen Aktivierung auf der Herzoberfläche wiedergegeben wird. Um eine solche Animation zu erstellen, filtern Sie zunächst die Daten zeitlich und/oder räumlich mithilfe der Software. Anschließend wählen Sie einen Start- und Endzeitpunkt für die Animation aus.Drittens werden optische Signale basierend auf der Ruheleuchtdichte jedes Pixels farblich kodiert. Viertens wird das resultierende Farbdatenbild mit einer Abbildung des Herzens überlagert, und schließlich wird die Animation erstellt, sofern die perfundierte Herzpräparation während der Aufnahme bewegungslos war. Während der Aufnahme zeigen die optischen Signale für jedes Pixel, das an einer Änderung der Emissionsintensität von D eight anep beteiligt ist, jeweils einen charakteristischen Peak. Diese Echtzeit-Bildaufnahmen veranschaulichen eine sich über die epikardiale Oberfläche des Herzens fortpflanzende Erregungsfront sowie gleichzeitig aufgezeichnete elektrografische Signale.Wir haben soeben eine hochauflösende Technik zur optischen Abbildung der Aktionspotentialsausbreitung auf der Oberfläche eines Alanor perfundierten roten Herzens demonstriert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Herz rasch aus dem anästhesierten Roten zu entnehmen. Um myokardiale Ischämie zu vermeiden, müssen die myokardialen Zellen ausreichend perfundiert sein und das Herz vollständig mit wasserempfindlichem Farbstoff beladen sein.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung der Methodik und Ergebnisse der gleichzeitigen endokardiale und epikardialen optische Abbildung der elektrischen Erregung in der intakten linken Vorhof eines Langendorff-perfundierten Schafe Herzen während stretch-induzierten Vorhofflimmern.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

In diesem Video führen wir die retrograde Langendorff-Perfusion eines isolierten Mausherzens durch. Während des Eingriffs wird die Herzaktivität des Herzens aufrechterhalten, indem es retrograd mit einer Perfusionslösung über die Herzkranzgefäße perfundiert wird, wobei eine Kanüle in die aufsteigende Aorta eingeführt wird. Das Modell wird verwendet, um die kardiale Pathophysiologie des Herzens zu untersuchen.

Retrograde Langendorff-Herzperfusion: Eine ex vivo-Technik zur Perfusion isolierter Mausherzen

Das isolierte Rattenherz ist ein dauerhaftes Modell für Ischämie-Reperfusionsschäden. Hier beschreiben wir den Prozess der Entnahme des schlagenden Herzens von einer Ratte mittels in situ Aortenkanüle, der Langendorff-Perfusion des Herzens, der simulierten Ischämie-Reperfusionsverletzung und der Infarktfärbung, um das Ausmaß des ischämischen Insults zu bestätigen.

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Untersuchung der Herzdynamik anhand eines translationalen Tiermodells zu etablieren. Der beschriebene experimentelle Ansatz beinhaltet eine duale Emissions-Optokardiographie in Verbindung mit einer elektrophysiologischen Studie zur Beurteilung der elektrischen Aktivität in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell.

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

Lernen Sie die optische Abbildung von Aktionspotentialen an Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit dem potentiometrischen Farbstoff Di-8-ANEPPS. Diese hochauflösende Methode ermöglicht die detaillierte Analyse der elektrischen Aktivität auf der Herzoberfläche.

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

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