Name: Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Lernen Sie die Mikromanipulation von Saccharomyces cerevisiae für meiotische Genanalysen. Diese Methode ermöglicht die präzise Selektion diploider Zygoten und die Dissektion von Asci zur Genotypisierung.

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Arbeiten in Laboratorium des Autors wird von der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, der Natural Sciences and Engineering Research Council und der Concordia University gefördert.

Bau der diploiden Stämme Protokoll für die Herstellung von Diploiden durch Paarung <ol><li> Die ersten Stämme sollte auf YPD oder selektiven Medium getroffen werden, wenn nötig, einzelne Kolonien zu produzieren. Die beiden haploiden Stämmen sollte der entgegengesetzten Paarungstyps (dh Mata und MATα) werden. </li><li> Mit einer sterilen Impföse holen einen kleinen Teil einer Kolonie von einer der beiden haploiden Stämmen. Auf einer neuen YPD Platte Streifen die Schleife einmal in einer geraden Linie über die Platte. Markieren Sie die Richtung der Streifen mit einem Pfeil an der Unterseite der Platte. </li><li> Wiederholen Sie dies für den zweiten Stamm auf dem gleichen YPD Platte. Diesmal Streifen der Kolonie senkrecht zu den ersten, überqueren den ersten Streifen mit dem zweiten. Markieren Sie die Richtung des zweiten Streifen und notieren Sie den Bereich, wo der zweite Streifen kreuzt die erste. Dieser Bereich ist, wo Diploiden produziert werden. </li><li> Inkubieren Sie die YPD Platte bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Replica Platte der YPD Platte auf selektiven Medien, die selektiv erlauben wird sich das Wachstum der neu gebildeten Diploiden. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie, falls möglich, einen kleinen Teil der diploiden Streifen und Streifen auf dem gleichen selektiven Medium, um einzelne Kolonien zu erzeugen. </li></ol> Sporulation und Verdauung von Asci Protokoll <ol><li> Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte oben und kleine (1cm x 1cm) Flecken auf Sporulation (SPO) Platten und Inkubation bei 30 ° C für 3-7 Tage zur Sporulation. </li><li> Sporulation kann anhand der Zellen, die aus jedem Patch unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Legen Sie die Zellen auf einem Objektträger in 5-10 l Wasser, legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen, und schauen auf das Vorhandensein von Asci. Wenn Asci nicht leicht zu finden sind dann legte zurück in den Inkubator. </li><li> Wenn es einen wirksamen Sporulation in einer der Patches, bereiten ein steriles 15 ml konische Röhrchen mit 100 &amp;mgr; l der Tetrade Saft. </li><li> Pick-Zellen aus diesem Sporulation Patch mit einer sterilen Impföse 3mm (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und in der Tetrade Saft. Vorsichtig schwenken die Schleife, damit die Zellen zu fallen die Schleife und vermischen sich mit der Lösung. </li><li> Lassen Sie in Tetrade Saft (mit Zymolyase) für 4-10 Minuten (abhängig von der Konzentration und Aktivität von Zymolyase und der Stamm selbst). Dies ermöglicht für die Verdauung der Zellwand umgibt die Ascosporen. </li><li> Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte. </li><li> Optional. Reaktion kann durch Zugabe von 1 ml eiskaltem sterilen dH 2 O gestoppt werden Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten zu begleichen. Entfernen 1ml aus dem Überstand anschließend leicht mischen mit der Hand und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nehmen 5μL der verdauten Zellen aus Schritt 5 und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 3mm Impföse sehr vorsichtig die Tropfen 1-3 mal in einer Linie verteilt, während kaum Kontakt mit dem Agar. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar aufnehmen (Wenn Schritt 7 angegeben ist, wird dies, wenn die Verdauung der äußeren Zellwand reduziert werden oder zu stoppen). Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop. </li></ol> Dissection der Asci Protokoll Beachten Sie, dass die folgenden Protokoll für einen Singer MSM System 200 Mikromanipulation Mikroskop beschrieben. Dieses Protokoll kann mit geringfügigen Änderungen, wenn mit einer manuellen Mikromanipulator wie Zeiss Mikromanipulator MR gefolgt werden. <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen. </li><li> Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen. </li><li> Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie einen Asci. Vorzugsweise wählen Asci, die in Bereichen, in denen die Zellen gut verteilt werden sind. Vermeiden Sie Bereiche mit Zellhaufen. Die vier Ascosporen aus einer Asci sollte noch miteinander verbunden werden. Zwei Ascosporen kann etwas größer sein als die anderen beiden. Vermeiden Sie Kommissionierung Asci, wo man Ascosporen ist locker und nicht auf den Rest der Ascosporen verbunden. </li><li> Pick up Ascus mit der Nadel. Langsam bringen die Nadel bis auf den Teller. Wenn der Schatten des Mikronadel gesehen wird, säumen diese mit dem Ascus, gepflückt zu werden. Wieder Ansatz der Nadel bis zum schwarzen Umriss eines Kreises (die Spitze der Nadel) zu sehen ist. Berühren Sie die Tetrade mit diesem Kreis und dann schnell ziehen Sie die Nadel entfernt. Achten Sie darauf, alle vier Ascosporen aus einem Ascus haben, um die Nadel eingehalten und dass keine weiteren Zellen wurden auf der Mikronadel, die nicht Teil dieser Ascus versammelt. </li><li> Ziehen Sie die Mikronadel weit weg von der Platte und gehen Sie zu der Matrix (für die ersten Ascus, gehen Sie zuPosition A1). Beachten Sie jede Position, wo ein Ascus ist umgezogen. Legen Sie die Ascus sich durch Berühren der Platte mit der Mikronadel und wegziehen, bis alle vier Ascosporen kommen aus dem Mikronadel. Leichtes Ausschlagen der Nadel Arm oder die Plattform Halten der YPD Platte ist oft bei diesem Schritt hilfreich. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3-5 und Platz Asci sich an aufeinander folgenden Positionen in der Matrix, bis die gewünschte Anzahl von Asci haben abgeholt worden. </li><li> Gehen Sie zurück zu jedem Ascus und brechen die vier Zellen abgesehen von Hänseleien mit der Nadel, tippen die Plattform sanft oder eine Kombination aus beidem. Pick-up die Zellen verlassen hintereinander in eine neue Position in der Matrix, bis jeder Ascosporen in jedem Ascus in Viererreihen getrennt ist. </li><li> Legen Sie die YPD Platte in einem Brutschrank bei 30 ° C für mehrere Tage, um das Wachstum Muster zu beobachten. </li><li> Replica Platte der sezierten Zellen selektiven Medium, wenn nötig. </li></ol> Umzug von Zygoten Protokoll <ol><li> Streak aus zwei haploiden Stämme mit entgegengesetzten Paarungstypen auf das entsprechende Medium, einzelne Kolonien zu erhalten. </li><li> Mate diesen beiden Stämmen wie oben beschrieben und lassen von 4 bis 6 Stunden (oder über Nacht, wenn notwendig) zu wachsen. </li><li> Prüfen Sie, ob Zygoten unter einem Lichtmikroskop. Zygoten als hantelförmige Zellen entweder mit oder ohne eine Knospe erscheinen. </li><li> Pick-Zellen mit einem 3mm Impföse (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und platzieren Sie sanft in 100 &amp;mgr; l sterilem dH 2 O. </li><li> Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte. </li><li> Nehmen 5μL und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte. </li><li> Verwenden Sie einen 3mm Impföse die Tropfen in einer Linie sehr sanft verteilen, während kaum Kontakt mit dem Agar. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar zu absorbieren. Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen. </li><li> Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen. </li><li> Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie eine Zygote. </li><li> Pick-up eine Zygote mit der Nadel. </li><li> Legen Sie Zygoten individuell auf die Matrix. </li><li> Lassen Zygoten für mehrere Tage wachsen. </li><li> Replica Platte die Zygoten auf die entsprechenden selektiven Medium. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Abbildung 1: Die Paarung von zwei haploiden Stämme gegenüber Paarungstypen erzeugt eine diploide Stamm. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Abbildung 2: (A) A YPD-Platte mit thre Ergebnisse einer Paarung zwischen einer Temperatur sensiblen Stamm (mit einem leu2 Auxotrophie) und einem Wildtyp-Stamm (LEU2). Aufgeschlossenen Zellen sind in der Inokulum Region auf der linken Seite, wo dicke Wachstum zwischen den beiden schwarzen Linien gesehen zu verbreiten. Asci, die seziert haben zu wachsen gleichmäßig in der Matrix auf der rechten Seite angeordnet. (B) Die Platte in (A) wurde auf eine SD-Leucin Drop-out-Platte repliziert. Beachten Sie das 2:2 Wachstum für die LEU2 Marker zeigt ein validiertes Ascosporen seziert wurde. (C) Die Platte in (A) wurde auf eine YPD Platte repliziert und bei 37 ° C. Beachten Sie das 2:2 Wachstum, das eine weitere Bestätigung, dass ein Ascosporen seziert wurde.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

Hefe Dissektion ist ein nützliches Werkzeug, um neue Sorten mit den gewünschten Marker auszuwählen. Bei der Ermittlung des theoretischen Wachstumsmuster von vier Ascosporen ist es wichtig, bei der Genotyp des vegetativen Zelle aussehen. Wenn ein Plasmid vorhanden ist, muss man wissen, wenn es einzelne, niedrige oder hohe Kopie ist, da dies Auswirkungen auf die Ascosporen (s) das Plasmid erhalten und wird Prognosen und Schlussfolgerungen in Bezug auf die Stämme manipuliert zu beeinflussen. Be...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Mikroskop</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Reagenz</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Hefenitrogenbase</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Trypton</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Adeninsulfat</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Reagenz</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Reagenz</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

präparation saccharomyces cerevisiae asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Hefe ist ein sehr praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet werden, um viele verschiedene zelluläre Prozesse zu studieren. Das gemeinsame Labor-Stamm<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Gibt es entweder in einer haploiden oder diploiden Zustand. Die Fähigkeit, Allele von zwei Haploiden kombinieren und die Möglichkeit, Änderungen an dem Genom einzuführen erfordert die Herstellung und Präparation von Asci. Asci Produktion von haploiden Zellen beginnt mit der Paarung von zwei Hefe haploiden Stämmen mit kompatiblen Paarungstypen eine diploide Stamm zu produzieren. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten entweder auf einem festen Medium oder in flüssiger erreicht werden. Es ist vorteilhaft, für den Diploiden in Medium, das selektiv fördert ihr Wachstum im Vergleich zu entweder der haploiden Stämme auszuwählen. Die Diploiden sind dann erlaubt, auf nährstoffarmen Medium sporulieren zu Asci, ein Bündel von vier haploide Tochterzellen, die aus meiotischen Reproduktion der diploiden Form. Eine Mischung aus vegetativen Zellen und Asci wird dann mit dem Enzym Zymolyase zu verdauen entfernt die Membran sac um die Ascosporen der Asci behandelt. Mit Mikromanipulation mit einem Mikronadel unter einem Dissektionsmikroskop ein aufzuheben können einzelne Asci und trennen und verlagern die vier ascopores. Dissected Asci sind für mehrere Tage gewachsen und getestet für die Marker oder Allele von Interesse durch Replika-Plattierung auf geeigneten selektiven Medien.

Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Hefe ist ein hochgradig handhabbares Modellsystem, das zur Untersuchung vieler verschiedener zellulärer Prozesse eingesetzt wird. Der gängige Laborstamm Saccharomyces cerevisiae ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Kreuzung zweier genetisch unterschiedlicher Hefe-Zellen. Diploide Zellen werden durch Abdruckplattierung auf Medium ausgewählt, das nur das Wachstum der Diploiden erlaubt. Die Diploiden werden anschließend als Flecken auf Stationärplatten übertragen oder es bilden sich Asci.Die Ascien werden disseziert, wobei die Haploiden an einer definierten Stelle auf der Platte platziert werden. Sobald die resultierenden Haploiden zu sichtbaren Kolonien angewachsen sind, wird die Platte auf ein ausgewähltes Medium repliziert, um das Genotyp der einzelnen Zellen zu bestimmen. Hallo, ich bin Adrian Morris.Und ich bin Audrey Mahe. Wir stammen aus dem Labor von Dr. Michael Satcher an der Universität Concordia in Montreal. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Dissektion von Hefe-Asken, die üblicherweise als ra bezeichnet werden.Verwenden Sie dieses Verfahren in unserem Labor, um Haplo-D-Stämme mit neuartigen Genotypen zu erzeugen und die Effekte der Kombination zweier Mutationen zu untersuchen. Beginnen wir damit, einen diploiden Stamm herzustellen, indem zwei Haplo-Stämme entgegengesetzter Kopplungstypen miteinander verpaart werden. Die Haplo-Stämme werden zunächst auf geeignetem Medium – in unserem Fall YPD – ausgestrichen, um Einzelkolonien mittels eines sterilen Inokulationsöschers zu erhalten; nehmen Sie einen kleinen Teil einer Kolonie von einem der beiden Haplo-Stämme und streichen Sie diesen mit dem Öser auf eine neue YPD-Platte.Wenn sich die Kolonien in einer geraden Linie über die Platte erstrecken, markieren Sie die Strichrichtung mit einem Pfeil auf der Unterseite der Platte. Danach entnehmen Sie einen kleinen Teil einer Kolonie des anderen Haplo-Stamms von derselben YPD-Platte. Streichen Sie die Kolonie senkrecht zum ersten Stamm, sodass der zweite Strich den ersten kreuzt, und beachten Sie dabei die Richtung des zweiten Strichs.Beachten Sie außerdem den Bereich, in dem die zweite Strichlinie die erste kreuzt. In diesem Bereich werden die Diploide gebildet.Die YPD-Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach der über Nacht erfolgten Inkubation die YPD-Platte mittels Abdruckverfahren auf ein Selektionsmedium übertragen, das selektiv das Wachstum der neu gebildeten Diploide zulässt. Die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren.Nachdem die Diploide auf der Platte gewachsen sind, sollte, falls möglich, eine einzelne Kolonie oder ein kleiner Teil des Diploidstrichs auf die gleiche selektive Nährung überstrichen werden, um einzelne Kolonien zu erzeugen. Sobald der diploide Stamm erhalten wurde, einzelne Kolonien abisolieren und kleine Ansätze auf Sporulationsplatten anlegen. Zur Sporulation bei 30 Grad Celsius für drei bis sieben Tage inkubieren.Um die Sporulation zu überprüfen, betrachten Sie Zellen von jedem Patch unter einem Lichtmikroskop. Geben Sie Zellen auf einen Objektträger und fügen Sie fünf bis zehn Mikroliter Wasser hinzu.Legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen und prüfen Sie das Vorhandensein von Asci. Falls Asci nicht oder nur schwer zu finden sind, stellen Sie die Platte in den Inkubator. Wenn in einem der Flecken eine effektive Sporulation erfolgt ist, bereiten Sie ein steriles 15-Milliliter-Konischgefäß mit 100&nbsp;Mikrolitern Tetra-Saft vor.Entnehmen Sie Zellen aus diesem Sporulationsbereich mit einer sterilen dreimillimeterigen Inokulationschleife und geben Sie sie in den Tetradensaft. Drehen Sie die Schleife vorsichtig, damit die Zellen von der Schleife abfallen und sich mit der Lösung vermischen. Lassen Sie die Zellen vier bis zehn Minuten im Tetradensaft.Dies ermöglicht die Verdauung der Zellwand, die die ASCO-Sporen umgibt. Um eine Platte für die Dissektion von Asci vorzubereiten, markieren Sie die Ober- und Unterseite des Inokulationsbereichs auf einer YPD-Platte. Wenn die Zellen ausreichend verdaut sind, entnehmen Sie fünf Mikroliter der verdauten Zellen und geben Sie vorsichtig Tropfen in einer Linie in den Inokulationsbereich der vormarkierten YPD-Platte mit einer sterilen dreimillimeterigen Inokulationsöse.Verteilen Sie die Tropfen äußerst vorsichtig ein- bis dreimal in einer Linie, wobei Sie kaum mit dem Auger in Kontakt kommen. Lassen Sie die Flüssigkeit in den Auger eindringen. Nun sind Sie bereit, mit der Dissektion der Asci zu beginnen.Um mit der Dissektion der Asci zu beginnen, stellen Sie die Dissektionsplatte unter das Mikromanipulationsmikroskop Singer MSM 200. Fokussieren Sie einen Bereich der Platte, bei dem die Hälfte des Sichtfelds Zellen enthält und die andere Hälfte leer ist. Bringen Sie die Nadel langsam in den Fokus, sodass sie den leeren Bereich des Felds berührt.Der Kontakt zwischen der Nadel und dem Agar zeigt sich als dunkler schwarzer Kreis, der langsam scharf gestellt wird. Nachdem die Nadel das Aer berührt hat, ziehen Sie sie leicht zurück und prüfen Sie, ob keine Zellen in dem Bereich abgesetzt wurden, in dem die Nadel das Aer berührt hat. Dies gewährleistet, dass die Nadel keine Zellen aus einer vorherigen Verwendung enthält.Gehen Sie zur Matrix an Position A1 und setzen Sie eine Markierung, indem Sie die Bohrspindel einstechen. Auch dies dient dazu, die Orientierung der Platte zu bestimmen. Falls sie entfernt wird, muss dies erfolgen, bevor die Dissektion abgeschlossen ist.Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie einen Ascus. Die vier ASCUS-Sporen eines ASCUS sollten noch miteinander verbunden sein.Zwei ASCUS-Sporen können etwas größer sein als die anderen beiden. Vermeiden Sie es, Asci auszuwählen, bei denen eine ASCA-Spore lose ist und nicht mit den übrigen ASCA-Sporen verbunden ist. Um einen Ascus aufzunehmen, führen Sie die Nadel langsam zur Platte hin auf.Wenn der Schatten der Mikronadel sichtbar ist, richten Sie ihn mit dem zu isolierenden Asci aus. Bewegen Sie die Nadel, bis die schwarze Kontur eines Kreises sichtbar ist. Berühren Sie das Tetrad mit diesem Kreis und ziehen Sie die Nadel dann schnell zurück.Stellen Sie sicher, dass alle vier Sporen aus einem Askozyten an der Nadel haften und dass keine zusätzlichen Zellen, die nicht zu diesem Askozyten gehören, von der Mikronadel aufgenommen wurden. Sobald der Askozyt von der Mikronadel aufgenommen wurde, ziehen Sie die Mikronadel weit vom Objektträger weg und begeben Sie sich zur Matrix. Für den ersten Askozyten gehen Sie zur Position a1.Platzieren Sie das Asko, indem Sie die Platte mit der Mikronadel berühren und wegziehen, bis alle vier Askosporen sanft von der Mikronadel abgehen. Gelegentlich ist es hilfreich, leicht den Nadelausleger oder die Plattform, die die YPD-Platte hält, anzuklopfen. In diesem Schritt.Fahren Sie fort, Asci auf der Matrix nacheinander zu lokalisieren, aufzuheben und abzulegen, bis die gewünschte Anzahl an ASCI erhalten wurde. Notieren Sie sich jede Position, an der ein ASCUS verschoben wurde. Wenn die gewünschte Anzahl an Asci aufgenommen wurde, kehren Sie zu jedem „ask us“ zurück und trennen die vier Zellen voneinander, indem Sie mit der Nadel vorsichtig auseinanderziehen, das Plattform sanft antippen oder beides kombinieren.Heben Sie die Zellen auf, wobei eine zurückbleibt. Übertragen Sie die verbleibende Zelle. Bitten Sie E, eine neue Position in der Matrix einzunehmen, und wiederholen Sie dies, bis jede Anfrage bearbeitet ist.APO in jedem Ascus ist in Reihen zu je vier getrennt. Eine Dissektion der Asci ist abgeschlossen. Stellen Sie die YPD-Platte mehrere Tage lang in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius, um das Wachstumsmuster zu beobachten.Sobald die dissezierten Ascus auf der replikierten Platte auf selektivem Medium gewachsen sind, müssen sie repliziert werden. Gegebenenfalls handelt es sich um eine Platte, die repliziert wurde, wobei sowohl die ursprüngliche Dissektionsplatte als auch die selektive Platte über Nacht inkubiert wurden. Die auf der selektiven Platte sichtbaren Ergebnisse müssen ausgewertet werden, und die entsprechende haploide Zelle muss identifiziert und ausgewählt werden.Wenn Diploide auf Selektivplatten nicht identifiziert werden können, müssen manuell gepaarte Haploide, sogenannte Zygote, ausgewählt werden, die bereits in einem frühen Stadium nach der Paarung leicht zu erkennen sind. Das Verfahren zur Herstellung der Haploiden und zur Paarung ist identisch mit dem zuvor beschriebenen, mit dem Unterschied, dass der Bereich, in dem der Diploid liegen sollte, nach kürzeren Inkubationszeiten bei 30 Grad Celsius untersucht wird. Wir haben festgestellt, dass vier bis sechs Stunden ein guter Ausgangspunkt sind, die genaue Dauer sollte jedoch letztendlich empirisch bestimmt werden.Unter dem Lichtmikroskop auf Zygoten prüfen; Zygoten erscheinen als dumbbell-förmige Zellen, entweder mit oder ohne Knospe. Zellen mit einer dreimillimeterigen Inokulationschleife aufnehmen und vorsichtig in 100 Mikroliter steriler Wasser geben. Nachdem die Zellen auf eine vormarkierte YPD-Platte übertragen wurden, die Tropfen mit einer dreimillimeterigen Inokulationschleife sanft zu einer Linie ausstreichen, wobei man kaum Kontakt mit dem Agar hat. Zulassen, dass die Flüssigkeit in den Agar eindringt.Fortfahren zum Dissektionsmikroskop. Fokussieren Sie einen Bereich der Platte, bei dem die Hälfte des Sichtfelds Zellen enthält und die andere Hälfte leer ist. Bringen Sie die Nadel langsam in den Fokus ein, sodass sie den leeren Bereich des Sichtfelds berührt.Wie zuvor gezeigt, überprüfen Sie, ob sich an der Nadel keine Zellen aus einer vorherigen Verwendung befinden. Gehen Sie zur Matrix an Position A1 und machen Sie eine Markierung, indem Sie das Bohrfutter durchstechen.Erneut, um die Ausrichtung der Platte zu bestimmen. Wechseln Sie in den Suchmodus und lokalisieren Sie eine Zygote. Nehmen Sie die Zygote mit der Nadel auf.Platzieren Sie die Zygote einzeln auf die Matrix. Lassen Sie die Zygote mehrere Tage lang wachsen. Übertragen Sie die diploiden Zellen mit einer Abstreiftechnik auf Sporulationsplatten und fahren Sie wie im dritten Teil beschrieben fort.Die Verpaarung zweier haploider Stämme mit entgegengesetzten Verpaarungstypen erzeugt einen diploiden Stamm. Diese YPD-Platte zeigt das Ergebnis einer Verpaarung zwischen einem temperatursensitiven Stamm mit einer lu two-Ox-Atrophie und einem Wildtyp-Stamm. Verdauene Stämme wurden im Inokulationsbereich links ausgestrichen, wo zwischen den beiden schwarzen Linien ein dichtes Wachstum zu sehen ist.Die ausgezählten Asci wachsen gleichmäßig verteilt in der Matrix rechts. Als dieser YPD-Agar mit einem SD-Leucin-Auswahlmedium repliziert wurde, beobachten wir das Zwei-zu-zwei-Wachstum für das LEU2-Marker-Gen, was darauf hinweist, dass eine valide ASCO-Spore ausgezählt wurde. Die ursprüngliche YPD-Platte wurde außerdem auf eine weitere YPD-Platte repliziert und bei einer höheren Temperatur von 37 Grad Celsius inkubiert, wobei das Zwei-zu-zwei-Wachstum weiterhin bestätigt, dass eine ASCO-Spore ausgezählt wurde.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man zwei Haploidzellen herstellt und Diploide auswählt. Basierend auf zwei verschiedenen Methoden, wobei die eine trophische Marker verwendet und die andere auf der Zellmorphologie beruht. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist es äußerst wichtig, sich daran zu erinnern, die neu konstruierten Haploidzellen aus einer Tetraden-Dissektion auszuwählen, bei der die atrophischen Marker wie vorhergesagt exprimiert werden.Es ist außerdem wichtig, darauf zu achten, weder zu stark noch zu schwach zu verdauen. Die Tetras, bei denen die Ascen nicht zusammenblieben, wurden überverdaut, während Tetraden, die unterverdaut wurden, schwer auseinanderzubrechen sind. Das war's also.Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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