Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Um die Lebensdauer in C Elgan zu messen, wird eine alterssynchronisierte Population mit einem zeitlich getakteten Eier-Lang reproduktiv erzeugt. Aktive adulte Hermaphroditenwürmer werden auf Nematoden-Wachstumsplatten übertragen, die mit UV-abgetötetem E. coli besät sind, dürfen sechs bis acht Stunden Eier legen und werden dann in den nächsten zwei Tagen entfernt; aus diesen Eiern schlüpfen die Würmer und wachsen bis zum L-4-Larvenstadium. Die L-Four-Würmer werden auf neue NGM-Platten mit Ampicillin transferiert, um eine lebende bakterielle Kontamination zu verhindern, und FUDR, um Fortpflanzung zu verhindern, und dürfen sich zu Erwachsenen entwickeln.

Von diesem Zeitpunkt an werden die erwachsenen Würmer alle zwei bis drei Tage beobachtet, bis alle Würmer abgestorben sind. Zu jedem Zeitpunkt werden tote Würmer von der Platte entfernt und die Anzahl lebender und toter Würmer erfasst. Ich bin George Seton aus dem Labor von Matt Capline in der Pathologieabteilung der University of Washington.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie die Lebenserwartung messen und unsere Hepatitis-Eleganz entdecken können. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Genetik des Alterns zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Ein grundlegendes Lebensdauer-Experiment erfordert zwei Arten von Platten: Standard-NGM-Platten, die keine Zusatzstoffe enthalten, und AMP-FUDR-Platten, bei denen sowohl Ampicillin- als auch Fluordeoxyuridin dem NGM zugesetzt werden. Beide Plattentypen sind mit E. coli OP 50-Bakterien besetzt, die anschließend durch UV-Exposition getötet werden. Beginnen Sie damit, 10 Milliliter NGM-Lösung herzustellen.

Per 60-Millimeter-Petrischale schmelzen feste NGM vollständig durch Mikrowellenverbrennung in 32. Sekunden. Wirbeln Sie das Medium zwischen den Pulsen, um zu verhindern, dass sich unter Druck stehende Gasblasen ansammeln, und platzieren Sie flüssiges NGM in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius oder auf der Werkbank, damit das Medium abkühlen kann. Sobald das Medium auf 55 Grad Celsius abgekühlt ist, dann sollten Sie den Glasbehälter bequem mit bloßen Händen halten können, um Medikamente hinzuzufügen.

Und um Teller für Teller mit Medikamenten zu gießen, fügen Sie 33 Mikroliter 150 millimolare FUDR und 100 Mikroliter 100 Milligramm pro Milliliter hinzu. Ampicillin pro 100-Milliliter-NGM und Wirbeln zur Mischung von Ampicillin wird verwendet, um fremde bakterielle Kontaminationen zu verhindern, und FUDR, um das Schlüpfen von Eiern zu verhindern. Würmer müssen also nicht alle paar Tage übertragen werden, um sie von wachsenden Larven zu trennen.

Gieße nun das Medium und lasse die Platten zwei Tage lang auf der Werkbank trocknen, am Tag bevor die Platten mit einer einzelnen Kolonie aus einem frischen E. coli-Streifen fertig getrocknet sind. OP 50 Bakterien auf der LB-Schnecke. Bereiten Sie mindestens 0,5 Milliliter-Kultur pro 60-Millimeter-Platte vor.

Geben Sie die OP 50-Kultur in einen 37-Grad-Schüttler und lassen Sie die Bakterien über Nacht wachsen. Am nächsten Tag pelletiert man die OP-50-Bakterien mit 3.500 g Zentrifugalkraft für 10 Minuten. Dekantiere genug von dem Supernatant, um die Bakterien bei einer 10-fachen Konzentration wieder aufzuhängen.

Nun inokulieren Sie jede Platte mit 100 Mikrolitern der konzentrierten Kultur. Vermeiden Sie es, die Pipettenspitze an der Oberfläche des NGM zu berühren, da Mängel in der Oberfläche des Mediums es den Würmern ermöglichen, Wirbelplatten einzugraben, bis die Bakterien den zentralen Bereich des NGM bedecken, ohne die Plattenwände zu erreichen, und die Platten 24 Stunden auf der Werkbank trocknen lassen. Nach dem Trocknen setzen wir die Oberfläche der Platten einer UV-Dosis aus, die stark genug ist, um das Bakterienwachstum zu stoppen; wir verwenden einen Strata-Gen-UV-Straddle-Linker 2, 400.

Beginnen Sie damit, die Platten ohne Deckel in den Straddle-Linker zu laden. Jetzt Druck auf Energie. Gib 9 9 9 9 auf dem Tastenfeld ein und drücke Start.

Die Platten werden etwa fünf Minuten lang UV-Strahlung ausgesetzt. Platten mit UV-abgetöteten Bakterien können bis zu einem Monat kopfüber bei vier Grad Celsius gelagert werden. Dieser Abschnitt beschreibt, wie man eine Wurmpopulation mit einem gemeinsamen Schlüpfdatum erzeugt.

Beginnen Sie damit, etwa 20 junge erwachsene Würmer auf eine frische NGM-Platte ohne Medikamente zu transferieren. Lassen Sie den Teller etwa eine Woche lang bei 25 Grad Celsius stehen, damit die Würmer sich vermehren und innerhalb einer Woche alle bakteriellen Nahrungsmittel verzehren können. Neu geschlüpfte Würmer im Wachstumsstoppstadium sollten 20 bis 30 Wittenlarven ohne Medikamente auf eine frische NGM-Platte transferiert und bei 25 Grad Celsius in Gegenwart von Nahrung inkubiert werden.

Die Wittumlarven werden innerhalb von zwei Tagen reproduktiv aktive Erwachsene und bleiben danach noch einige Tage reproduktiv aktiv. Nun werden 10 bis 15 der reproduktiv aktiven Erwachsenen auf eine frische NGM-Platte übertragen, ohne Medikamente. Diese Platte wird als zeitlich abgelegte Eierplatte oder TEL-Platte bezeichnet.

Lassen Sie die TEL-Platte bei 25 Grad Celsius, damit die Würmer Eier legen können. Die Tiere, die aus diesen Eiern schlüpfen, sind Versuchstiere, deren Lebensdauer nach sechs Stunden bewertet wird. Überprüfen Sie die TEL-Platte auf Eier.

Wenn noch nicht genug Eier vorhanden sind, lassen Sie die TEL-Platte bis zu 24 Stunden bei 25 Grad Celsius stehen. Ich schaue regelmäßig nach Eiern. Wenn genügend Eier gelegt wurden, nehmen Sie die erwachsenen Tiere von der TEL-Platte.

Ein typisches Lebensdauer-Experiment benötigt 30 bis 90 Eier pro Versuchsgruppe, aber auf einer einzelnen TEL-Platte können mehrere hundert Eier erzeugt werden. Etwa 150 Eier werden von 10 bis 15 reproduktiv aktiven Erwachsenen innerhalb von sechs bis acht Stunden abgelegt. Beim Vergleich experimenteller Gruppen kann statistische Signifikanswerte für große Lebenserwartungsunterschiede mit nur 30 Tieren erreicht werden.

Mehr Tiere sollten verwendet werden, um bescheidenere Unterschiede zu unterscheiden. Nun wird die TEL-Platte ohne Erwachsene bei 20 Grad Celsius gesetzt, bis die Eier geschlüpft sind und die Würmer sich bis zum L-4-Larvenstadium entwickelt haben. Das dauert normalerweise zwei Tage für Wildtyp-C-Elegance, kann aber länger dauern bei Stämmen mit langsam entwickelnden Phänotypen.

Dieser Abschnitt beschreibt, wie man das Leben einer alterssynchronisierten Bevölkerung verfolgt. Zuerst wird die L-4-Larve von der TEL-Platte auf sitzende AMP-FUDR-Platten übertragen. Für jede getestete Dehnung oder Bedingung ist es üblich, zwei bis drei Platten mit 25 bis 30 Würmern pro Platte aufzustellen.

Inkubieren Sie die AMP FUDR-Platten bei 20 Grad Celsius für 24 Stunden. Anschließend werden die Würmer, Medien und Bakterien visuell auf frische AMP-FUDR-Platten untersucht. Wenn die Würmer den Großteil der bakteriellen Nahrung gefressen haben, geschieht dies typischerweise ein- bis zweimal pro Woche.

Früh im Experiment, wenn eine signifikante Anzahl von Larven vorhanden ist, deutet dies meist darauf hin, dass die Würmer als junge Erwachsene auf die AMP-FUDR-Platten übertragen wurden, statt als L-Fours. Junge Erwachsene können Eier legen, bevor das FUDR wirkt, und gelegentlich entkommen die Larven den Auswirkungen des FUDR und wachsen zu erwachsenen Tieren heran. Diese Larven verheiraten das Experiment in dieser Situation, übertragen die erwachsenen Würmer auf frische Platten und entsorgen die alten Platten mit den Larven.

Würmer sollten auch auf frische Platten übertragen werden, wenn lebende, wachsende Bakterien beobachtet werden. In der Regel sorgt die Kombination aus AMP- und UV-Tötung dafür, dass keine lebenden Bakterien das Experiment kontaminieren, aber gelegentlich kommt es vor. Übertragen Sie außerdem die Würmer.

Wenn Pilzwachstum auf den Medien beobachtet wird. Wenn er früh genug entdeckt wird, kann der Pilz mit einer Pipettenspitze oder einem Spatel entfernt werden. Sobald er größer als ein paar Millimeter Durchmesser hat, ist es in der Regel einfacher, die Würmer auf eine neue Platte zu übertragen.

Bewerten Sie alle Würmer für die Lebensdauer alle zwei bis drei Tage. Verwendung eines Dissektionsmikroskops. Bestimmen Sie, ob jeder Wurm lebt oder tot ist.

Klopfe sanft auf den Teller. Der Wurm lebt, wenn er sich als Reaktion auf das Klopfen bewegt. Wenn der Wurm nicht auf das Tippen der Platte reagiert, zoome auf den Kopfbereich heran und tippe sanft mit einem Platin-Transfer-Pick auf den Kopf des Wurms.

Zähle den Wurm als tot. Wenn er nicht reagiert, indem er den Kopf bewegt, entferne den toten Wurm von der Platte. Nachdem Sie alle Würmer überprüft haben, notieren Sie das Datum und die Anzahl der lebenden und toten Würmer.

Würmer, die auf festem Material gehalten werden, entkommen gelegentlich von der Plattenoberfläche, indem sie sich eingraben oder an der Wand hochkriechen. Würmer, die fliehen, werden in der Studie komplett ausgelassen. Wenn Sie fertig sind, bringen Sie die Platten zurück in den 20-Grad-Inkubator.

Warte noch zwei bis drei Tage und überprüfe dann erneut die Kennzeichen. Setze dieses Programm fort, bis alle Würmer gestorben sind. Die Anzahl der Würmer, die an einem Tag sterben, wird typischerweise umgekehrt, um den Anteil der an jedem Tag lebenden Würmer zu berechnen; diese Daten werden grafisch als Überlebenskurve dargestellt, wobei der Tag der zeitlich begrenzten Eiablage betrachtet wird.

Tag null. Die typische mittlere Lebenserwartung für N zwei. Der See-Elgan-Wildtyp-Stamm, der mit UV-Kill-Bakterien bei 20 Grad Celsius betrieben wird, dauert etwa 25 Tage gemessen aus dem Ei.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Lebenserwartung misst und Eleganz erkennt. Dieses grundlegende Verfahren kann man modifizieren, um verschiedene Umweltbedingungen zu testen, darunter Ernährungseinschränkungen und RNA-Interferenz, was im unterstützenden Text behandelt wird. Das war's also.

Danke fürs Zuschauen und viel Glück bei deinem Experiment.