Name: Homarus americanus stomatogastrischen Nervous System Dissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Lernen Sie die Feindissektion des stomatogastrischen Nervensystems von Homarus americanus für neurobiologische Studien. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Ganglien und Nerven für funktionale Analysen.

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Wir möchten unsere Berater, Dr. Eva Marder erkennen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health gewährt NS17813 zu Eva Marder und NS059255 zu AE T. unterstützt

Vor Beginn dieses Protokoll den Magen des Hummers muss vom Tier entfernt werden und wie in der Begleiter JoVE Artikel (Bierman &amp; Tobin, 2009) beschrieben. Die Mehrheit der unten beschriebenen Schritte sind unter einem Dissektionsmikroskop durchgeführt werden. Teil I-Isolierung der kommissuralen Ganglia <ol><li> Richten Sie die Schüssel, so dass das vordere Ende (von der Lippe) weg von Ihnen und dem hinteren Ende (durch den Pylorus) zu Ihnen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Magen merken ist, dass er so flach wie möglich liegt auf dem Teller. <ol><li> Pin durch die Speiseröhre auf jeder Seite der Lippe. </li><li> Falls erforderlich, ordnen die anderen Stifte während die Brutto-Dissektion platziert. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Unterhaut. <ol><li> Besorgen Sie sich die Unterhaut in der Nähe des gm2/gm3 Muskeln, lösen sie aus dieser Muskeln und sanft in die Richtung nach vorne zu ziehen. </li><li> Separate der Unterhaut von der darunter liegenden Fett durch Schnippeln keine Verbindungen. Verwenden Sie erhöhte Sorgfalt um die zentrale Arterie, die ein wichtiger Bestandteil der stomatogastrischen Nervensystem umgibt. Verlassen Sie die Unterhaut intakt innerhalb von etwa einer 0,5 cm Radius des stomatogastrischen Ganglion, das zwischen den GM1b Muskeln sitzt. </li><li> Cut off getrennt Unterhaut. </li></ol></li><li> Trennen Sie das Gehirn aus dem darunter liegenden Gewebe. <ol><li> Identifizieren Sie die zwei großen kommissuralen Nerven, die bilateral-Projekt aus dem vorderen Teil des Gehirns, die kommissuralen Ganglien in den vorderen Teil des Magens. </li><li> Sieht man von diesen Nerven intakt, heben das Gehirn mit einer Pinzette und geschnitten, um das Gehirn vom Rest des Gewebes zu trennen. Achten Sie darauf, wie Sie dies tun, wie die stomatogastrischen Nerv unterhalb des Gehirns ist und muss beibehalten werden. </li></ol></li><li> Trennen Sie die kommissuralen Ganglien aus den umliegenden Gewebe. <ol><li> Folgen Sie einem der kommissuralen Nerven zu einem der kommissuralen Ganglien. </li><li> Identifizieren Sie die Ionen und Sohn - diese Nerven müssen intakt bleiben. Die kommissuralen Ganglion haben viele Nerven ausstrahlen. Cut die meisten von ihnen (mit Ausnahme der Ionen und Sohn), aber lassen Sie einen zusätzlichen Nerven an der kommissuralen Ganglion in Position zu halten, während Sie die Dissektion zu beenden. </li><li> Wiederholen Sie mit den anderen kommissuralen Ganglion. </li></ol></li><li> Reinigen Sie die Ionen und Sohn von lateral nach medial. Verlassen Sie die labiale Nerv intakt auf das Nervensystem, den Magen zu verankern. Die Schlundganglion sitzt wurden die Ionen s schneiden. Sie können unter ihm durch Greifen der unteren Herzkammer Nerven und zog bis unter frei geschnitten. </li></ol> Teil II-Isolierung der stomatogastrischen Ganglion (STG) und die verbleibenden Nerven. <ol start="7"><li> Trennen Sie die STG aus den umliegenden Gewebe. <ol><li> Die STG sitzt in einer Arterie, die zwischen den GM1b Muskeln und bis in die gm2a, b Muskeln führt. Achten Sie auf das abgeschnittene Ende der Arterie in der Nähe des gm2a, b Muskeln. </li><li> Ziehen Sie das abgeschnittene Ende der Arterie und nach vorne, um die dvn aussetzen. Weiter nach oben ziehen, bis Sie das Niveau der übrigen Hypodermis zu erreichen. Einmal getrennt, kann die Arterie auf die Ebene, wo es auf die restlichen Unterhaut getrimmt werden. </li><li> Schneiden Sie die Muskellappen, dass in der Tribüne des Hummers befand. </li><li> Heben Sie die Unterhaut oberhalb der Arterie, die Beobachtung, dass die Arterie einen Tunnel in das Fett über dem STG macht. Legen Sie ein Blatt von der Schere im Inneren der Arterie und schneiden den Muskel darüber. Überprüfen Sie, dass Sie die dvn sehen, wie Sie sicher sein, Sie werden sicher über dem STG geschnitten. Weiter Schnitt nach vorne, nach der Arterie. Wie Sie oben im STG geschnitten, werden Sie sehen können, die stn ausgehen anterior von der STG und Abtauchen in den Muskel. Weiter Schneiden nach vorne eine vollständige Trennung des Muskels oberhalb des STG. </li><li> Löschen Sie alle Gewebe entfernt von der stn. </li></ol></li><li> Trennen Sie die agn s aus dem umgebenden Gewebe. (Auch wenn Sie nicht vorhaben, von der agn aufnehmen, werden Sie ein Teil des intakten Nerven müssen festzunageln das Ganglion für die intrazelluläre Aufnahme.) <ol><li> Um besser zu sehen, die agn s, entfernen Sie die restlichen Unterhaut und eine dünne Schicht der darunter liegenden Muskeln. </li><li> Unmittelbar hinter der STG, identifizieren einen dunklen Tunnel in der Fett-und Muskelgewebe auf beiden Seiten des dvn. </li><li> Stick eine Schere Klinge im Inneren des Tunnels und schneiden das Gewebe über dem Nerv. Weiter Schnitt seitlich, im Anschluss an die Nerven, um es zu isolieren. (Ein paar Millimeter ist ausreichend für Pinning das Ganglion, sondern entlarven mindestens 5 mm von der agn, wenn Sie von ihm aufnehmen möchten.) </li><li> Lösen Sie die agn aus dem Muskel es innerviert, indem die Verbindungen. </li><li> Wiederholen Sie auf der anderen Seite auf die andere agn isolieren. </li><li> Sobald beide agn s haben seziert worden, schneiden alle Muskeln und Gewebe verbindet die STG in den Magen. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die mvn s. Sie sind ein bilaterales Paar kleiner Nerven abzweigen der LVN und Verfahrgeschwindigkeit seitlich unterhalb des Fettes. <ol><li> Entweder mit einer Schere oder zwei Zangen durch das Fett auf der einen Seite des dvn geschnitten, in der Nähe, wo es Filialen in den beiden lvn s. Hier sind Sie weit entfernt von der mvn s und wird es nicht riskieren, schneidet sie. </li><li> Heben Sie die Fettschicht, und identifizieren Sie die kleinen mvn darunter. Diese Nerven laufen medial nach lateral direkt hinter dem Niveau des GM1b Muskeln. </li><li> Entfernen Sie die Fettschicht über den mvn, so dass der Nerv intakt jetzt so wird es nicht verheddert. Sie werden ihre seitlichen Ende aus dem Off den Magen Schnitt am Ende der Präparation. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite auf die andere mvn isolieren. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die lvn s und hinteren Nerven. <ol><li> Ab wo die lvn s Filiale seitlich vom dvn, folgen einem lvn indem das Fett darüber. Abhängig von der Vorbereitung, manchmal die ganze Fettschicht über dem Nerv kann abgezogen werden. </li><li> Weiter enthüllt die lvn bis zu dem Punkt, wo die psn abzweigt. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die PYN. <ol><li> Suchen Sie die PYN, es ist ein Nerv reist nach hinten über den Pylorus. </li><li> Entfernen Sie die dünne Membran, die dieser Region. </li><li> Isolieren Sie die PYN, indem ein kleiner Teil des Pylorus, an der PYN. </li><li> Heben Sie den Pylorus Abschnitt und schneiden das Gewebe auf beiden Seiten des PYN, bis Sie den Zweig, der pdn legt zu erreichen. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die PDN. <ol><li> Suchen Sie die pdn, es ist ein Nerv reist nach hinten, um den Pylorus Dilatator Muskel. </li><li> Schneiden Sie einen kleinen Ausschnitt des Pylorus Dilatator Muskel, an der pdn. </li><li> Heben Sie den Pylorus Dilatator Muskel Abschnitt weggeschnitten das Gewebe auf beiden Seiten des pdn, bis Sie den Zweig, der PYN legt zu erreichen. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die ventralen lvn, dass die PYN und pdn verbindet sich mit dem LVN. <ol><li> Auf der dreieckigen Filiale Punkt, wo die PYN und pdn der ventralen lvn verbinden, isolieren, jeder kleine Abschnitt der Nerv, zweigt der ventralen lvn, wie die vpln. Dies wird als Griff verwendet werden, um auf der Bauchseite lvn ziehen. </li><li> Heben Sie den Griff und schneiden das Gewebe auf beiden Seiten des ventralen lvn, arbeiten in der Richtung nach vorne, bis Sie den Punkt erreichen, wo die psn abzweigt. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 10 bis 13 des LVN und hinteren Nerven auf der anderen Seite zu isolieren. </li><li> Lösen Sie die stomatogastrischen Nervensystem aus dem Magen. <ol><li> Um vollständig zu lösen die lvn aus dem Bauch, auf dem PSN zu ziehen und schneiden Sie alle Gewebe und Nerven an der LVN und ventralen LVN, mit Ausnahme der pdn und PYN. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite. </li><li> Schneiden Sie die seitlichen Ende jeder mvn. Heben Sie die seitlichen Ende und schneiden alle überflüssigen Anlagen zwischen den Nerv und die zugrunde liegenden Magengewebe. </li><li> Am vorderen Ende, schneiden alle überflüssigen Anlagen der kommissuralen Ganglien, und schneiden Sie die labiale Nerven auf jeder Seite. </li><li> Optisch scannen stomatogastrischen Nervensystem System zur Identifizierung und dann schneiden Sie keine zusätzlichen Anhänge in den Magen Gewebe. </li><li> Schnappen Sie auf das vordere Ende der beiden kommissuralen Nerven, über dem kommissuralen Ganglien, und ziehen Sie die stomatogastrischen Nervensystem aus dem Magen und verschieben Sie es auf der Seite der Schale. Wie Sie dies tun, schneiden alle verbleibenden Anlagen für das Nervensystem frei. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die kleinen Sylgard Gericht. <ol><li> Rub einige Magengewebe gründlich auf die Oberfläche des Sylgard in die kleine Schale. Dadurch verringert sich die Hydrophobie der Sylgard, so dass Kochsalzlösung wird gleichmäßig verteilt über das Gericht. </li><li> Spülen und füllen Sie die Sylgard Gericht mit gekühlter Kochsalzlösung. </li></ol></li><li> Übertragen des Nervensystems auf die vorbereitete Sylgard Gericht durch Ergreifen des vorderen Enden der beiden kommissuralen Nerven, die Aufhebung des Nervensystems aus der großen Schüssel und legte es in die kleine Schale. </li><li> Pin der Tln in die kleine Schale mit einer Kombination aus minuten Stifte und dünner Stifte aus Wolframdraht geschnitten. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Vorbereitung Dorsalseite wird durch die Überprüfung, dass die minderwertigen ventrikuläre Nerv ist weg von der Sylgard zeigt. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und die Pin kommissuralen Nerven. </li><li> Ziehen Sie das Nervensystem eng und flach, indem jeder der psn s hinten und seitlich und Pinning sie nieder. </li><li> Entfernen Sie den Pylorus Dilatator Muskel von der pdn s, und Pin die pdn s. </li><li> Entfernen Sie diePylorus Segment aus dem PYN s, und Pin die PYN s. </li><li> Pin, um alle verbleibenden isolierten Nerven wie die labiale Nerven, die mvn s und agn s. </li></ol></li><li> Desheath der STG. <ol><li> Sicherstellen, dass die STG ist gegen die Sylgard flach und straff gehalten durch den seitlichen agn s, der vorderen und der hinteren stn dvn. </li><li> Ordnen Sie die Beleuchtung, um die Visualisierung der Axone im dvn ermöglichen. </li><li> Mit einem kleinen Stift oder feinen Wolfram-Nadel, machen Sie einen kleinen flachen Loch in der Scheide um die dvn, unmittelbar hinter der STG. </li><li> Ziehen Sie die Nadel in der dvn, dorsal der Axone, um einen horizontalen Riss in der Nervenscheide zu schaffen. </li><li> Besorgen Sie sich die Klappe des Nervenscheide hinter der STG und ziehen nach vorne, um den Mantel von der Rückenseite des STG zu entfernen. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Abkürzungen: </td></tr><tr><td> Tln </td><td> Stomatogastrischen Nervensystems </td></tr><tr><td> STG </td><td> Stomatogastrischen Ganglion </td></tr><tr><td> CoG </td><td> Kommissuralen Ganglion </td></tr><tr><td> stn </td><td> stomatogastrischen Nerven </td></tr><tr><td> mvn </td><td> medial ventrikuläre Nerven </td></tr><tr><td> Ion </td><td> inferior ösophagealen Nerven </td></tr><tr><td> Sohn </td><td> überlegen ösophagealen Nerven </td></tr><tr><td> agn </td><td> Magenvorderwand Nerven </td></tr><tr><td> dvn </td><td> dorsalen ventrikulären Nerven </td></tr><tr><td> lvn </td><td> lateralen Ventrikel Nerven </td></tr><tr><td> psn </td><td> hinteren Magen Nerven </td></tr><tr><td> vpln </td><td> ventralen hinteren seitlichen Nerven </td></tr><tr><td> PYN </td><td> Pylorus Nerven </td></tr><tr><td> pdn </td><td> Pylorus Dilatator Nerven </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

Die Anatomie der Hummer Magen und Tln wurde auch zuvor 5,6, beschrieben und Variationen dieser Sektion Verfahren wurden in zahlreichen Studien eingesetzt worden. Wir empfehlen vertraut zu machen mit der Anatomie des Magen 5-7 und Tln 5,8 vor Beginn der Dissektion. Solche Vertrautheit verringert die Gefahr des zufälligen Schäden an Nerven und Gewebe. Zur Erhaltung der Gesundheit der Vorbereitung ist es wichtig, auf die Vorbereitung an einem kühlen Temperatur zu halten. Dies geschieht durch einfachen Austausch der Kochsalzlösung alle 30 Minuten mit 4 ˚ C Kochsalzlösung in einem Kühlschrank aufbewahrt erreicht. Wenn in kalter Kochsalzlösung eingetaucht ist das isolierte Tln Vorbereitung lebensfähig für viele Stunden. Recordings in Zusammenhang Homarus gammarus über stabile rhythmische Aktivität von der STG nachgewiesen ganzen 5 Tage in vitro 9; ähnlich Robustheit hat in H. gesehen worden americanus (pers. Beob.). Modulatorischer Eingang des STG vom kommissuralen Ganglien ist erforderlich, um den laufenden Motor Muster zu erhalten. Daher die Aufrechterhaltung eines normalen rhythmische Aktivität dieser Ganglien und das Ion, Sohn und stn Nerven müssen intakt gehalten werden. Die Dissektion beschreiben wir bewahrt mehreren motorischen Nerven (mit Motoneuronen Axone): Die agn s (mit Magen-Mill (GM) Axone), die mvn s (mit Lateral Gastric (LG) und Inferior Cardiac (IC) Axone), die PYN s (mit Pylorusstenose Neuron (PY) Axone), die pdn s (mit Pylorusstenose Dilatator (PD) Axone) und der lvn s (mit Lateral Pylorusstenose (LP), mediale Gastric (MG), LPG ​​Axone als auch solche von GM, PD und PY). Durch Sezieren zusätzliche (oder anders) Nerven, können andere Motoneuronen Axone aufgezeichnet werden. Jede einzelne Art der motorischen Neurons Axon können einzeln durch Sezieren und die Aufnahme von Nerven innervieren die Muskeln, auf die aufgezeichnet werden, die Art der Neuron-Projekte. Diese Vorbereitung kann für eine Vielzahl von Studien über die Funktion des Nervensystems fokussiert eingesetzt werden. Die Aktivität der Neuronen aufgezeichnet entweder mittels intrazellulärer, scharfe Elektrode Aufnahmen von Somata oder Axonen, oder durch die Aufnahme elektrischer Impulse extrazellulär von den Nerven sein. Viele Ionenkanäle in der STG Neuronen wurden teilweise kloniert und mRNA kann von Hand abgezogen Somata 10,11 gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>Dünner Wolframdraht (0,001 Zoll Durchmesser)</td><td>Werkzeug</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>In 1–2 mm lange Stücke schneiden, um sie als feine Stifte zu verwenden.</td></tr><tr><td>Pinzette Nr. 5</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Minuten-Nadeln</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria-Federschere (7-mm-Klingen)</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Dies sind die hochwertigsten Modelle. Günstigere Federscheren sind vom selben Hersteller erhältlich.</td></tr><tr><td>Petri-Schale (100 × 15 mm)</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Mit 2–4 mm Sylgard 182 füllen.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Sonstiges</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Optional. Die Entmantelung kann allein mit Schere und feiner Pinzette durchgeführt werden.</td></tr><tr><td>Sehr feine Pinzette Nr. 5SF</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Wolfram-Nadeln</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Optional. Die Entmantelung kann mit Schere oder mit aus dünnem Wolframdraht geschnittenen Stiften erfolgen.</td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

homarus americanus stomatogastrischen nervous system dissection

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Mit dem Ziel, das Verständnis, wie das Nervensystem Aktivität zu erzeugen und auf die Umwelt, wiederum Neurowissenschaftler zu modellieren, die die Aktivität von Interesse zeigen und zugänglich sind und zugänglich zu experimentellen Methoden. Die stomatogastrischen Nervensystems (Tln) der amerikanischen Hummer (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;; Auch wusste, war, den Atlantik oder Hummer aus Maine) wurde als Modellsystem für die Untersuchung Rhythmus erzeugen Netzwerke und Neuromodulation von Netzwerken etabliert. Die Tln besteht aus 3 vorderen Ganglien (2 kommissuralen Ganglien und eine Ösophagus-Ganglion), mit modulatorische Neurone, die zentral Projekt zur stomatogastrischen Ganglion (STG). Die STG enthält etwa 30 Neuronen, die zwei zentrale Muster erzeugen Netzwerke umfassen, den Pylorus und Magen-Netzwerke, die Fressverhalten in Krebstieren unterliegen<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Zwar ist es möglich, dieses System zu studieren<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt; Setzt die Tln seine rhythmische Aktivität erzeugen, wenn sie isoliert<i&gt; In-vitro-</i&gt;. Physikalische Trennung der Tln in einer Schüssel ermöglicht den einfachen Zugriff auf die Somata in den Ganglien für die intrazelluläre elektrophysiologischen Ableitungen und die Nerven des Tln für extrazelluläre Ableitungen. Isolieren der Tln ist ein zweistufiger Prozess. Der erste Teil, seziert den Magen des Tieres wird in einem begleitenden Video-Artikel beschrieben<sup&gt; 4</sup&gt;. In diesem Video-Artikel sind feine Dissektion Techniken verwendet, um die Tln aus dem Magen zu isolieren. Dieses Verfahren führt zu einem Nervensystem Vorbereitung, die für elektrophysiologische Ableitungen ist.

Wir beschreiben die feinen Sezierung des stomatogastrischen Nervensystem aus dem Magen des amerikanischen Hummer (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Homarus americanus stomatogastrischen Nervous System Dissection

Mit dem Ziel zu verstehen, wie Nervensysteme Aktivität erzeugen und auf die Umwelt reagieren, greifen Neurowissenschaftler auf Modellsysteme zurück, die die ...

Das Verfahren zur Isolierung des ST-gastralen Nervensystems vom Hummer kann in zwei Teile unterteilt werden: die grobe und die feine Dissektion. Dieses Video behandelt die feine Dissektion des somatischen gastralen Nervensystems aus dem Magen, einschließlich des als STG bezeichneten hepatogastralen Ganglions und der als COGs bezeichneten Kommissuralganglien. Im Wesentlichen müssen die Nerven und Ganglien von dem umgebenden Gewebe getrennt werden, beginnend mit der Isolierung der CGs, gefolgt von der Isolierung des STG. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist das systematisch präparierte gastrale Nervensystem, das in einer Petrischale fixiert ist und für eine Vielzahl von Untersuchungen zur Funktion des Nervensystems bereitsteht.Hallo, ich bin Annalise Tobin aus dem Labor von Dr. Eve Martyr in der Biologieabteilung der Brandeis University. Hallo, ich bin Hillary Burman, ebenfalls aus dem Martyr-Labor. Heute zeigen wir Ihnen eine Anleitung zur Isolierung des somatischen Magernervensystems aus dem Magen der Hummerart Homarus americanus, um zu veranschaulichen, wie der Magen entfernt wurde.Bitte sehen Sie sich unser begleitendes Video-Protokoll in JoVE an. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Funktion von Neuronen in kleinen neuronalen Schaltkreisen bei der Erzeugung rhythmischer Verhaltensweisen zu untersuchen. Beginnen wir also.Zunächst ist eine Vorbereitung des Hummermagen erforderlich, um zu verstehen, wie dies erreicht wird. Sehen Sie sich das begleitende Video an, in dem Beerman und Tobin die Petrischale zunächst so ausrichten, dass das innere Ende, das sich an der Lippe befindet, von Ihnen wegzeigt und das hintere Ende zu Ihnen zeigt. Dieser Teil des Verfahrens beginnt mit einer präziseren Fixierung der Präparation.Nadeln Sie die Speiseröhre an jeder Seite der Lippe fest und ordnen Sie gegebenenfalls die anderen während der makroskopischen Dissektion platzierten Nadeln so um, dass der Magen flach liegt. Entfernen Sie anschließend die Hypodermis, indem Sie zunächst in der Nähe der gm, der zwei GM drei Muskeln, danach greifen, sie von diesen Muskeln lösen und vorsichtig in anteriorer Richtung ziehen. Trennen Sie die Hypodermis von dem darunterliegenden Fettgewebe, indem Sie mit einer Schere alle Verbindungen durchtrennen, wobei Sie vorsichtig um die Zentralarterie arbeiten, die einen Teil des somatischen Magennervensystems umschließt; lassen Sie die Hypodermis dabei intakt.In einem Radius von etwa 0,5 Zentimetern um das somatische Maganglion herum, das zwischen den GM-eins-B-Muskeln liegt, kann nun die getrennte Hypodermis abgeschnitten werden. Als nächster Schritt folgt die Ablösung des Gehirns vom darunterliegenden Gewebe. Beginnen Sie damit, die beiden großen Commissuralnerven zu identifizieren, die beidseitig aus dem vorderen Bereich des Gehirns zu den Commissuralganglien im vorderen Magenabschnitt verlaufen.Unter Erhaltung dieser Nerven das Gehirn vorsichtig mit einer Pinzette anheben und durchtrennen, um es vom restlichen Gewebe zu lösen. Achten Sie dabei sorgfältig darauf, da sich unter dem Gehirn der somatische Magennerv befindet, der intakt bleiben muss. Um die Kommissuralganglien vom umgebenden Gewebe zu trennen, lokalisieren Sie diese zunächst, indem Sie einem der Kommissuralnerven bis zu einem Ganglion folgen.Identifizieren Sie nun den ION und den SON. Diese Nerven müssen intakt bleiben. Von jedem Commissuralganglion gehen viele Nerven ab.Schneiden Sie die meisten, mit Ausnahme des N. ion und des N. son, durch. Lassen Sie einen zusätzlichen Nerv angeheftet, um das Kommissuralganglion während des Fortsetzens der Präparation an Ort und Stelle zu halten. Suchen Sie nun das andere Kommissuralganglion und präparieren Sie die Nerven auf die gleiche Weise. Als Nächstes reinigen Sie den ION und SON von lateral nach medial. Lassen Sie den Labialnerv intakt, um das Präparat am Magen zu verankern. Das ösophageale Ganglion liegt im Bereich des Schnittpunkts mit dem iOS.Sie können den darunterliegenden Bereich freilegen, indem Sie den unteren Ventrikelnerv ergreifen und nach oben zeigen, um darunter zu schneiden. Der nächste Schritt besteht darin, das STG vom umgebenden Gewebe zu trennen. Das STG liegt innerhalb einer Arterie, die zwischen den GM-one-B-Muskeln und hinab zu den GM-two-a-B-Muskeln verläuft.Suchen Sie nach dem durchtrennten Ende der Arterie in der Nähe des gm. Zwei AB-Muskeln ziehen die Arterie nach oben und nach innen, um den DVN freizulegen. Ziehen Sie weiter nach oben, bis das verbleibende Hypodermis erreicht ist.Nach der Trennung kann die Arterie bis zu der Stelle beschnitten werden, an der sie das verbleibende Hypodermis berührt. Schneiden Sie nun die Muskeldecke ab, die sich im Rostrum der Hummer befand. Heben Sie danach das Hypodermis über der Arterie an.Die Arterie bildet einen Tunnel innerhalb des Fettgewebes. Über der STG. Führen Sie eine Klinge Ihrer Schere in die Arterie ein und schneiden Sie den darüberliegenden Muskel durch.Überprüfen Sie, ob Sie die DVN während des Schneidens sehen können, um sicherzustellen, dass Sie sicher arbeiten. Über der STG weiter anterior entlang der Arterie schneiden. Während Sie über der STG schneiden, werden Sie die STN sehen, die anterior aus der STG hervortritt und sich nach unten in den Muskel verläuft.Schneiden Sie weiter nach anterior, um den Muskel oberhalb des STG vollständig zu trennen. Entfernen Sie jegliches Gewebe vom STN. Nun können wir fortfahren, mehrere andere Nerven zu isolieren.Die nächsten Nerven, die vom umgebenden Gewebe getrennt werden müssen, sind die AGNs. Selbst wenn keine Ableitung vom A-GN geplant ist, benötigen Sie einen Abschnitt davon, um das Ganglion zu fixieren. Um die AGNs besser sichtbar zu machen, entfernen Sie die verbleibende Hypodermis und eine dünne Schicht des darunterliegenden Muskels direkt posterior zur STG. Suchen Sie nach einem dunklen Kanal im Fett- und Muskelgewebe auf beiden Seiten des DVN-Stäbchens, führen Sie eine Scherenklinge in den Kanal ein und schneiden Sie das Gewebe oberhalb des Nervs durch. Setzen Sie den Schnitt seitlich entlang des Nervs fort, um diesen zu isolieren. Ein paar Millimeter reichen aus, um das Ganglion zu fixieren, aber wenn Sie Aufnahmen vom A GN planen, sollten Sie mindestens fünf Millimeter freilegen.Lösen Sie ein AGN von dem Muskel, den es innerviert, indem Sie die Verbindungen durchtrennen. Wiederholen Sie diesen Vorgang nun auf der anderen Seite, um das andere A AGN zu isolieren. Sobald beide AGNs präpariert wurden, durchtrennen Sie alle Muskeln und das Gewebe, das das STG mit dem Magen verbindet. Isolieren Sie anschließend die M vns.Sie sind ein bilaterales Paar kleiner Nerven, die vom LVN abzweigen und later­al unterhalb des Fettgewebes verlaufen. Entweder mit einer Schere oder mit zwei Pinzetten das Fettgewebe auf einer Seite des DVN durchtrennen, und zwar in der Nähe der Stelle, an der er sich in die beiden LVNs aufteilt. An dieser Stelle befinden Sie sich weit entfernt vom M. VNS und laufen nicht Gefahr, diesen zu verletzen.Heben Sie die Fettschicht an und suchen Sie darunter nach einem kleinen Nerv. Der M. VNS verläuft seitlich knapp hinter der Ebene der Mm. gemelli. Entfernen Sie die Fettschicht oberhalb des MVN, wobei der Nerv vorerst intakt bleiben soll, damit er sich nicht verfängt.Sie werden das laterale Ende und alle Verbindungen zum M. VNS am Ende der Nervensystempräparation durchtrennen. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite, um das andere MVN zu isolieren. Als Nächstes folgen die LVNs in den hinteren Nerven zur Isolierung.Ausgehend vom lateralen Abzweig des LVN vom DVN. Verfolgen Sie einen LVN, indem Sie das darüberliegende Fettgewebe durchtrennen. Abhängig von der Präparation kann manchmal die gesamte Fettschicht über dem Nerven abgezogen werden.Setzen Sie die Freilegung des LVN fort, bis zu der Stelle, an der der PSN abzweigt. Suchen Sie nun den PYN. Es ist ein Nerv, der posterior über die Pori verläuft.Entfernen Sie die dünne Membran, die diesen Bereich bedeckt. Isolieren Sie das PYN, indem Sie einen kleinen Abschnitt des Porus abschneiden, der mit dem PYN-Kanal verbunden ist. Heben Sie anschließend vorsichtig den Pric-Abschnitt an und schneiden Sie das Gewebe auf beiden Seiten des PYN weg, bis Sie den Zweig erreichen, der mit dem PDN verbunden ist.Fahren Sie mit der Isolierung des PDNA fort, der hinter dem Pric-Dilatator-Muskel verläuft. Schneiden Sie zuerst einen kleinen Abschnitt des mit dem PDN verbundenen Pric-Dilatator-Muskels ab. Heben Sie dann vorsichtig den Abschnitt des Pric-Dilatator-Muskels an.Schneiden Sie das Gewebe auf beiden Seiten des PDN so lange ab, bis Sie den Zweig erreichen, der mit dem PYN verbunden ist. Suchen Sie nun den ventralen LVN, der den PYN und PDN am dreieckigen Verzweigungspunkt mit dem ventralen LVN verbindet, an dem sich PYN und PDN mit dem ventralen LVN verbinden. Isolieren Sie einen kleinen Nervenabschnitt, der vom ventralen LVN abzweigt, beispielsweise den VPLN. Dieser dient als Griff, um den ventralen LVN anzuheben, indem am Griff gezogen wird.Schneiden Sie das Gewebe auf beiden Seiten des ventralen LVN in anteriorer Richtung ab, bis Sie die Stelle erreichen, an der der PSN abzweigt. Sie haben nun die hinteren Nerven auf einer Seite des Magens erfolgreich präpariert. Isolieren Sie nun den LVN und die hinteren Nerven auf der anderen Seite.L&ouml;sen Sie den LVN vollst&auml;ndig vom Magen. Ziehen Sie am PSN und durchtrennen Sie alle Gewebe und Nerven, die am LVN und ventralen LVN befestigt sind, mit Ausnahme des PDN und PYN. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite.Schneiden Sie anschließend das laterale Ende jedes MVN ab. Heben Sie das laterale Ende an und durchtrennen Sie alle Verbindungen zum MVN am vorderen Ende. Durchschneiden Sie alle Verbindungen zu den comm-Ganglien und schneiden Sie auf jeder Seite den Labialnerv durch.Scannen Sie visuell das somatische Magennervensystem, um zusätzliche Verbindungen zum Magengewebe zu erkennen und diese dann zu durchtrennen. Sobald Sie alle Verbindungen gekappt haben, können Sie das vordere Ende beider Commissuralnerven oberhalb der Commissuraganglien greifen und das somatische Magennervensystem vom Magen ablösen und zur Seite der Petrischale bewegen. Währenddessen durchtrennen Sie alle weiteren Verbindungen, um das Nervensystem vollständig freizulegen.Die Dissektion ist nun abgeschlossen. Bereiten Sie zunächst die Sogar-Schale vor, an der das Nervensystem befestigt wird. Reiben Sie etwas Magengewebe gründlich auf die Oberfläche der Sogar in der kleinen Schale.Dies verringert die Hydrophobizität des Sogars, sodass die Kochsalzlösung gleichmäßig über die Schale verteilt wird. Spülen und füllen Sie die Sigar-Schale mit gekühlter Kochsalzlösung. Übertragen Sie das Nervensystem in die vorbereitete Sogar-Schale, indem Sie die vorderen Enden beider Commissuralnerven ergreifen.Das Nervensystem aus der großen Schale heben und in die kleine Schale legen. Um das Nervensystem zu fixieren, verwenden Sie eine Kombination aus Minutiennadeln und dünneren Nadeln. Schneiden Sie zunächst von Wolframdraht; stellen Sie sicher, dass die Präparation mit der dorsalen Seite nach oben liegt, indem Sie überprüfen, ob der untere ventrikuläre Nerv von der Syl-Wache wegzeigt.Entfernen Sie nun das Gehirn und fixieren Sie die Commissuralnerven. Ziehen Sie vorsichtig am gesamten Nervensystem, indem Sie jeden PSN posterior und lateral ziehen, und fixieren Sie sie durch Nadeln. Entfernen Sie anschließend den P-Dilatator-Muskel aus dem PNS und fixieren Sie auch diese Nerven durch Nadeln.Entfernen Sie dann das pylorische Segment von den GYNs und fixieren Sie die GYNs. Fixieren Sie abschließend alle verbleibenden isolierten Nerven, wie die Labialnerven, die m vns und die AGNs. Der nächste Schritt besteht darin, das S st zu entblättern.Zunächst sicherstellen, dass das S-St-G flach an der S-Schutzvorrichtung anliegt und durch die seitlichen AGNs straff gehalten wird. Die vordere STN und die hintere DVN richten die Beleuchtung so aus, dass die Axone innerhalb der DVN sichtbar werden. Anschließend mit einem kleinen Stift oder einer feinen Wolframeine. Erstellen Sie ein kleines, flaches Loch in der Hülle um den DVN, direkt hinter dem STG. Ziehen Sie die Nadel über den dorsal zu den Axonen gefärbten DVN, um einen horizontalen Riss in der Nervenhülle zu erzeugen. Greifen Sie nun eine Klappe der Nervenhülle hinter dem STG und ziehen Sie sie nach anterior, schneiden Sie dann, um die Hülle von der dorsalen Seite des STG zu entfernen.Nachdem die Hülle entfernt wurde, ist die Präparation bereit für Experimente, vorausgesetzt, sie wird zwischen etwa vier und 15 Grad Celsius kühl gehalten. Diese Präparation hat sich experimentell bis zu fünf Tage lang als stabil erwiesen. Das intakte Sato-Magen-Nervensystem sollte mit einer Nadel im Syl-Wächter-Dish fixiert werden.Wie gezeigt, sollten die Nerven frei von Schäden sein und für extrazelluläre Ableitungen zugänglich. Die Zellkörper des intakten STG sollten sichtbar und für intrazelluläre Ableitungen zugänglich sein. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man das somatische Magennervensystem des Hummers Homa Americana isoliert.Bei dieser Dissektion ist es wichtig, sich sehr gut mit der Anatomie vertraut zu machen, um Gewebe und Nerven nicht zu beschädigen. Außerdem ist es entscheidend, die Präparation bei einer kühlen Temperatur zwischen vier und 15 Grad Celsius zu halten. Dies lässt sich während der Dissektion leicht erreichen, indem man alle halbe Stunde das Salinum durch kaltes Salinum ersetzt, das bei vier Grad Celsius im Kühlschrank aufbewahrt wird, solange die Präparation gekühlt gehalten wird.Es ist stunden- bis tagelang vital. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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