Name: Proteomics, um Proteine interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Proteine identifizieren, die mit dem C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren. Diese Proteomik-Methode nutzt GST-Pulldown-Assays und Massenspektrometrie zur Analyse von Protein-Komplexen im Rattenhirn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW und TMV werden durch die NCRR und NHLBI an den National Institutes of Health unterstützt. BSK und HS werden von der NINDS und NIGMS der National Institutes of Health unterstützt.

Experimentelle Verfahren Das experimentelle Verfahren (Abb. 2) besteht aus vier Teilen, die in einer stufenweisen Weise beschrieben werden. Teil 1: Subklonierung und Expression der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren. Wir haben die volle Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren in Bakterien auf das Gehirn Proteine, an die es bindet identifizieren ausgedrückt. <ol><li> Der C-Terminus (Aminosäuren 353-472) des P2X2-Rezeptors (Abb. 1) wurde durch PCR amplifiziert, kloniert in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) und verifiziert mit Sequenzierung. </li><li> Das rekombinante Plasmid wurde in E. verwandelt Coli (BL21) für die Expression von rekombinanten Proteinen. </li><li> Glycerol Aktien von Bakterien (E. coli BL21) mit dem P2X2 CT-GST-Plasmid wurden mit einer sterilen Pipettenspitze abgekratzt und geimpft in 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium mit geeigneten selektiven Marker (50 g / ml Ampicillin) und über Nacht in einem Schüttler bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Die Kulturen angebaut wurden über Nacht in 250 ml LB-Medium mit einem geeigneten Antibiotikum (50 ug / ml Ampicillin) inokuliert und in einem Schüttler bei 250 rpm für 2-3 Stunden bei 37 ° C, bis die optische Dichte bei 600 nm erreicht ~ 0,6-0,7. </li><li> Die Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert und weiter bei 37 ° C für 3 Stunden für die Proteinexpression inkubiert. </li><li> Die Kultur wurde dann bei 5000 g für 15 min bei 4C (1 ml Kultur wurde für die Analyse der Expression gespeichert und gekennzeichnet als &quot;induzierte&quot;) ausgegliedert. Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 20 ml Saline Tris-EDTA (STE)-Puffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert. </li><li> Die Suspension wurde bei 5000 g für 15 min in einem 50 ml Falcon-Röhrchen geschleudert. Der Überstand wurde verworfen und die halbtrockene Pellet wurde in gefrorenem Zustand bei-70C über Nacht. </li><li> Die 70C-Pellet wurde in 40 ml eiskaltem Lysepuffer (2% (w / v) Sarkosyl, 15 mg Lysozym, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT und vollständige Protease-Inhibitor-Tablette) resuspendiert , und die Suspension auf Eis für 30 min inkubiert. Während dieser Inkubation wurden 3 ml Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen mit 20 ml Phosphatpuffer Saline (PBS) und 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 in PBS) von PBS gewaschen. Die Perlen wurden in 1 ml PBS resuspendiert. </li><li> Die Bakteriensuspension wurde 3 mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und aufgetaut und beschallt (1s on / off, 30 Mikron für 3 min auf Eis) und weitere 30 min mit 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO inkubiert 4 und 2 mM ATP auf Eis. </li><li> Das Lysat wurde bei 20000 g für 15 min bei 4C und Pellet gesponnen wurde verworfen (eine Probe aus Pellets und 1 ml Überstand wurde für die SDS-Seite gespeichert, die Mengen der Proteine ​​im Cytosol und Membranen-Test). Der Überstand wurde mit den Beads für 1 h (oder über Nacht) bei 4C inkubiert. </li><li> Die Perlen wurden bei 500 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen (Probe wurde für ungebundene Fraktion gespeichert). Die Perlen wurden mit T-PBS fünfmal (Waschungen wurden für Wasch-Steuerelemente gespeichert) gewaschen. </li><li> Die Perlen wurden dann in PBS resuspendiert zu geben 50% (w / v) Suspension und in Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Verwendung. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford (pro Herstellerangaben) geschätzt. </li></ol> Teil 2: Herstellung des gesamten Gehirns Lysaten P2X2-Rezeptoren sind dafür bekannt, reichlich im Gehirn 8 ausgedrückt werden. In der vorliegenden Analyse haben wir versucht, die Proteine ​​interagieren mit P2X2-Rezeptoren aus Ratte ganze Gehirn-Lysaten (Abb. 3) zu identifizieren. <ol><li> Adult Rattenhirn wurde geerntet (Tiere wurden nach einem UCLA IAACUC-genehmigten Protokoll und nach den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren geopfert) und gespült sofort eiskaltem PBS (3X). </li><li> Um die Zellen zu lysieren 10 ml (~ 5-fache der Nassgewicht geerntet Gehirn) eiskaltem Lysepuffer mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 ug / ml Leupeptin, wurde 1% (v / v) NP-40, und ein Protease-Inhibitor Cocktail Tabletten, die geerntet Gehirn aufgenommen. </li><li> Hirngewebe wurde auf Eis mit einem Glas-Homogenisator homogenisiert Dounce, bis eine Mischung aus homogene Konsistenz erreicht wurde. </li><li> Zelllysat wurde bei 2000 g für 5 Minuten zentrifugiert, um die ungebrochene Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt und drehte wieder bei 29000 g für 60 Minuten auf intakte Organellen und Membran Aggregate zu entfernen. </li><li> Unmittelbar nach Zentrifugation wurde der Überstand in ein sauberes Röhrchen übertragen. Die Proteinkonzentration des gesamten Gehirns Lysat wurde durch Bradford-Assay gemessen (in der Regel ~ 15 mg / ml). </li><li> Das Lysat wurde aliquotiert und bei-70C. </li></ol> Teil 3: Isolierung von P2X2 C-tail-assoziierten Proteinen Zur Identifizierung der Bindungspartner von P2X2 CT-GST aus ganzen Gehirn-Lysaten, ein Pull-down-Assay wurde unter Verwendung von CT-G durchgeführtST an Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen als Köder immobilisiert. Für Kontrollen wurde GST allein verpflichtet, Perlen verwendet. <ol><li> Brain-Lysat wurde mit GST Perlen für 1 Stunde bei 4C vorgereinigt. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde für weitere Analysen verwendet. </li><li> Gleiche Mengen von GST und P2X2 CT-GST (10 ug) gebunden an Glutathion-Sepharose 4 B Kügelchen wurden über Nacht mit 100 g vorgereinigt solubilisierten Proteine ​​aus Ratte ganze Gehirn Lysat inkubiert, mit der Rotation bei 4 ° C im Lysepuffer. </li><li> Beads wurden bei 1000 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. </li><li> Die Perlen wurden einmal mit Lysepuffer gewaschen und gekocht in modifizierter Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-Mercaptoethanol, 2% (v / v) Glycerin, 0,004% (w / v) Bromphenolblau und 0,125 M TrisCl pH 6,8] für 5 min. </li><li> Die Proben wurden bei 5000 g für 5 min und der Überstand durch 10% SDS-PAGE (Abb. 4) getrennt gesponnen. Die Gele wurden mit SYPRO Ruby Proteingel Fleck (nach den Anweisungen des Herstellers) und visualisiert unter UV-Licht gefärbt. P2X2 CT-assoziierte Proteine ​​wurden mit denen wieder mit GST-null als Köder verglichen. Vier biologischen Replikaten durchgeführt wurden (dh vier Köpfe und vier unabhängigen Pull-Downs). </li></ol> Teil 4: Identifizierung von Proteinen. Proteine, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie identifiziert 12 Hinweis:. Abwesenheit von Staub während des gesamten Prozesses ist entscheidend für Keratin Verschmutzung zu reduzieren. Der Versuchsleiter sollte ein Mundschutz getragen werden, Haarnetz und Handschuhe zu allen Zeiten und berühren Sie niemals die Gel-region of interest, ohne die Verwendung von Handschuhen. <ol><li> Alle sichtbaren Proteinbanden aus dem P2X2-Pulldown wieder wurden mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und in Würfel geschnitten (Abb. 4). Entsprechenden Regionen des Gels in der GST-null bis Fahrspur ziehen waren auch in der gleichen Weise, ohne Rücksicht auf Band-Färbung (Bands spezifisch für die GST-null Köder wurden ausgeschnitten und identifiziert), um die Anwesenheit von Proteinen unter dem Niveau des versichern herausgeschnitten Färbung Empfindlichkeit war nicht zu übersehen. </li><li> Die Gelstücke wurden mit 200 ul 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% (v / v) Acetonitril (ACN) und die Rohre für 15 min bei RT inkubiert gevortext. Wiederholen Sie diesen Waschschritt. </li><li> Die Gelstücke wurden entwässert durch Zugabe von 200 ul Acetonitril (Gelstücke sollten schrumpfen und undurchsichtig in Farbe). </li><li> Acetonitril wurde entfernt und die Gelstücke getrocknet in einer Speedvac für ~ 10 min. </li><li> Die Gelstücke wurden dann mit 30 ul der frisch zubereiteten 10 mM DTT/10 mM Tris (2-Carboxy-ethyl) phosphan-Hydrochlorid (TCEP) mit ausreichendem Volumen inkubiert, um die Stücke zu vertiefen. Dies wurde für 30 min bei 56C Wasserbad links. </li><li> Als nächstes wird die DTT-Lösung wurde mit 100 ul 500 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% Acetonitril-Lösung und das Gel Scheiben mit ammounium Bicarbonat gewaschen ersetzt. </li><li> Die Waschlösung wurde abgesaugt und 200 pl Acetonitril hinzugefügt, um die Gele zu entwässern. </li><li> Acetonitril wurde dann entfernt, und 100 ul frisch zubereiteten 100 mM iodoacetamide Lösung wurde hinzugefügt, um freie Sulfhydryle alkylieren. Dieser Schritt ging für 25 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Iodacetamid Lösung wurde entfernt und die Gelstücke wurden mit 200 ul 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% Acetonitril (pH 8,0) für 2 min gewaschen, während Vortexen. Dieser Waschschritt wurde wiederholt. </li><li> Nach dem Entfernen der Waschlösung wurden die Gelstücke mit 200 ul Acetonitril, die dann von Speedvac für ~ 10min entfernt wurde, inkubiert. </li><li> Bei diesem Schritt die Gelstücke sind bereit für Trypsinverdauung. Gel Stücke wurden in 30 ul Trypsin-Lösung (20 ng / ul Arbeitskonzentration) inkubiert und auf Eis für 10 min für die Gele auch geschwollen sein. Überschüssiges Trypsin wurde entfernt und rehydriert Gelpartikel mit 30 ul mit 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat überlagert, um sie während der Verdauung, die erlaubt, für 12 bis 16 Stunden bei 37 ° C vor eingetaucht wurde. </li><li> Fünf ul von 5% (v / v) Ameisensäure zugesetzt, um das Trypsin und Verhaftung Verdauung zu deaktivieren. </li><li> Die Röhrchen wurden für ~ 15 min gevortext und kurz zentrifugiert, um die Flüssigkeit auf den Boden der Röhre, die dann zu einer sauberen und beschriftet 0,5 ml Röhrchen überführt zu bringen. </li><li> In den nächsten 30 ul 0,1% (v / v) Ameisensäure in 50% Acetonitril wurde Gelstückchen hinzugefügt, so waren sie nur durch Vortexen zweimal für 10-15 min, getrennt durch kurze Zentrifugation bedeckt gefolgt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, anstelle der Ameisensäure-Acetonitril zwischen den Schritten. </li><li> Die endgültige Flüssigkeit wurde entfernt und alle Extraktionslösung kombiniert in einer einzigen Flasche. Dieses Volumen wurde auf ~ 30 UL in den Speedvac reduziert. Die Probe wurde nun für Reverse-Phase-nano-Flüssig-Chromatographie und Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie. In diesem konkreten Beispiel wird dieser Schritt auf einer Orbi-Trap-Tandem-Massenspektrometer von ThermoF durchgeführtFinisher (gewählt für seine hohe Masse Genauigkeit, schnelle Einschaltdauer für Protein-Erkennung und generell robust Betriebssystem-Funktionen), obwohl auch andere Modelle und Hersteller &quot;Instrumente leicht konnte mit dem beschriebenen Ansatz zu diesem Punkt gekoppelt werden. </li><li> Die Einzelheiten und Kriterien für die massenspektrometrischen Analysen werden nun kurz vorgestellt. Alle Peptide wurden durch Umkehrphasen-nano-LC (Eksigent) und Peptide wurden auf einer C18 Reverse-Phase-Säule mit einer Flussrate von 3 ml / min geladen getrennt. Mobile Phase A bestand aus 0,1% Ameisensäure und 2% ACN in Wasser; mobile Phase B lag bei 0,1% Ameisensäure und 20% Wasser in ACN. Die Peptide wurden aus der Säule mit einer Flussrate von 220 nl / min mit einem linearen Gradienten von 5% B auf 50% B über 90 min, dann auf 95% B über 5 min eluiert und schließlich konstant zu halten 95% B für 5 min . Die Spektren wurden in Daten-abhängigen Modus mit der Orbi-Falle für MS-Scans und LTQ für MS / MS-Scans verwendet erworben. Die Peptide wurden durch die Suche der Spektren gegen die Ratte IPI Datenbank v.3.53 mit dem SEQUEST Algorithmus in die Bioworks Software-Paket integriert identifiziert. Jedes Peptid die folgenden Kriterien erfüllte: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3) und DeltaCN&gt; 0,1. Alle Spektren für Protein-Identifizierung verwendet wurden manuell geprüft und keine Proteine ​​angenommen, wenn weniger als zwei Peptide identifiziert wurden. Nur Proteine ​​nach jeder der vier P2X2 Pull-Downs und abwesend während GST-null Pull-Downs, wurden für weitere Analysen berücksichtigt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung eines P2X2-Rezeptor-Untereinheit. A. Die Karikatur zeigt die Topologie eines P2X2-Rezeptor-Untereinheit. Die cytosolische Domäne besteht aus N-und C-Termini. Der C-Terminus von P2X2-Rezeptors (rot) wurde als Köder für Pull-down-Assay verwendet. B. Aminosäuresequenz des P2X2-Rezeptors C-Terminus in dieser Studie verwendet. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Abbildung 2. Flussdiagramm und Zeitachse des Protokolls für die Expression verwendet, Reinigung, Pull-down-und die Identifizierung von Proteinen. Wir zeigen den Umriss des Protokolls mit der Zeitleiste. Adult Rattenhirn Lysat wurde unmittelbar vor Gebrauch herzustellen für den Pull-down-Assays frisch. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der binären Proteomanalyse von P2X2-C-Terminus-Netzwerk im Gehirn der Ratte. Der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren mit GST-Protein gebunden GST Perlen geschmolzen wurde für Pull-down-Assays verwendet. Brain-Lysat wurde vorbereitet und Proteine ​​wurden mit den immobilisierten rekombinanten Proteinen inkubiert. Unbound Fraktion wurde mit dem Lysepuffer gewaschen. Die Proteine ​​wurden durch Massenspektrometrie identifiziert. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Abbildung 4. Identifizierung der Bindungspartner der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren. Sypro gefärbten Gel zeigt ein Spektrum von vermeintlichen Proteinen, die mit dem C-Terminus von Rezeptoren mit GST (blauer Kasten) fusioniert zu interagieren. Steuert Fahrspuren für GST alleine (gelber Kasten) und Glutathion-Sepharose-Kügelchen allein sind ebenfalls dargestellt. Die Pfeile zeigen Beispiele der einzigartigen Bands, die für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie wurden herausgeschnitten.

<ol><li>Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li>
<li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li>
<li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li>
<li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits.%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li>
<li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shape%2C+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li>
<li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription%2Ftranslation-related+proteins%3A+complimentary+separation+techniques+with+LC%2FMS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li>
<li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li>
</ol>

Ionenkanäle sind eine wichtige Klasse von integralen Membranproteinen. Sie enthalten Wasser gefüllten Poren, die selektiv erlauben die Bewegung der Ionen bis ihre elektrochemischen Gradienten über die Plasmamembran. Ionenkanäle Tor zwischen offenen und geschlossenen Zuständen. Die Gating Schritt wird durch Sender (z. B. ATP) im Falle von P2X-Liganden gesteuerte Ionenkanäle ausgelöst, oder es kann durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen reguliert werden. Das letzte Jahrzehnt hat eine Erhöhung der unser Verständnis, ...

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>Reagenz</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Reagenz</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydrogencarbonat</td><td>Reagenz</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat (ATP)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Commassie-Blau R-250</td><td>Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Reagenz</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglycol-bis(β-Aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamid</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)-Medium</td><td>Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO₄)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid (NaF)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Reagenz</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitortablette</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Proteinstandard </td><td>Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Reagenz</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>Verschlussfläschchen mit Schraubverschluss</td><td>Werkzeug</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Rubyprotein-Geleinfärbung</td><td>Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;-Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Reagenz</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Reagenz</td><td>Burdick &amp;& Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap-Tandem-Massenspektrometer</td><td>Werkzeug</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System der Nano-Flüssigkeitschromatographie</td><td>Werkzeug</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-Mercapto&amp;#8211;Ethanol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomics, um proteine ​​interagieren mit p2x2 ligand-gated kationenkanäle identifizieren

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle unterliegen synaptischen Kommunikation im Nervensystem 1. Bei Säugetieren gibt es drei Familien von Liganden-gesteuerte Kanäle: die Cys-Schleife, die Glutamat-gesteuerten und der P2X-Rezeptor-Kanäle 2. In jedem Fall bindend des Senders führt zur Öffnung einer Pore, durch die Ionen fließen ihres elektrochemischen Gradienten. Viele Liganden-gesteuerte Kanäle sind auch durchlässig für Kalzium-Ionen 3, 4, die stromabwärts Signalisierung haben Rollen 5 (zB Gen-Regulation), dass die Dauer der Kanalöffnung überschreiten darf. So Liganden-gesteuerte Kanäle können über weite Zeitskalen von wenigen Millisekunden bis Tagen Signal. Angesichts dieser wichtigen Rolle ist es notwendig zu verstehen, wie Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sich durch Proteine ​​reguliert werden, und wie diese Proteine ​​können tune-Signalisierung. Neuere Studien legen nahe, dass viele, wenn nicht alle Kanäle kann ein Teil des Proteins Signalkomplexe 6 sein. In diesem Artikel erklären wir, wie die Proteine, die an der C-terminalen Aspekte des P2X2-Rezeptors cytosolischen Domäne binden zu identifizieren. P2X-Rezeptoren sind ATP-gated Kationen-Kanäle und bestehen aus sieben Untereinheiten (P2X1-P2X7). P2X-Rezeptoren sind weit verbreitet im Gehirn, wo sie vermitteln exzitatorischen synaptischen Transmission und präsynaptischen Erleichterung der Neurotransmitter Release 7 zum Ausdruck gebracht. P2X-Rezeptoren sind in erregbaren und nicht-erregbaren Zellen gefunden und vermitteln wichtige Rollen in neuronalen Signalübertragung, Entzündungen und Herz-Kreislauf-Funktion 8. P2X2-Rezeptoren sind reichlich im Nervensystem 9 und stehen im Mittelpunkt dieser Studie. Jeder P2X-Untereinheit wird angenommen, dass zwei Membran überspannt Segmente (TM1 und TM2) durch einen extrazellulären Bereich 7 und intrazelluläre N-und C-Terminus (Abb. 1a) 7 getrennt zu besitzen. P2X-Untereinheiten 10 (P2X1-P2X7) zeigen 30-50% Sequenzhomologie auf Aminosäure-Ebene 11. P2X-Rezeptoren enthalten nur drei Untereinheiten, die den einfachsten Stöchiometrie unter ionotropen Rezeptoren ist. Der P2X2-C-Terminus besteht aus 120 Aminosäuren (Abb. 1b) und enthält mehrere Protein-Docking-Konsens Standorten unterstützen die Hypothese, dass P2X2-Rezeptors kann Teil Signalkomplexe werden. Doch obwohl mehrere Funktionen, die C-Terminus von P2X2-Rezeptoren 9 zugeschrieben haben keine Studie hat die molekulare Partner beschrieben, dass einige der intrazellulären Seite des Proteins über die volle Länge C-Terminus. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir eine Proteom-Ansatz, um die Proteine, die mit der vollen Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren zu identifizieren.

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Ligandengesteuerte Ionenkanäle bilden die Grundlage der synaptischen Kommunikation im Nervensystem1. Bei Säugetieren gibt es drei Familien ligandengesteuerter Kanäle: die Cys ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Überexpression des rekombinanten C-Terminus des purinergen P2X-Rezeptors oder P2X2, der als GST-Fusionsprotein nach bakterieller Lyse konstruiert wurde. Das gereinigte Protein wird mit Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen inkubiert, und die Konzentration wird mittels der Bradford-Methode bestimmt. Anschließend werden Proteine aus einem gereinigten lysierten Rattenhirn mit dem an Glutathion-Sepharose-Kügelchen gebundenen C-Terminus der P2X2-Rezeptoren inkubiert, und die an den C-Terminus der P2X2-Rezeptoren gebundenen Protein-Komplexe werden mittels SDS-PAGE, Gelelektrophorese und Ausschneiden isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert.Hallo, ich bin Harpring aus dem Labor der JIT K-Abteilung für Physiologie an der University of California Los Angeles. Hallo, ich bin Sarah Walburn aus dem Labor von Tom Vka in der Abteilung für Anästhesiologie an der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der CTS von P zwei X zwei-Rezeptoren.Wir verwenden diese Proteine, um die Herkunft aus dem roten Gehirn zu identifizieren, und in unserem Labor nutzen wir diese Proteine, um die funktionellen Auswirkungen auf P2X2-Rezeptoren zu untersuchen. Beginnen wir also. Die zytoplasmatische Domäne des P2X2-Rezeptors besteht aus den N- und C-Termini.Das C-terminale Ende des P2X2-Rezeptors wird als Köder für den Pull-down-Assay verwendet, wie auch die Sequenz des C-terminalen Endes des P2X2-Rezeptors dargestellt ist, die für diese Interaktionsstudie verwendet wurde. Um die vollständige Länge des C-terminalen Endes der P2X2-Rezeptoren zu exprimieren, verwenden Sie herkömmliche molekularbiologische Techniken, um die Kodiersequenz für das C-terminale Ende des Rezeptors – die Reste 353 bis 472 – in ein pGE-X4-NT1-Plasmid zu integrieren.Das rekombinante Plasmid wird anschließend in den E. coli-Stamm BBL 21 zur Expression transformiert. Die Bakterien, die das rekombinante Plasmid enthalten, werden in LB bei 37 °C kultiviert. Wenn die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern zwischen 0,6 und 0,8 liegt.Bereiten Sie die Kultur mit einem Millimolar IPTG aus und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die dreistündige Inkubation abgeschlossen ist, entnehmen Sie ein Ein-Milliliter-Aliquot aus der Kultur und bewahren Sie es für eine spätere Analyse auf. Zentrifugieren Sie den Rest der Kultur bei 5.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Salin-Tris-EDTA-Puffer. Überführen Sie das resuspendierte Pellet in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen.Die Suspension muss nun 15 Minuten bei 5.000 Gs zentrifugiert werden, um das halbtrockene Pellet zu gewinnen, das über Nacht bei minus 70 Grad Celsius eingefroren wird. Am folgenden Tag wird das gefrorene Pellet in 40 Milliliter eiskaltem Lysepuffer resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis gehalten, während das resuspendierte Pellet auf Eis steht. Bereiten Sie drei Milliliter Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen vor.Waschen Sie die Perlen zunächst mit 20 Milliliter PBS und 20 Milliliter TPBS. Danach waschen Sie die Perlen mit reinem PBS und resuspendieren sie in einem Milliliter PBS. Die Bakteriensuspension im Lysepuffer wird nun durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen behandelt.Die gefrorene Probe wurde zum Auftauen auf Eis inkubiert und erneut mit flüssigem Stickstoff gespült. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Als Nächstes wird die Gefriertau-Suspension auf Eis beschallt.Nach der Beschallung inkubieren Sie die Bakteriensuspension 30 Minuten lang auf Eis mit einer Lösung, die 4 % Tritton X 110, 10 Millimolar Magnesiumsulfat und zwei Millimolar ATP enthält. Anschließend zentrifugieren Sie das Lysat 15 Minuten bei 20.000 ×g und vier Grad Celsius und sammeln den Überstand. Bevor Sie das Pellet verwerfen, entnehmen Sie eine kleine Probe aus dem Pellet mit Überstand, um die Proteine im Cytosol und in den Membranen zu analysieren.Incubieren Sie das Überstand mit den Kügelchen eine Stunde oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation mit 500 × g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den größten Teil des Überstands, bewahren Sie jedoch eine kleine Probe auf, um den Anteil der nicht gebundenen Proteine darzustellen. Waschen Sie die pelletierten Kügelchen fünfmal mit je 25 Milliliter TPBS, wobei Sie jeweils eine kleine Menge jeder Waschung für Waschkontrollen aufbewahren.Abschließend die Perlen in PBS zu einer 50 %igen (Gewicht/Volumen) Suspension resuspendieren und bei vier Grad Celsius lagern. Die Proteinkonzentration kann mithilfe des Bradford-Assays gemäß den Herstelleranweisungen geschätzt werden und sollte 500 Mikrogramm pro Milliliter betragen. Um die Bindungspartner von P zwei X zwei CT GST aus gesamten Hirnlysaten zu identifizieren, wird ein Pull-down-Assay unter Verwendung von CT GST, das an Glutathion-beschichteten Perlen immobilisiert ist, als Köder durchgeführt, wobei der Kontrollansatz ebenfalls berücksichtigt wird.Verwenden Sie GST allein, das an Perlen gebunden ist, als Köder, im Folgenden als GST-Knoll-Rattenhirn-Lysat bezeichnet. Für den GST-Fusionsprotein-Bindungsassay wurde ein Standardprotokoll verwendet, das Lysispuffer und die Proteinkonzentration wurden mittels Bradford-Assay auf 15 Milligramm pro Milliliter geschätzt. Vor Beginn des Assays.Präklarieren Sie das aufgetaute Hirnlysat, indem Sie es nach der Inkubation mit den GST-Beads eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit 30 Mikroliter GST-Beads inkubieren. Zentrifugieren Sie die Beads bei 1000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und bewahren Sie eine kleine Menge davon als Kontrolle auf.Berechnen Sie nun das Volumen des Lysats, das 100 Mikrogramm des vorbereinigten solubilisierten Proteins enthalten sollte, und mischen Sie dieses Volumen des Lysats mit 10 Mikrogramm GST-gebundenen Perlen und 10 Mikrogramm P zwei X zwei CT GST-gebundenen Perlen. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit Lysepuffer auf 200 Mikroliter ein. Inkubieren Sie das Lysat mit den Perlen über Nacht in einem Rotator bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Perlen bei 1000 × g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Die Perlen dreimal mit je einem Milliliter Lysepuffer waschen. Anschließend 50 µL modifizierten Lely-Puffer zu den Perlen geben und die Perlen in diesem Puffer fünf Minuten lang erhitzen.Zentrifugieren Sie die gekochten Proben bei 5.000 ×g für fünf Minuten und trennen Sie das Überstand auf einer 10 %igen SDS-PAGE-Gel. Vergleichen Sie die mit P2X2CT assoziierten Proteine mit denen, die mithilfe des GST-Nola-Baits gewonnen wurden. Der letzte entscheidende Schritt der Analyse besteht darin, die getrennten Proteine ab diesem Punkt aus dem Gel zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie zu entfernen.Die Abwesenheit von Staub während des gesamten Prozesses ist entscheidend, um Keratin-Kontaminationen zu vermeiden. Beginnen Sie damit, die Bänder mit einer sauberen Rasierklinge aus dem Gel herauszuschneiden. Zerkleinern Sie anschließend die Bänder in drei kleinere Abschnitte und geben Sie jedes Band in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen, das den entsprechenden Regionen des Gels im GST entspricht.Eine „No pull down“-Lane muss ebenfalls auf die gleiche Weise ausgeschnitten werden, unabhängig von der Bandenfärbung. Um sicherzustellen, dass Proteine unterhalb der Nachweisempfindlichkeit der Färbung nicht übersehen werden, mischen Sie die Gelstücke mit 200 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und 50 % (Volumen pro Volumen) Acetonitril und wirbeln die Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur.Nach dem Wirbeln die Waschlösung entfernen und den Vorgang wiederholen. Die letzte Waschlösung entfernen und die Gelstücke durch Zugabe von 200 Mikrolitern Acetonitril dehydrieren. Die Gelstücke sollten schrumpfen und undurchsichtig werden.Entfernen Sie innerhalb von zwei Minuten das Acetyl nitrile und trocknen Sie die Gelstücke. Anschließend werden die getrockneten Gelstücke für 10 Minuten im Speed-Vac behandelt und danach in einer frisch zubereiteten Lösung aus 10 Millimolar DTT und 10 Millimolar TEP inkubiert. Das Volumen der Lösung, üblicherweise etwa 30 Mikroliter, muss ausreichen, um die Gelstücke vollständig zu bedecken.Lassen Sie die Gelstücke 30 Minuten lang in der Lösung in einem Wärmesblock bei 56 Grad Celsius reduzieren. Entfernen Sie danach die DTT-TEP-Lösung und ersetzen Sie sie durch eine Waschlösung aus 100 Mikroliter 500 Millimolar Ammoniumbicarbonat in 50 % Acetonitril, wirbeln Sie 10 Minuten lang und aspirieren Sie anschließend nach dem Wirbeln die Ammoniumbicarbonat-Waschlösung ab. Ersetzen Sie diese dann durch 200 Mikroliter Acetonitril, um die Gelstücke zu dehydrieren. Die Gelstücke sollten innerhalb von zwei Minuten schrumpfen und ihre Farbe trüb werden.Neben Alkylat werden alle freien Sulfhydrylgruppen durch Umsetzung mit 100 Mikrolitern frisch zubereiteter 100-Millimolar-IODO-Acetamid-Lösung substituiert. Inkubieren Sie dieses Gemisch 25 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation entfernen Sie die IODO-Acetamid-Lösung und waschen die Gelstücke mit 200 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und 50 % Acetonitril durch Vortexen für fünf Minuten. Dieser Waschschritt wird einmal wiederholt. Entfernen Sie die letzte Waschlösung und inkubieren Sie die Gelstücke für 10 Minuten in 200 Mikrolitern Acetonitril. Entfernen Sie das Acetonitril und trocknen Sie die Proben im Speed-Vac.In diesem Schritt sind die Gelstücke bereit für die Trypsinverdauung. Geben Sie 30 Mikroliter Trypsinlösung mit einer Arbeitskonzentration von etwa 20 Nanogramm pro Mikroliter hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis.Die Gelstücke sollten gut aufquellen. Entfernen Sie die überschüssige Trypsinlösung und geben Sie die rehydrierten Gel-Partikel in 30 Mikroliter 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat. Lassen Sie die Verdauung 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius fortlaufen, anschließend stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von fünf Mikrolitern 5 %iger Ameisensäure, um das Trypsin zu inaktivieren.Anschließend die Röhrchen 15 Minuten lang verwirbeln; danach die Röhrchen kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit an den Boden des Röhrchens zu bringen, und diese Lösung, die die verdauten Peptide enthält, in ein sauberes, beschriftetes Halbmiliröhrchen überführen. Danach die Gelelektrophoresestücke mit etwa 30 Mikrolitern Extraktionslösung bedecken, die 0,1 % Ameisensäure in 50 % Acetonitril enthält, und 10 bis 15 Minuten lang verwirbeln. Diese Extraktionslösung dem neuen Halbmiliröhrchen hinzufügen.Wiederholen Sie diesen Schritt. Überführen Sie die Extraktionslösung in das neue Halbmikroröhrchen, und reduzieren Sie das Halbmikroröhrchen, das die Übernachtdigested-Lösung und die beiden Extraktionslösungen enthält, im Speed-Vakuum auf etwa 30 Mikroliter. Diese Peptidlösung ist nun bereit zur Analyse mittels L-C-M-S-M-S.Trennen Sie die Proteine mittels reverse-phase-Nano-LC an einer C18-Reversphasensäule und erwerben Sie die Spektren im datenabhängigen Modus, wobei der Orbitrap für MS-Scans und der LTQ für MS-MS-Scans verwendet wird. Identifizieren Sie die Proteine durch Suche der Daten gegen die Ratten-IPI-Datenbank unter Verwendung des Sequest-Algorithmus, der in das Bioworks-Softwarepaket integriert ist, und überprüfen Sie anschließend manuell nur die Spektren der Proteine, die in jedem der vier Probenreplikate vorhanden sind und bei GST-Pull-downs nicht vorhanden sind. Proteine, bei denen keine Pull-downs durchgeführt wurden, sollten für weitere Analysen nicht berücksichtigt werden.Hier ist das Cipro-Färbungsgel, das ein Spektrum an vermuteten Proteinen zeigt, die mit dem C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren. Fusioniert mit GST, angegeben durch die blaue Box, Kontrollspuren für alleiniges GST, angegeben durch die gelbe Box, und Glutathion. Sphero-Beads allein sind ebenfalls dargestellt.Die Pfeile zeigen Beispiele für einzigartige Banden an, die zur weiteren Analyse mittels Massenspektrometrie ausgeschnitten wurden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die CTOs von P zwei X zwei-Rezeptoren exprimiert und reinigt. Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie der Pull-down-Ansäuerungsschritt durchgeführt und die proteinvermittelnden Interaktoren identifiziert werden können.Es ist wichtig, bei diesem Verfahren daran zu denken, Handschuhe und eine Haarnetz zu tragen, um die Keratin-Kontamination in Ihren Proben zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Zelle durchlässig Vernetzer DSP [Dithiobis-(Succinimidylpropionat)] stabilisiert vorübergehend und labile...

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren In Vivo

Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.

Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Proteine interagieren miteinander und diese Wechselwirkungen bestimmen zu einem großen Teil ihre Funktionen. Protein-Interaktionspartner können bei hohem Durchsatz in vivo mit einem Hefe-Fitness-Assay identifiziert werden, der auf dem Dihydrofolat-Reduktase-Protein-Fragment-Komplementationsassay (DHFR-PCA) basiert.

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.

Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Bereitstellung von einzelligen Empfindlichkeit, eignet sich in Echtzeit Durchflusszytometrie einzigartig, multimodale Rezeptor Funktionen von lebenden Kulturen zu quantifizieren. Mit Erwachsenen neurale Vorläuferzellen, wurde die P2X7-Rezeptor-Funktion über Kalzium Zustrom von Kalzium Indikatorfarbstoff transmembranen Porenbildung durch Interkalation Bromid Aufnahme und Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen Phagozytose erkannt bewertet.

Echtzeit Live-Zelle Durchflusszytometrie, Calcium Zustrom, Porenbildung und Phagozytose durch P2X7-Rezeptoren im Erwachsenen neurale Vorläuferzellen zu untersuchen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Techniken zur Erzeugung einer Bibliothek von kurzen Peptiden, die Mastzellen über den MRGPRX2-Rezeptor aktivieren können, werden beschrieben. Zugehörige Techniken sind einfach, kostengünstig und können auf andere Zellrezeptoren ausgeweitet werden.

Screening von Peptiden, die MRGPRX2 mit engineered HEK Cells aktivieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Erfahren Sie, wie Sie Proteine identifizieren, die mit dem C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren. Diese Proteomik-Methode nutzt GST-Pulldown-Assays und Massenspektrometrie zur Analyse von Protein-Komplexen im Rattenhirn.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Weitere Videos entdecken

Proteomics, um Proteine interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren