Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Dieses Verfahren beginnt mit der Überexpression des rekombinanten C-Terminus des purinergen P2X-Rezeptors oder P2X2, der als GST-Fusionsprotein nach bakterieller Lyse konstruiert wurde. Das gereinigte Protein wird mit Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen inkubiert, und die Konzentration wird mittels der Bradford-Methode bestimmt. Anschließend werden Proteine aus einem gereinigten lysierten Rattenhirn mit dem an Glutathion-Sepharose-Kügelchen gebundenen C-Terminus der P2X2-Rezeptoren inkubiert, und die an den C-Terminus der P2X2-Rezeptoren gebundenen Protein-Komplexe werden mittels SDS-PAGE, Gelelektrophorese und Ausschneiden isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert.

Hallo, ich bin Harpring aus dem Labor der JIT K-Abteilung für Physiologie an der University of California Los Angeles. Hallo, ich bin Sarah Walburn aus dem Labor von Tom Vka in der Abteilung für Anästhesiologie an der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der CTS von P zwei X zwei-Rezeptoren.

Wir verwenden diese Proteine, um die Herkunft aus dem roten Gehirn zu identifizieren, und in unserem Labor nutzen wir diese Proteine, um die funktionellen Auswirkungen auf P2X2-Rezeptoren zu untersuchen. Beginnen wir also. Die zytoplasmatische Domäne des P2X2-Rezeptors besteht aus den N- und C-Termini.

Das C-terminale Ende des P2X2-Rezeptors wird als Köder für den Pull-down-Assay verwendet, wie auch die Sequenz des C-terminalen Endes des P2X2-Rezeptors dargestellt ist, die für diese Interaktionsstudie verwendet wurde. Um die vollständige Länge des C-terminalen Endes der P2X2-Rezeptoren zu exprimieren, verwenden Sie herkömmliche molekularbiologische Techniken, um die Kodiersequenz für das C-terminale Ende des Rezeptors – die Reste 353 bis 472 – in ein pGE-X4-NT1-Plasmid zu integrieren.

Das rekombinante Plasmid wird anschließend in den E. coli-Stamm BBL 21 zur Expression transformiert. Die Bakterien, die das rekombinante Plasmid enthalten, werden in LB bei 37 °C kultiviert. Wenn die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern zwischen 0,6 und 0,8 liegt.

Bereiten Sie die Kultur mit einem Millimolar IPTG aus und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die dreistündige Inkubation abgeschlossen ist, entnehmen Sie ein Ein-Milliliter-Aliquot aus der Kultur und bewahren Sie es für eine spätere Analyse auf. Zentrifugieren Sie den Rest der Kultur bei 5.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Salin-Tris-EDTA-Puffer. Überführen Sie das resuspendierte Pellet in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen.

Die Suspension muss nun 15 Minuten bei 5.000 Gs zentrifugiert werden, um das halbtrockene Pellet zu gewinnen, das über Nacht bei minus 70 Grad Celsius eingefroren wird. Am folgenden Tag wird das gefrorene Pellet in 40 Milliliter eiskaltem Lysepuffer resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis gehalten, während das resuspendierte Pellet auf Eis steht. Bereiten Sie drei Milliliter Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen vor.

Waschen Sie die Perlen zunächst mit 20 Milliliter PBS und 20 Milliliter TPBS. Danach waschen Sie die Perlen mit reinem PBS und resuspendieren sie in einem Milliliter PBS. Die Bakteriensuspension im Lysepuffer wird nun durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen behandelt.

Die gefrorene Probe wurde zum Auftauen auf Eis inkubiert und erneut mit flüssigem Stickstoff gespült. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Als Nächstes wird die Gefriertau-Suspension auf Eis beschallt.

Nach der Beschallung inkubieren Sie die Bakteriensuspension 30 Minuten lang auf Eis mit einer Lösung, die 4 % Tritton X 110, 10 Millimolar Magnesiumsulfat und zwei Millimolar ATP enthält. Anschließend zentrifugieren Sie das Lysat 15 Minuten bei 20.000 ×g und vier Grad Celsius und sammeln den Überstand. Bevor Sie das Pellet verwerfen, entnehmen Sie eine kleine Probe aus dem Pellet mit Überstand, um die Proteine im Cytosol und in den Membranen zu analysieren.

Incubieren Sie das Überstand mit den Kügelchen eine Stunde oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation mit 500 × g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den größten Teil des Überstands, bewahren Sie jedoch eine kleine Probe auf, um den Anteil der nicht gebundenen Proteine darzustellen. Waschen Sie die pelletierten Kügelchen fünfmal mit je 25 Milliliter TPBS, wobei Sie jeweils eine kleine Menge jeder Waschung für Waschkontrollen aufbewahren.

Abschließend die Perlen in PBS zu einer 50 %igen (Gewicht/Volumen) Suspension resuspendieren und bei vier Grad Celsius lagern. Die Proteinkonzentration kann mithilfe des Bradford-Assays gemäß den Herstelleranweisungen geschätzt werden und sollte 500 Mikrogramm pro Milliliter betragen. Um die Bindungspartner von P zwei X zwei CT GST aus gesamten Hirnlysaten zu identifizieren, wird ein Pull-down-Assay unter Verwendung von CT GST, das an Glutathion-beschichteten Perlen immobilisiert ist, als Köder durchgeführt, wobei der Kontrollansatz ebenfalls berücksichtigt wird.

Verwenden Sie GST allein, das an Perlen gebunden ist, als Köder, im Folgenden als GST-Knoll-Rattenhirn-Lysat bezeichnet. Für den GST-Fusionsprotein-Bindungsassay wurde ein Standardprotokoll verwendet, das Lysispuffer und die Proteinkonzentration wurden mittels Bradford-Assay auf 15 Milligramm pro Milliliter geschätzt. Vor Beginn des Assays.

Präklarieren Sie das aufgetaute Hirnlysat, indem Sie es nach der Inkubation mit den GST-Beads eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit 30 Mikroliter GST-Beads inkubieren. Zentrifugieren Sie die Beads bei 1000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und bewahren Sie eine kleine Menge davon als Kontrolle auf.

Berechnen Sie nun das Volumen des Lysats, das 100 Mikrogramm des vorbereinigten solubilisierten Proteins enthalten sollte, und mischen Sie dieses Volumen des Lysats mit 10 Mikrogramm GST-gebundenen Perlen und 10 Mikrogramm P zwei X zwei CT GST-gebundenen Perlen. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit Lysepuffer auf 200 Mikroliter ein. Inkubieren Sie das Lysat mit den Perlen über Nacht in einem Rotator bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Perlen bei 1000 × g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Die Perlen dreimal mit je einem Milliliter Lysepuffer waschen. Anschließend 50 µL modifizierten Lely-Puffer zu den Perlen geben und die Perlen in diesem Puffer fünf Minuten lang erhitzen.

Zentrifugieren Sie die gekochten Proben bei 5.000 ×g für fünf Minuten und trennen Sie das Überstand auf einer 10 %igen SDS-PAGE-Gel. Vergleichen Sie die mit P2X2CT assoziierten Proteine mit denen, die mithilfe des GST-Nola-Baits gewonnen wurden. Der letzte entscheidende Schritt der Analyse besteht darin, die getrennten Proteine ab diesem Punkt aus dem Gel zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie zu entfernen.

Die Abwesenheit von Staub während des gesamten Prozesses ist entscheidend, um Keratin-Kontaminationen zu vermeiden. Beginnen Sie damit, die Bänder mit einer sauberen Rasierklinge aus dem Gel herauszuschneiden. Zerkleinern Sie anschließend die Bänder in drei kleinere Abschnitte und geben Sie jedes Band in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen, das den entsprechenden Regionen des Gels im GST entspricht.

Eine „No pull down“-Lane muss ebenfalls auf die gleiche Weise ausgeschnitten werden, unabhängig von der Bandenfärbung. Um sicherzustellen, dass Proteine unterhalb der Nachweisempfindlichkeit der Färbung nicht übersehen werden, mischen Sie die Gelstücke mit 200 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und 50 % (Volumen pro Volumen) Acetonitril und wirbeln die Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach dem Wirbeln die Waschlösung entfernen und den Vorgang wiederholen. Die letzte Waschlösung entfernen und die Gelstücke durch Zugabe von 200 Mikrolitern Acetonitril dehydrieren. Die Gelstücke sollten schrumpfen und undurchsichtig werden.

Entfernen Sie innerhalb von zwei Minuten das Acetyl nitrile und trocknen Sie die Gelstücke. Anschließend werden die getrockneten Gelstücke für 10 Minuten im Speed-Vac behandelt und danach in einer frisch zubereiteten Lösung aus 10 Millimolar DTT und 10 Millimolar TEP inkubiert. Das Volumen der Lösung, üblicherweise etwa 30 Mikroliter, muss ausreichen, um die Gelstücke vollständig zu bedecken.

Lassen Sie die Gelstücke 30 Minuten lang in der Lösung in einem Wärmesblock bei 56 Grad Celsius reduzieren. Entfernen Sie danach die DTT-TEP-Lösung und ersetzen Sie sie durch eine Waschlösung aus 100 Mikroliter 500 Millimolar Ammoniumbicarbonat in 50 % Acetonitril, wirbeln Sie 10 Minuten lang und aspirieren Sie anschließend nach dem Wirbeln die Ammoniumbicarbonat-Waschlösung ab. Ersetzen Sie diese dann durch 200 Mikroliter Acetonitril, um die Gelstücke zu dehydrieren. Die Gelstücke sollten innerhalb von zwei Minuten schrumpfen und ihre Farbe trüb werden.

Neben Alkylat werden alle freien Sulfhydrylgruppen durch Umsetzung mit 100 Mikrolitern frisch zubereiteter 100-Millimolar-IODO-Acetamid-Lösung substituiert. Inkubieren Sie dieses Gemisch 25 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation entfernen Sie die IODO-Acetamid-Lösung und waschen die Gelstücke mit 200 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und 50 % Acetonitril durch Vortexen für fünf Minuten.

Dieser Waschschritt wird einmal wiederholt. Entfernen Sie die letzte Waschlösung und inkubieren Sie die Gelstücke für 10 Minuten in 200 Mikrolitern Acetonitril. Entfernen Sie das Acetonitril und trocknen Sie die Proben im Speed-Vac.

In diesem Schritt sind die Gelstücke bereit für die Trypsinverdauung. Geben Sie 30 Mikroliter Trypsinlösung mit einer Arbeitskonzentration von etwa 20 Nanogramm pro Mikroliter hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis.

Die Gelstücke sollten gut aufquellen. Entfernen Sie die überschüssige Trypsinlösung und geben Sie die rehydrierten Gel-Partikel in 30 Mikroliter 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat. Lassen Sie die Verdauung 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius fortlaufen, anschließend stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von fünf Mikrolitern 5 %iger Ameisensäure, um das Trypsin zu inaktivieren.

Anschließend die Röhrchen 15 Minuten lang verwirbeln; danach die Röhrchen kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit an den Boden des Röhrchens zu bringen, und diese Lösung, die die verdauten Peptide enthält, in ein sauberes, beschriftetes Halbmiliröhrchen überführen. Danach die Gelelektrophoresestücke mit etwa 30 Mikrolitern Extraktionslösung bedecken, die 0,1 % Ameisensäure in 50 % Acetonitril enthält, und 10 bis 15 Minuten lang verwirbeln. Diese Extraktionslösung dem neuen Halbmiliröhrchen hinzufügen.

Wiederholen Sie diesen Schritt. Überführen Sie die Extraktionslösung in das neue Halbmikroröhrchen, und reduzieren Sie das Halbmikroröhrchen, das die Übernachtdigested-Lösung und die beiden Extraktionslösungen enthält, im Speed-Vakuum auf etwa 30 Mikroliter. Diese Peptidlösung ist nun bereit zur Analyse mittels L-C-M-S-M-S.

Trennen Sie die Proteine mittels reverse-phase-Nano-LC an einer C18-Reversphasensäule und erwerben Sie die Spektren im datenabhängigen Modus, wobei der Orbitrap für MS-Scans und der LTQ für MS-MS-Scans verwendet wird. Identifizieren Sie die Proteine durch Suche der Daten gegen die Ratten-IPI-Datenbank unter Verwendung des Sequest-Algorithmus, der in das Bioworks-Softwarepaket integriert ist, und überprüfen Sie anschließend manuell nur die Spektren der Proteine, die in jedem der vier Probenreplikate vorhanden sind und bei GST-Pull-downs nicht vorhanden sind. Proteine, bei denen keine Pull-downs durchgeführt wurden, sollten für weitere Analysen nicht berücksichtigt werden.

Hier ist das Cipro-Färbungsgel, das ein Spektrum an vermuteten Proteinen zeigt, die mit dem C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren. Fusioniert mit GST, angegeben durch die blaue Box, Kontrollspuren für alleiniges GST, angegeben durch die gelbe Box, und Glutathion. Sphero-Beads allein sind ebenfalls dargestellt.

Die Pfeile zeigen Beispiele für einzigartige Banden an, die zur weiteren Analyse mittels Massenspektrometrie ausgeschnitten wurden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die CTOs von P zwei X zwei-Rezeptoren exprimiert und reinigt. Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie der Pull-down-Ansäuerungsschritt durchgeführt und die proteinvermittelnden Interaktoren identifiziert werden können.

Es ist wichtig, bei diesem Verfahren daran zu denken, Handschuhe und eine Haarnetz zu tragen, um die Keratin-Kontamination in Ihren Proben zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.