Name: Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Lernen Sie die Hanging-Drop-Methode zur Vorbereitung von Drosophila-Embryonen für Live-Imaging. Dieses einfache Protokoll schützt vor Dehydratation und Hypoxie, verhindert Kompression und ermöglicht hochwertige GFP-basierte Bildgebung über mehrere Stunden.

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Wir bedanken uns für die Unterstützung zu BHR durch ein Discovery-Stipendium sowie ein Recherche-Tools und Instrumenten-Stipendium der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir erkennen auch H. Oda und die Bloomington Drosophila Lager-Center für die Bereitstellung von genetischen Aktien, die im Beispiel Live-Imaging-Sequenzen verwendet wurden.

Vorbereitung <ol><li> Sammeln Embryonen auf Standard Traubensaft Agar Platten 4. Es ist zweckmäßig, eine automatisierte Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment Ltd) zu verwenden. Verwenden von synchronen inszeniert Embryo Sammlungen wird die Zahl der dechorionations, die durchgeführt werden, um eine ausreichende Anzahl von Embryonen in der gewünschten Entwicklungsstadium zu erhalten muss zu reduzieren. </li><li> Bereiten Sie eine dechorionation gleiten durch die Anbringung eines Stück doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger, ziehen Sie die Schutzfolie vom Band. </li><li> Bereiten Sie die Live-Imaging-Kammer, indem ein Stück des Gewebes in der auch der Kammer passen. Legen Sie das Gewebe in den Brunnen und nass ist es mit destilliertem Wasser. </li><li> Mix Halocarbonöl (Halocarbon Products Corp) Viskosität Serie 700 und Serie 56 mit einem Verhältnis von 1:1. Die Mischung kann gespeichert und verwendet werden auf unbestimmte Zeit. </li><li> Legen Sie mehrere kleine Tropfen Halocarbonöl auf der Oberfläche von einem Deckglas (22 X 40 mm, Nr. 2). Die Lautstärke ist nicht kritisch, sollte aber in der Reihenfolge von 20-40 ul werden. </li></ol> Verfahren <ol><li> Mit Hilfe von einem Stereomikroskop, sammeln Embryonen aus der Traubensaft-Agar-Platten entweder mit einem Paar von Juwelier Zange (Nr. 5) oder eine sehr feine Pinsel. Embryonen neigen dazu, miteinander und mit der Zange &quot;Spitzen-Stick, sie sind leicht in Klumpen zusammen. </li><li> Mit Hilfe von einem Stereomikroskop, sanft niedriger die Klumpen von Embryonen, die zu den Spitzen der Pinzette auf die Oberfläche des Bandes auf der dechorionation schieben müssen eingehalten werden. </li><li> Wieder mit dem Stereomikroskop, sanft anstoßen oder Schlaganfall die Embryonen mit der Seite der Zange um Aufbrechen der äußeren wachsartige Chorion ohne Zerreißen der inneren Dotterhaut (der Embryo wird platzen, wenn die Dotterhaut ist gebrochen). </li><li> Sobald die äußere Chorion wurde gebrochen hat, necken sich der Embryo aus dem Chorion, der dechorionated Embryo neigt dazu, an die Oberfläche der Zange zu halten. Achten Sie darauf, berühren Sie nicht die dechorionated Embryo auf der Oberfläche des Bandes. </li><li> Sobald ein Embryo dechorionated ist, schnell zu übertragen, um die zuvor hergestellte Tropfen Halocarbonöl auf dem Deckglas. Berühren Sie die Spitze der Zange Durchführung der dechorionated Embryo in die Oberfläche des Halocarbonöl drop - das löst den Embryo aus der Zange in das Öl. </li><li> Bestätigen Übertragung des Embryos auf die Öltropfen. Dies kann mit dem bloßen Auge, sofern Sie über einen schwarzen Hintergrund arbeiten und eine faseroptische Lichtquelle in einem schrägen Winkel gesetzt getan werden. </li><li> Bevor Sie versuchen, ein anderer Embryo dechorionate, sauber kein Öl aus der Zange. Pinzetten in Öl überzogen haben weniger Kauf auf dem Chorion Oberfläche, so dass dechorionation erschwert. </li><li> Dechorionated Embryonen sind lebhaft in der Halocarbonöl. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel und während Sie durch ein Stereomikroskop, drücken Sie den Embryo an der Unterseite der Öltropfen und ordnen sie in die gewünschte Position. </li><li> Schnell umdrehen das Deckglas über dem Brunnen der Live-Imaging-Kammer. Bestätigen Sie, dass die Embryonen vor dem Deckglas ruht in der gewünschten Orientierung. Durch den Auftrieb im Öl, wird die Embryonen nun gegen die untere Fläche des Deckglases zu schweben. Befestigen Sie das Deckglas auf die Live-Imaging-Kammer mit Klebeband. Lüften Sie den Raum, indem Löcher in das Band in der Gegend, wo das Band erstreckt sich über die Lücke zwischen dem Ende des Deckglases und das Ende der gut von der Live-Imaging-Kammer. </li><li> Eine aufrechte Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenz-Stereomikroskop kann nun verwendet werden, um Bild die Embryonen werden. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Wir beschreiben eine neue Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-Imaging-Analyse, die wir als die hängenden Tropfen Protokoll. Leider ist es nicht möglich, den hängenden Tropfen-Protokoll verwenden, wenn die Arbeit mit einem inversen Mikroskop. In diesem Fall wird die Sandwich-Technik (wie in der abstrakten oben beschrieben) verwendet werden muss und Kompression der Embryonen weiterhin Anlass zur Sorge. In Experimenten, bei denen Zellen Form und Größe gemessen, um geme...

Standard-Ausrüstung und Materialien benötigt, um Embryonen für Live-Imaging-Vorbereitung mit dem hängenden Tropfen Protokoll umfassen die folgenden Punkte: Objektträger, Deckgläser (22 x 40 mm, Nr. 2), doppelseitiges Klebeband, Juwelier Pinzetten (Dumont Stil Nr. 5 ), Halocarbonöl Serie 56 und Serie 700 (Halocarbon Products Corp), einem Messer oder einzelne Rasierklinge, Seidenpapier, Schere, destilliertes Wasser, Allzweck-Klebeband und einer Pipette geeignet zur Förderung von 20-40 ul. Die Live-Imaging-Protokoll erfordert auch eine maßgeschneiderte Live-Imaging-Kammer. Dies wird durch das Schneiden eines 5 mm denke Polycarbonat Kunststoffplatten an die Dimensionen eines Standard-Objektträger (75 x 25 mm) und mit einem Rotor zu einem 3mm tiefe Depression in der Folie (20 X 55 mm) erstellen vorbereitet. Der Zugang zu einem Stereomikroskop (Binokular) und eine faseroptische Lichtquelle ist ebenfalls erforderlich.

die herstellung drosophila embryonen für live-imaging mit dem hanging-drop-protokoll

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Das grün fluoreszierende Protein (GFP)-basierte Zeitraffer Live-imaging ist eine leistungsstarke Technik für die Untersuchung der genetischen Regulation von dynamischen Prozessen wie Gewebemorphogenese, Zell-Zell-Adhäsion oder Zelltod. Drosophila-Embryos, die GFP sind leicht abgebildet entweder mit stereoskopischen oder konfokalen Mikroskopie. Ein Ziel eines jeden Live-imaging-Protokoll ist es, schädliche Auswirkungen wie Dehydratation und Hypoxie zu minimieren. Vorherige Protokolle für die Vorbereitung Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse beteiligt Platzierung dechorionated Embryonen in Halocarbonöl und sandwiching sie zwischen einem Halogenkohlenwasserstoff gasdurchlässige Membran und einem Deckglas<sup&gt; 1-3</sup&gt;. Die Einführung der Kompression durch die Montage Embryonen auf diese Weise stellt eine unerwünschte Komplikation für biomechanische-basierte Analyse der Morphogenese. Unsere Methode, die wir als die hängenden Tropfen Protokoll, ergeben sich ausgezeichnete Lebensfähigkeit von Embryonen während der Live-Bildgebung und verlangt nicht, dass Embryonen komprimiert werden. Kurz gesagt, beinhaltet die hängenden Tropfen Protokoll der Platzierung von Embryonen in einem Tropfen Halocarbonöl, die aus einem Deckglas, das ist wiederum in der Position über eine feuchte Kammer fest aufgehängt ist. Neben der Bereitstellung von Gasaustausch und verhindert Austrocknung, nimmt diese Anordnung den Vorteil des Auftriebs von Embryonen in Halocarbonöl sie davon abzuhalten, aus der Position im Zeitraffer Übernahme zu verhindern. Dieses Video beschreibt detailliert, wie zu sammeln und vorzubereiten Drosophila-Embryonen für die Live-Aufnahme nach dem hängenden Tropfen Protokoll. Dieses Protokoll eignet sich für die Bildgebung dechorionated Embryonen mit Stereomikroskopie oder aufrechte Verbindung Fluoreszenzmikroskop.

Eine einfache, kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse vorgestellt. Unser Protokoll sieht vor Feuchtigkeit und Gasaustausch und komprimiert nicht die Drosophila-Embryo. Diese Methode eignet sich für GFP-basierte Live-Darstellung von Drosophila-Embryonen mit einem Stereomikroskop oder aufrecht zusammengesetzte Mikroskop.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Die auf dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) basierende Zeitraffer-Live-Imaging-Technik ist ein leistungsstarkes Verfahren zur Untersuchung der genetischen Regulation dynamischer Prozesse wie ...

Hallo. Mein Name ist Bruce Reed. Ich bin Assistenzprofessor an der Fakultät für Biologie an der University of Waterloo in Waterloo, Ontario, Kanada. Wir erstellen heute dieses Videoarchiv, um eine neue von uns entwickelte Technik zur Vorbereitung weicher Embryonen für die Live-Bildanalyse zu dokumentieren.Bei der Durchführung von Live-Bildgebungsanalysen an Drosophila-Embryonen verwenden wir häufig die zeitraffende Aufnahme, die mehrere Stunden andauern kann. Daher ist es wichtig, eine Technik anzuwenden, bei der die Embryonen vor Austrocknung sowie vor Hypoxie geschützt sind. Zusätzlich möchten wir auch eine Technik entwickeln, die jegliche Kompression des Embryos vermeidet.Bei der Montage haben wir eine sehr einfache, kostengünstige und effektive Methode entwickelt, die wir als Hängentropfenpräparation bezeichnen. Die Hängentropfenpräparation eignet sich für die Live-Bildanalyse von Embryonen mittels Stereomikroskopie oder jedes aufrechten zusammengesetzten Mikroskops. Dieser Zeitrafferfilm zeigt acht GFP-exprimierende Embryonen, die mit der Hängentropfen-Methode präpariert und mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet wurden.Diese Aufnahmesequenz umfasst einen Zeitrau

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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Dieses Video beschreibt, wie man Mikroinjektionen durchführt, die Reagenzien in lebende Drosophila-Embryonen einbringen. Forscher können diese Methode nutzen, um exogene Verbindungen wie Nukleinsäuren und Proteine in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung einzuführen. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie das Verfahren für die Injektion eines löslichen Reagenzes eingerichtet und durchgeführt wird – hier ein fluoreszierendes Protein für Live-Imaging-Experimente.

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Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Lernen Sie die Hanging-Drop-Methode zur Vorbereitung von Drosophila-Embryonen für Live-Imaging. Dieses einfache Protokoll schützt vor Dehydratation und Hypoxie, verhindert Kompression und ermöglicht hochwertige GFP-basierte Bildgebung über mehrere Stunden.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

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