Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Hallo. Mein Name ist Bruce Reed. Ich bin Assistenzprofessor an der Fakultät für Biologie an der University of Waterloo in Waterloo, Ontario, Kanada. Wir erstellen heute dieses Videoarchiv, um eine neue von uns entwickelte Technik zur Vorbereitung weicher Embryonen für die Live-Bildanalyse zu dokumentieren.

Bei der Durchführung von Live-Bildgebungsanalysen an Drosophila-Embryonen verwenden wir häufig die zeitraffende Aufnahme, die mehrere Stunden andauern kann. Daher ist es wichtig, eine Technik anzuwenden, bei der die Embryonen vor Austrocknung sowie vor Hypoxie geschützt sind. Zusätzlich möchten wir auch eine Technik entwickeln, die jegliche Kompression des Embryos vermeidet.

Bei der Montage haben wir eine sehr einfache, kostengünstige und effektive Methode entwickelt, die wir als Hängentropfenpräparation bezeichnen. Die Hängentropfenpräparation eignet sich für die Live-Bildanalyse von Embryonen mittels Stereomikroskopie oder jedes aufrechten zusammengesetzten Mikroskops. Dieser Zeitrafferfilm zeigt acht GFP-exprimierende Embryonen, die mit der Hängentropfen-Methode präpariert und mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet wurden.

Diese Aufnahmesequenz umfasst einen Zeitraum von über vier Stunden. Das Einsetzen der Bewegung zeigt, dass sich diese Embryonen in einem lebensfähigen Zustand befinden. Im Folgenden erläutern wir Ihnen Schritt für Schritt detailliert, wie man das Hanging-Drop-Protokoll durchführt.

Embryos werden auf standardisierten Traubensaft-, Ei- oder Agarplatten gesammelt. Mithilfe eines automatisierten DSO-FLA-Eikollektors von Fly Max Scientific Equipment ermöglicht der automatisierte Kollektor synchronisierte Sammlungen von Embryonen in einem vorbestimmten Entwicklungsstadium. Zur Vorbereitung der manuellen Präparation von Embryonen wird ein Stück doppelseitig klebendes Klebeband auf einen Objektträger befestigt, und die Schutzfolie des Klebebands wird entfernt.

Das Hänge-Tropfen-Protokoll erfordert eine speziell angefertigte Kammer aus einer fünf Millimeter dicken Polycarbonat-Kunststoffscheibe. Die Scheibe wird auf die Abmessungen eines Objektträgers zugeschnitten, und mit einem Fräser wird eine drei Millimeter tiefe Vertiefung angelegt. Die Befeuchtung der Kammer für die Live-Bildgebung wird mithilfe eines passgenau zugeschnittenen Papiertuchs erreicht, das in die Vertiefung der Kammer eingelegt und mit destilliertem Wasser benetzt wird.

Halo-Carbon-Öl eignet sich ideal für die Live-Bildgebung von koordinierten Drosophila-Embryonen, da es gasdurchlässig und optisch klar ist. Durch das Mischen der Halo-Carbon-Öle der Serie 700 und der Serie 56 im Verhältnis eins zu eins ergibt sich eine Viskosität, die für die Arbeit mit Drosophila-Embryonen geeignet ist. Die Embryonen können mit einer Juwelierspinzette oder einem sehr feinen Pinsel von den Agarplatten mit Traubensaft gesammelt werden.

Embryonen haften aneinander und an den Pinzetten Spitzen. Sie lassen sich leicht in Klumpen, Embryonenklumpen, sammeln. An der Pinzette haftend.

Die Spitzen werden vorsichtig auf die klebrige Oberfläche des Klebebands auf der zuvor vorbereiteten Dekorationsplatte abgesenkt. Während man die Embryonen durch ein Stereomikroskop betrachtet, stößt man sie leicht an oder streicht mit der Seite der Pinzette darüber. Dabei muss die Corone geöffnet werden, ohne die innere Vilinmembran zu rupturieren.

Dies erfordert eine ruhige Hand, Geduld und etwas Übung. Sobald die äußere Korone durchbrochen wurde, neigt das dechlorinierte Embryo dazu, an der Pinzette zu haften. Achten Sie darauf, dass das dechlorinierte Embryo nicht mit der klebrigen Oberfläche des Klebebands in Kontakt kommt.

Es kann sehr schwierig sein, es schnell vom Band zu entfernen. Übertragen Sie die dechlorinierten Embryonen sofort in den Halos. Platziert man Tropfen von Karo-Öl auf dem Deckglas. Es ist ratsam, dies in der Nähe zu haben. Indem man die Spitze der Pinzette auf die Oberfläche des Karo-Öl-Tropfens im Halos berührt.

Der Embryo wird aus der Pinzette in das Öl überführt; die Übertragung des Embryos kann mit bloßem Auge mithilfe eines schwarzen Hintergrunds und einer schräg angeordneten faseroptischen Lichtquelle überprüft werden, bevor Sie den nächsten Embryo chlorieren. Es ist hilfreich, das Öl von Ihrer Pinzette abzuwischen, da diese aufgrund ihrer Auftriebskraft auf dem Halocarbon-Öl schwimmt. Die koordinierten Embryonen schwimmen auf der Oberfläche des Öltropfens.

Wir können die Position und Ausrichtung der Embryonen kontrollieren, indem wir sie bis zum Boden des Öltropfens schieben und die Deckglasabdeckung im Hängentropfen-Protokoll schnell umdrehen. Wir stellen das Deckglas auf die befeuchtete Vertiefung der Live-Bildgebungskammer. Wenn das Deckglas umgedreht ist, liegen die Embryonen an der Unterseite des Deckglases an.

Die Ruhepositionen der Embryonen können unter einem Stereomikroskop überprüft werden. Falls diese nicht zufriedenstellend sind, kann der Vorgang wiederholt werden. Sobald die Embryonen in der gewünschten Position liegen, wird die Deckglasplatte mit Klebeband an der Live-Bildgebungskammer befestigt.

Die Kammer wird belüftet, indem Löcher in das Klebeband geschnitten werden. Die Embryonen sind nun bereit, abgebildet zu werden.