Name: Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatzverfahren zur Untersuchung der Organellen-Morphologie in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht die effiziente Einbindung von GFP-Markern in Deletionsmutanten und die Visualisierung durch Konfokalmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Stipendium 31/C15982), der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, die British Columbia Knowledge Development Fund, der Michael Smith Foundation for Health Research (Zuschuss zu CJR unterstützt Loewen) und Fight For Sight.

Material und Methoden: <ol><li> Hefestämme: <ul><li> ACP1-GFP (GFP:: His): C-terminale GFP-Markierung von ACP1 wurde durch eine PCR-vermittelte homologe Rekombination unter Verwendung von Plasmid pKT128 (enthält GFP und HIS5) generiert. Positive Transformanten wurden durch konfokale Mikroskopie und Kolonie-PCR bestätigt. Der Stamm Hintergrund war BY7043 (MAT alpha can1Δ: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) aus Boone lab (Tong und Boone, 2006). </li><li> Deletionsmutante Array (DMA) (xxx:: KanR): es ist ein Array von rund 5.000 Deletionsmutanten von nicht-essentiellen Gene. Alle diese essentiellen Gene wurden auf G418 klopfte. Der Stamm Hintergrund des Arrays ist BY4741 (MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Unsere DMA wurde ursprünglich aus Boone Labor. </li></ul></li><li> Die Einbeziehung ACP1-GFP in den DMA: Das folgende Protokoll zur Herstellung eines GFP-Array wird von der Synthetic Genetic Analysis (SGA) Technologie (Tong und Boone, 2006) mit Modifikationen angepasst. Alle Replik Pinning Schritte sind mit einem Singer ROTOR high-density Anordnen Robot-System durchgeführt. Alternativ kann die manuelle Pinning oder eine Flüssigkeit-basierte High-Density-Anordnen Roboters verwendet werden. Abkürzungen: YPD, Hefeextrakt-Pepton-Dextrose, SD, synthetische Dropout, LRK, Lue / Arg / Lys-Dropout Medien; LHRK, Lue / His / Arg / Lys-Dropout Medien Vorbereitung <ol><li> Wachsen Sie einen Rasen ACP1-GFP-Zellen durch Eingießen einer 5 ml über Nacht ACP1-GFP Kultur auf eine YPD Platte. Lassen Sie die Platte ausreichend trocknen durch eine Flamme oder in einem biologischen Abzug. </li><li> Die Platte bei 30 ˚ C über Nacht. </li><li> Mit Hilfe eines Roboters, array ACP1-GFP-Stamm auf 1536 Kolonien pro Platte. Zur gleichen Zeit bereiten eine neue Kopie des DMA durch Nachbildung Pinning auf YPD + G418-Platten. </li><li> Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht. Paarung und diploid Auswahl </li><li> Mate die ACP1-GFP-Stamm mit der DMA von Replik Pinning und über-legen die Kolonien auf YPD-Platten. </li><li> Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht. </li><li> Replica-Platte die Kolonien auf SD - His + G418-Platten zu wählen diploiden Zellen (MATa / MATalpha). </li><li> Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht. Sporulationg und Keimung </li><li> Replica-Platte der diploiden Kolonien über eine verstärkte Sporulation Medien, die reduzierte Mengen an Kohlenstoff und Stickstoff-Quellen für die Bildung von meiotischen Sporen induzieren enthält. </li><li> Die Inkubation bei 25 ˚ C für mindestens 5 Tage. </li><li> Keimen die MATa meiotischen Nachkommen von Replika-Plattierung der Kolonien auf LRK Medien und inkubieren Sie die Platten bei 30 ˚ C für zwei Tage. </li><li> Diese Medien werden induzieren die Keimung von haploiden Zellen, die aus Sporen. Da ein LUE2 Eröffnung Leserahmen (ORF) in der Mata-spezifische STE2 Förderer integriert ist, werden alle Haploiden gekeimt MATa werden. Die Auswahl der beiden Allele </li><li> Es ist jetzt notwendig, um sowohl die GFP-Allel und dem einzigen mutierten Allels zu wählen. Um dies zu erreichen, sind MATa Zellen replica-plated auf LRK + G418 Medien, die für die haploiden Zellen, die das Gen-Deletion (xxx:: kanR) tragen wählt. </li><li> Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht. </li><li> Schließlich werden die MATa meiotischen Nachkommen replica-plated auf LHRK + G418 Medien für das Wachstum der einzelnen Mutanten (xxx:: kanR) wählen auch beherbergen ACP1-GFP (GFP:: His). Diese Platten können bei 4 ˚ C für bis zu 3 Monaten. </li></ol> Das folgende Protokoll zur Herstellung eines GFP-Array wird von der Synthetic Genetic Analysis (SGA) Technologie (Tong und Boone, 2006) mit Modifikationen angepasst. Alle Replik Pinning Schritte sind mit einem Singer ROTOR high-density Anordnen Robot-System durchgeführt. Alternativ kann die manuelle Pinning oder eine Flüssigkeit-basierte High-Density-Anordnen Roboters verwendet werden. Abkürzungen: YPD, Hefeextrakt-Pepton-Dextrose, SD, synthetische Dropout, LRK, Lue / Arg / Lys-Dropout Medien; LHRK, Lue / His / Arg / Lys-Dropout Medien Vorbereitung </li><li> Mikroskopie: <ol><li> Wählen Sie die gewünschte Mutante (s) zum Ausdruck ACP1-GFP direkt von der Platte. </li><li> Wachsen Zellen bei 30 ° C in YPD-oder SD - Seine Medien frühen log-Phase. </li><li> Visualisieren Sie mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie mit der GFP Filtersatz. Ein Beispiel für zu erwartende Ergebnis wird in Abbildung 1. </li></ol></li></ol> SGA-Medien: Das Wachstum Medien (YPD) und wählen Sie Medien (SD) in diesem Protokoll verwendet wird routinemäßig in Hefe Molekularbiologie. Bitte beachten Sie Methods in Hefe (Amberg et al., 2005) für detaillierte Beschreibungen. LRK, LHRK Medien (für 400 ml gesamt) <table border="0"><tbody><tr><td> Fügen Sie in Ordnung </td><td> Betrag </td></tr><tr><td> Hefe Stickstoffbase mit Ammoniumsulfat </td><td> 2,7 g </td></tr><tr><td> AminosäureMischung </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> 20% Dextrose </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Abkühlen auf 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml Canavanin </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, pour 50 ml pro Platte </td></tr></tbody></table> LRK, LHRK + G418 Media (für 400 ml gesamt) <table border="0"><tbody><tr><td> Fügen Sie in Ordnung </td><td> Betrag </td></tr><tr><td> Hefe Stickstoffbase ohne Ammoniumsulfat </td><td> 0,7 g </td></tr><tr><td> Aminosäure-Mix </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Mononatriumglutamat </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> 20% Dextrose </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Abkühlen auf 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml Canavanin </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, pour 50 ml pro Platte </td></tr></tbody></table> Angereichert Sporulation Medien (für 400 ml gesamt) <table border="0"><tbody><tr><td> Fügen Sie in Ordnung </td><td> Betrag </td></tr><tr><td> Kaliumacetat </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> Hefeextrakt </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Sporulation Aminosäure-Mix </td><td> 0,04 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Abkühlen auf 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, pour 50 ml pro Platte </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Diese Methode kann effektiv helfen enthalten eine mitochondriale Marker, ACP1-GFP in verschiedenen Mutanten Hintergrund. Es beruht auf der Verwendung eines Robot-System, und kann leicht für die Verwendung mit jedem Roboter-System übernommen. Dieses Verfahren kann auch für die Einbeziehung anderer Arten von Markierungen verwendet werden. Zum Beispiel, zu visualisieren ER, verwenden wir routinemäßig die Markierung ERG11-GFP. In unserer repräsentativen Bilder, ein mutiertes und ein Wildtyp mit der ACP1-GFP-Hersteller waren...

<table><tbody><tr><td>SGA-Medien</td><td></td><td></td><td>Die in diesem Protokoll verwendeten Wachstumsmedien (YPD) und synthetischen Ausschlussmedien (SD) einschließlich LRK und LHRK sowie das angereicherte Sporulationsmedium werden routinemäßig in der Hefe-Molekularbiologie verwendet. Ausführliche Beschreibungen finden sich in „Methods in Yeast“ (Amberg et al., 2005).</td></tr></tbody></table>

ein high-throughput-verfahren zur global studie der organellen-morphologie in s. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-Throughput-Methoden, um Protein-Lokalisierung oder Organellen Morphologie zu untersuchen ist ein effektives Werkzeug zur Untersuchung der Protein-Wechselwirkungen und kann dazu beitragen, einen umfassenden Verständnis der molekularen Mechanismen. In Saccharomyces cerevisiae, mit der Entwicklung der non-essential Gendeletion Array, können wir global Studie die Morphologie der verschiedenen Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Mitochondrien mit GFP (oder eine Variante)-Marker in verschiedenen Gen-Hintergründen. Allerdings Einbeziehung GFP Marker in jeder einzelnen Mutanten individuell ist ein arbeitsintensiver Prozess. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das routinemäßig in unserem Labor verwendet wird. Durch den Einsatz eines Roboters zum High-Density-Hefe-Arrays und Drogen Auswahl Techniken umgehen, können wir deutlich verkürzen den Zeitaufwand und erhöhen die Reproduzierbarkeit. In kurzen, überqueren wir eine GFP-markierten mitochondrialen Marker (APC1-GFP), um ein High-Density Array von 4.672 essentielle Gen-Deletionsmutanten durch Robot-Replik Pinning. Durch diploid Auswahl, Sporulation, Keimung und Dual-Marker Auswahl, gewinnen wir beide Allele. Als Ergebnis enthält jeder haploid einzigen mutierten APC1-GFP in ihrer genomischen Locus integriert. Jetzt können wir untersuchen die Morphologie der Mitochondrien in alle nicht unbedingt mutierte Hintergrund. Mit diesem High-Throughput-Ansatz können wir bequem studieren und beschreiben die Wege und Gene in der Vererbung und der Bildung von Organellen in einer genomweiten Einstellung beteiligt.

GFP-Fusionsproteine ​​sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Hochdurchsatzmethoden zur Untersuchung der Proteinlokalisation oder der Organellmorphologie sind effektive Werkzeuge zur Analyse von Proteininteraktionen und können dazu beitragen ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung eines Arrays aus einem CP one GFP, indem zunächst eine Zelllinie kultiviert und anschließend das Array auf eine frische Platte aufgeimpft wird. Gleichzeitig wird eine frische Kopie des DMA hergestellt. Anschließend werden das ACP one GFP-Array mit dem DMA verpaart und Diploide ausgewählt, die dann auf Sporulationsmedium gesporuliert werden.Fünf Tage später werden die myotischen Nachkommen auf LRK-Medien keimfähig gemacht, auf denen nur MAT A Haploide wachsen. Durch zwei zusätzliche Selektionsrunden erhalten wir Haplo-Zellen, die sowohl ACP1-GFP als auch ein auf Kanamycin ausgeschaltetes Gen tragen. Schließlich können wir einzelne Stämme direkt von der Platte auswählen und die Mitochondrienmorphologie mittels konfokaler Mikroskopie beobachten.Hallo, ich bin Chap T aus dem Law-Labor aus der Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie am Life Science Institute der University of British Columbia. Hallo, ich bin Jesse Chao, ebenfalls aus dem Loan-Labor. Heute zeigen wir Ihnen eine Hochdurchsatzmethode zur Einfügung von GFP-Markern in verschiedene Mutanten-Hintergründe bei Hefe unter Verwendung eines Robotersystems.Wir verwenden dieses Verfah

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Biology

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Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen...

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.

4D-Mikroskopie der Hefe

Hier präsentieren wir Live-Zell-Bildgebung, eine ungiftige Mikroskopiemethode, die es Forschern ermöglicht, das Proteinverhalten und die Kerndynamik in lebenden Spalthefezellen während Derose und Meiose zu untersuchen.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Hefewachstumsphänotypen werden präzise durch hochparallele Zeitraffer-Bildgebung von immobilisierten Zellen gemessen, die zu Mikrokolonien heranwachsen. Gleichzeitig können Stresstoleranz, Proteinexpression und Proteinlokalisierung überwacht werden, wodurch integrierte Datensätze generiert werden, um zu untersuchen, wie ökologische und genetische Unterschiede sowie die Genexpressionsheterogenität unter isogenen Zellen das Wachstum modulieren.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Lernen Sie ein Hochdurchsatzverfahren zur Untersuchung der Organellen-Morphologie in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht die effiziente Einbindung von GFP-Markern in Deletionsmutanten und die Visualisierung durch Konfokalmikroskopie.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

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