Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung eines Arrays aus einem CP one GFP, indem zunächst eine Zelllinie kultiviert und anschließend das Array auf eine frische Platte aufgeimpft wird. Gleichzeitig wird eine frische Kopie des DMA hergestellt. Anschließend werden das ACP one GFP-Array mit dem DMA verpaart und Diploide ausgewählt, die dann auf Sporulationsmedium gesporuliert werden.

Fünf Tage später werden die myotischen Nachkommen auf LRK-Medien keimfähig gemacht, auf denen nur MAT A Haploide wachsen. Durch zwei zusätzliche Selektionsrunden erhalten wir Haplo-Zellen, die sowohl ACP1-GFP als auch ein auf Kanamycin ausgeschaltetes Gen tragen. Schließlich können wir einzelne Stämme direkt von der Platte auswählen und die Mitochondrienmorphologie mittels konfokaler Mikroskopie beobachten.

Hallo, ich bin Chap T aus dem Law-Labor aus der Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie am Life Science Institute der University of British Columbia. Hallo, ich bin Jesse Chao, ebenfalls aus dem Loan-Labor. Heute zeigen wir Ihnen eine Hochdurchsatzmethode zur Einfügung von GFP-Markern in verschiedene Mutanten-Hintergründe bei Hefe unter Verwendung eines Robotersystems.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Morphologie von Organellen wie D, endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien zu untersuchen. Beginnen wir also. Für dieses Protokoll verwenden wir zwei verschiedene Hefestämme.

Ein ACP1-GFP ist ein Stamm mit einer C-terminalen GFP-Markierung von ACP1, der durch eine PCR-vermittelte homologe Rekombination unter Verwendung des Plasmids PKT 1 28 erzeugt wird. Der Hintergrundstamm ist BY 7 0 4 3. Wir verwenden außerdem den DMA-Stamm oder das Deletionsmutanten-Array, welches aus etwa 5.000 Deletionsmutanten nicht essentieller Gene besteht.

All diese nicht essentiellen Gene wurden auf G vier 18 ausgeschaltet. Der Stammhintergrund des Arrays ist BY 47 41. Beginnen Sie mit dem Anzüchten von Alan von ACP1-GFP-Zellen, indem Sie fünf Milliliter Übernachtkultur von ACP1-GFP auf eine Hiss-Platte gießen.

Lassen Sie die Platte ausreichend durch eine Flamme oder in einer biologischen Abzugshaube trocknen. Nach dem Trocknen inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Inkubation einen Roboter, um den A CP one GFP-Stamm mit 1.536 Kolonien pro Platte anzuordnen.

Bereiten Sie gleichzeitig eine frische Kopie des DMA vor, indem Sie vier 18-Platten mit YPDG durch Replika-Pinning beimpfen. Inkubieren Sie die Platten anschließend über Nacht bei 30 Grad Celsius, nachdem die Stämme gewachsen sind. Stellen Sie den A-CP1-GFP-Stamm mit dem DMA durch Replika-Pinning und Überlagerung der Kolonien auf YPD-Platten her und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Kolonien mittels Abdruckplatten auf SD-his-G4-18-Platten übertragen, um transformierte Zellen auszuwählen, und die Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Um die Sporulation und Keimung auf der ersten Abdruckplatte einzuleiten, die Diploide auf YPDG-G4-18-Platten übertragen, um die Effizienz der Sporulation im nächsten Schritt zu erhöhen. Nach einer Inkubation bei 30 Grad Celsius für einen Tag die Diploide mittels Abdruckplatten auf verändertes Sporulationsmedium übertragen, das verminderte Mengen an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, um die Bildung meiotischer Sporen zu induzieren.

Anschließend die Platten mindestens fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Matte keimen lassen, einen myotischen Nachkommen, indem die Kolonien durch Replikaplanzung auf LRK-Medien übertragen werden. Dieses Medium induziert die Keimung von Tabellenzellen aus Sporen; die Platten zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubieren, um Zellen auszuwählen, die sowohl das GFP-Allel als auch das einzelne Mutantenallel tragen.

Die Matt A-Zellen werden auf Lade G vier 18 Medium umgeimpft, das für haploide Zellen mit Genlöschung selektiert, und die Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert. Anschließend werden die mat A meiotischen Nachkommen auf L-H-R-K-G vier 18 Medium umgeimpft, um das Wachstum einzelner Mutanten zu selektieren, die außerdem ACP1-GFP enthalten, und über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert.

Die Platten können anschließend bis zu drei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um die gewünschten Mutanten, die ein CP-GFP direkt von der Platte exprimieren, sichtbar zu machen, beginnen Sie damit, die gewünschten Kolonien von den Platten abzupiksen. Kultivieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius in YPD- oder SD-hiss-Medien bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase.

Visualisieren Sie abschließend einen Mutanten mithilfe der konfokalen Mikroskopie mit dem GFP-Filter. In diesem konfokalen Bild wurden ein Mutant und ein Wildtyp mit dem ACP1-GFP-Marker mittels konfokaler Mikroskopie zur Untersuchung der Mitochondrienmorphologie dargestellt. Dieser spezielle Mutant weist ein gestörtes mitochondriales Phänotyp auf und ist daher ein guter Kandidat für weitere Untersuchungen. Wir haben Ihnen gezeigt, wie man einen multiklonalen Marker, ACP1-GFP, mithilfe eines Robotersystems effizient in ein Deletionsmutanten-Array integriert.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Medium frisch herzustellen und ausreichend Zeit für das Trocknen einzuplanen. Bei zu hoher Feuchtigkeit bildet sich Kondenswasser, wodurch die Kontaminationsgefahr steigt. Außerdem sollten Sie überprüfen, ob alle Selektionsmedien korrekt hergestellt wurden, da sie für dieses Protokoll entscheidend sind.

Dieses Verfahren kann auch für andere Arten von Markern verwendet werden. Um beispielsweise er sichtbar zu machen, verwenden wir routinemäßig den Marker air 11 und GSP. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.