Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Mithilfe dieses Verfahrens können wir die Muster der Genexpression in Zebrafischembryonen mit hoher Auflösung bestimmen. Eine Antisense-Ribo-Sonde wird an die komplementäre Ziel-mRNA hybridisiert. Die markierte Ribo-Sonde wird von einem Antikörper erkannt, der mit einem Peroxidase-Enzym konjugiert ist. Ein aramidkonjugiertes Fluoro-Vier wird den Embryonen zugesetzt, und die Peroxidase wandelt das IDE in eine stark reaktive Verbindung um. Dies führt zur stabilen Ablagerung des Fluoro-Vier. Ungebundenes IDE wird ausgewaschen, wodurch das detaillierte subzelluläre Muster der mRNA-Verteilung sichtbar wird.

Die Expression eines zweiten Gens kann mithilfe einer spezifisch markierten Sonde und einer anderen tyrom Fluoro Vier detektiert werden, wodurch ein detaillierter Vergleich der Expression ermöglicht wird. Hallo, ich bin Tim Brent aus dem Labor von Scott Holly am Fachbereich Molekulare, zelluläre und entwicklungsbiologische Wissenschaften der Yale University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur hochauflösenden doppelten fluoreszenten In-situ-Hybridisierung an ganzen Zebrafisch-Embryonen im Labor.

Wir verwenden dieses Verfahren, um die Segmentierung von Zebrafischen zu untersuchen. Beginnen wir also. Starten Sie das Verfahren mit Embryonen, die über Nacht in der Kälte in Paraformaldehyd fixiert wurden.

Die Verwendung eines frisch aufgetauten Vorrats an Paraformaldehyd für diese Fixierung ist entscheidend für eine erfolgreiche Färbung. Entfernen Sie die Fixierungslösung und waschen Sie die Embryonen zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBS. Entfernen Sie anschließend die Chorionhülle der Embryonen.

Die Embryonen werden in Glas-Depressionsplatten gegeben. Mit Uhrmacherpinzette wird ab jetzt das Corian entfernt. Zum Übertragen der Embryonen wird eine feuerpolierte Glas-Pasteurpipette verwendet.

Andernfalls haften die Embryonen an den gewöhnlichen Polypropylen-Spitzen. Die dechlorierten Embryonen werden durch eine Reihe von Waschungen mit zunehmender Methanol-Konzentration überführt. Die letzte Waschung erfolgt in 100 % Methanol.

Schließlich werden die Embryonen in frisches Methanol gegeben und über Nacht bei minus 20 Grad gelagert. Am nächsten Tag überführen Sie die Embryonen durch eine Serie von Waschschritten mit abnehmender Methanol-Konzentration und zwei Pufferwäschen mit PBST jeweils fünf Minuten lang. Danach fixieren Sie die Embryonen mit Paraformaldehyd für 20 Minuten.

Beenden Sie die kurze Fixierung mit zwei fünfundzwanzigminütigen PBST-Spülungen. Nun sind wir bereit, die Embryonen zu permeabilisieren. Die fixierten Embryonen werden permeabilisiert, indem sie mit Proteinase K inkubiert werden. Achten Sie darauf, das Mikrozentrifugenröhrchen seitlich liegend aufzulegen.

Die Dauer des Verdauungsschritts hängt vom Alter des Embryos ab. Beispielsweise werden Embryonen im Somato-Genese-Stadium drei bis vier Minuten lang inkubiert. Kurz in PBST spülen und anschließend einmal fünf Minuten in PBST waschen.

Fixieren Sie die Embryonen in Paraformaldehyd. Spülen Sie die Embryonen abschließend zweimal für jeweils fünf Minuten in PBST. Die Embryonen sind nun bereit für die Hybridisierung mit den RNA-Sonden.

Nun, da wir die Embryonen fixiert und permeabilisiert haben, beginnen wir den Hybridisierungsprozess mit einer fünfminütigen Inkubation in High-Minus bei 65 Grad Celsius. Denken Sie daran, die HIIN-Lösung vor der Verwendung vorzuwärmen. Anschließend inkubieren Sie die Embryonen eine Stunde lang in High-Plus.

Auch hier gilt wieder, die High-Plus-Lösung vorzuwärmen. Entfernen Sie nun den größten Teil der High-Plus-Lösung, lassen jedoch 50 Mikroliter zurück, wobei sichergestellt werden muss, dass die Embryonen vollständig untergetaucht bleiben. Geben Sie je einen Mikroliter jeder Sonde hinzu und mischen Sie, indem Sie vorsichtig mit dem Finger an das Röhrchen klopfen.

Bedecken Sie die Röhrchen von nun an mit Aluminiumfolie. Da Fluorescein lichtempfindlich ist, wird die Hybridisierung über Nacht bei 65 Grad Celsius durchgeführt. Entfernen Sie nun die überschüssigen Sonden.

Das Detergens wird entfernt, um die Färbung zu verbessern. Beachten Sie jedoch, dass die Embryonen in Abwesenheit von Detergens klebrig werden. Waschen Sie zweimal mit 50 % Formamid in zweifacher XSSC-Lösung, jeweils 30 Minuten lang.

Einmal mit zwei Mal XSSC-Lösung 15 Minuten lang waschen. Abschließend zweimal mit 0,2 Mal SSC jeweils 30 Minuten lang waschen. Als Nächstes visualisieren wir jede Sonde.

Jetzt können wir mit der Detektion der hybridisierten Sonden beginnen. Detektieren Sie zuerst die Fluorescein-Sonde, da diese weniger stabil und schwächer ist als die Digoxigenin-Sonde. Blocken Sie zunächst mit 500 µL 2 % Blockier-Reagenz in Maleinsäure-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Fügen Sie anschließend das mit Peroxidase konjugierte Anti-Fluorescein-Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 in der Blockierungslösung hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, das Mikrozentrifugenröhrchen seitlich liegend aufzustellen.

Als Nächstes starten Sie die Detektion unter Verwendung des Tyram-Signalverstärkungssystems oder TSA. TYRAM-IDE ist mit einem Fluorophor Vier konjugiert. Die auf dem Antikörper gebundene Meerrettichperoxidase wandelt das TYRAM-IDE in ein hochreaktives Zwischenprodukt um. Das reaktive TYRAM-IDE bildet eine kovalente Bindung zu Aminosäureresten in unmittelbarer Nähe des Antikörpers, was zu einer lokalisierten Ablagerung des Fluorophors Vier führt.

Beginnen Sie mit viermaligem Waschen für jeweils 20 Minuten mit einem x Maleinsäurepuffer bei Raumtemperatur, anschließend zweimal mit PBS waschen. Die Fluorescein-TY-IDE wurde zuvor zur Lagerung in DMSO gelöst. Zentrifugieren Sie dieses TSA-Substrat kurz.

Als Nächstes verdünnen Sie das TSA-Substrat im Verhältnis 1:50 im Amplifikationsverdünnungspuffer. Geben Sie die Lösung zu den Embryonen hinzu und inkubieren Sie 45 Minuten. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen seitlich ab.

Während dieses Inkubationsschritts überführen Sie die Embryonen durch eine Serie von 10-minütigen Waschschritten mit zunehmender Methanol-Konzentration. Der letzte Waschschritt erfolgt 10 Minuten lang in 100 % Methanol, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten in einer Lösung mit 1 % Wasserstoffperoxid, um die Peroxidase auf dem Antikörper zu inaktivieren. Andernfalls könnte dies die Detektion des Digoxigens stören.

Überführen Sie die Embryonen durch eine Reihe von Waschschritten mit abnehmender Methanol-Konzentration und zwei zehnminütigen Pufferwäschen mit PBS. Dadurch wird sichergestellt, dass das gesamte Methanol entfernt wird. Die Antikörpermarkierung des Dig-Xigen und des Sondens erfolgt nach einem Blockierungsschritt, wie bereits bei dem vorherigen Antikörper beschrieben.

Fügen Sie anschließend den Anti-Digoxigenin-Antikörper in einer Verdünnung von 1 zu 1000 hinzu. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen zur Seite und inkubieren Sie über Nacht bei Kälte. Am nächsten Tag waschen Sie mit Puffer aus Maleinsäure bei Raumtemperatur.

Dann mit PBS schnell den SCI-fünf-Tyrom-Substrat. Verdünnen Sie ihn im Verhältnis 1 zu 50 und geben Sie ihn zu den Embryonen hinzu. Inkubieren Sie 45 Minuten lang, wobei das Gefäß seitlich liegt.

Abschließend dreimal mit PBST waschen. Ein letzter Färbungsschritt mit Propidiumiodid markiert die Kerne. Beginnen Sie mit zwei Waschungen in zwei XSSC, jeweils fünf Minuten lang.

Als Nächstes 30 Minuten bei 37 Grad mit RNasen behandeln. Sechs Mal bei Raumtemperatur in zwei XSSC waschen und dann die Propidiumiodidlösung hinzufügen und acht Minuten lang einfärben. Sechs Mal in zwei XSSC waschen.

Fixieren Sie die Embryonen 20 Minuten lang in Parafformaldehyd. Abschließend zwei Waschschritte mit je fünf Minuten in PBST. Das Aufbringen der Embryonen zur Betrachtung beginnt mit zwei Inkubationsschritten von jeweils 10 Minuten in 25 % und 50 % Glycerin.

Als Nächstes geben Sie die Proben in 75 % Glycerin und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Dieser über Nacht durchgeführte Klärungsschritt erleichtert die Dissektion der Embryonen. Schließlich dissezieren Sie die Embryonen und entfernen den Dottersack.

Um die Hintergrundfluoreszenz zu verringern, werden die Embryonen als Flachpräparat auf einem Objektträger aufgebracht und unter dem Mikroskop untersucht. Diese Bilder zeigen eine einzelne konfokale Schnittansicht durch die hintere Spitze eines Zebrafisch-Embryos im 10-Somite-Stadium. Die rote Färbung zeigt mittels eines Digoxigenin-markierten Sonden und TSA-Cy5-Reagenz nachgewiesenes delta C-mRNA.

Die grüne Färbung stellt ihr mRNA dar, das mit einer Fluorescein-markierten Sonde nachgewiesen wurde. Und TSA-Fluorescein-Reagenz, Kerne mit Propidiumjodid gefärbt, erscheinen blau in einem doppelt gefärbten Embryo.

Bereiche mit unterschiedlicher oder überlappender Expression können eindeutig bestimmt werden. Die Durchführung dieses Verfahrens zeigt die subzelluläre Lokalisation von mRNA, wie in diesen Vergrößerungen der Färbung deutlich wird. Die aktive Transkription des Gens wird durch punktförmige Färbungen im Zellkern sichtbar.

Andere Zellen weisen eine zytoplasmatische Lokalisation des mRNA-Moleküls auf. Im doppelt gefärbten Embryo können wir Zellen erkennen, die beide Gene oder jeweils nur eines der Gene transkribieren.

Unabhängig davon haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man eine hochauflösende doppelte fluoreszierende In-situ-Hybridisierung an Zebrafischembryonen im Whole-Mount-Verfahren durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass wir unsere Sonden zunächst mit Standard-Sonden für die alkalische Phosphatase-vermittelte Färbung testen; Sonden, die ein sauberes und starkes Signal ergeben, eignen sich in der Regel gut für die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung.

Wir haben außerdem erfolgreich die Immunlokalisierung von Beta-Catenin anstelle der Propidiumiodid-Färbung verwendet. Wenn wir diese Variante durchführen, führen wir die Hybridisierungsreaktionen bei 55 Grad Celsius statt bei 65 durch. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.