Name: Brain-Banking: Making the Most Ihrer Forschung Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie die systematische Probenaufbereitung von Gehirngewebe für Kryostatschnitte und das Brain-Banking. Diese Methode ermöglicht unverzerrte stereologische Analysen und langfristige Lagerung für Neurowissenschaftler.

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Die Autoren bedanken sich bei Ikiel Ptito für seine weitere fachliche Unterstützung danken.

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe <ol><li> Tissue sollte gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. </li><li> Das Gehirn soll stereotaxically blockiert, entfernt aus dem Schädel, gewogen und Volumen bestimmt 2. Das Gewebe sollte dann in abgestufter Saccharose-Lösungen mit einer Endkonzentration von 30% Saccharose in Phosphatpuffer cryoprotected werden. Blockiert von Gewebe sollte dann in Isopentan bei -65 ° C eingefroren und bei -80 ° C bis Sie bereit sind zu schneiden sind. </li></ol> Teil 2: Systematische Sampling <ol><li> Systematische Stichproben beruht auf einem richtigen Plan vor dem Schneiden. Die gesamte Region von Interesse sowohl in der rostral-caudalen und dorsalen-ventralen Ausmaß sollte genau definiert werden. Eine stereotaktische Atlas der Arten in Gebrauch ist hilfreich, um die Region von Interesse zu definieren und die Länge der Region von Interesse zu bestimmen. Sobald die Länge der Region von Interesse bestimmt ist es notwendig, das Abtastintervall zu etablieren. Zum Beispiel aus der stereotaktischen Atlas Sie feststellen, dass die gesamte rostro-kaudale Ausdehnung der Region von Interesse von ca. 3 mm in der Länge ist, wenn Schnitte in der Frontalebene. Sie entscheiden dann, mit dem Kryostaten Abschnitt gesetzt bei 50 um, in diesem Tempo werden Sie 60 Abschnitte für den rostral-kaudale Ausdehnung der Region von Interesse sind. Für eine typische unvoreingenommene stereologische Studie 6-10 systematisch abgetastet Abschnitte sind erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. In diesem Beispiel 10 Sektionen gleichmäßig über die rostro-kaudale Ausdehnung Ergebnis in einem Abtastintervall von 1 / 6 Abschnitte verteilt. </li></ol> Teil 3: Erstellung des Gehirns Bank <ol><li> Sobald der Abschnitt Abtastfrequenz bestimmt worden ist, ist der nächste Schritt, um zu bestimmen, die Flecken sofort durchgeführt werden. Zum Beispiel, wenn Sie mit Kresylviolett Färbung die Sie aufnehmen 1 / 6 Abschnitte auf einer Folie. Dies wird series 1 sein. Wenn Sie wissen, dass es vielleicht mehrere potenzielle Antikörper, die Sie gerne laufen, aber entweder wollen die Daten sehen, dass Ihre primäre Fleck stellt oder haben einfach nicht die Zeit, die Immunhistochemie durchzuführen, legen Sie die restlichen 5 Reihe von Abschnitten in der Reihenfolge ihres wurden in Vertiefungen mit Antigen zu erhalten (1% Polyvinylpyrrolidon, 50% Ethylenglykol in o.1M PBS, pH 7,4) in Scheiben geschnitten. Die folgende Tabelle bietet einen Stichprobenplan, bestehend aus 1 Rutsche und 1 Platte (Standard 48-Well-Platte) der Abschnitte als Teil eines Gehirns Bank (Tabelle 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Der Abschnitt Abtastfrequenz hier ist 1 / 6. Der erste Abschnitt ist auf einer Folie für Kresylviolett Färbung gelegt und die nächsten 5 Sektionen werden in Antigen platziert zu bewahren. Nummer des Abschnitts 7 wird dann auf der Folie erfasst und Abschnitte 9-12 sind in Antigen platziert zu bewahren. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis die Region von Interesse oder die Sperrung von Gewebe ist erschöpfend geschnitten. </li><li> Der nächste Schritt ist, um abschließend Abschnitt des Blocks von Gewebe. Legen Sie eine kleine Menge Einbettmedium auf dem Futter und lassen Sie es einfrieren. Legen Sie das Futter in den Mikrotom Kopf und abrasieren genug von den gefrorenen Mediums auf eine ebene Oberfläche haben. Entfernen Sie das Futter aus dem Mikrotom Kopf und Stelle flach innerhalb des Kryostaten. Gießen Einbettmedium auf dem Futter und einen festen Platz im Gehirn blockieren mit dem stereotaxically Schnittseite flach auf dem Futter positioniert. Langsam und vollständig eingebettet in das Gehirn Eindeckmedium. Legen Sie das Futter mit dem Gehirn in das Mikrotom Kopf und Abschnitt mit dem vorher festgelegten Parameter für den Abschnitt Sampling-Frequenz. </li><li> Nachdem der Block des Gewebes wurde abschließend geschnitten und Abschnitte sind in Vertiefungen gegeben, decken Sie die Platte mit dem Deckel, wickeln Sie den Deckel mit Parafilm und in einem -20 ° C Gefrierschrank. Melden Sie sich die Gesamtzahl der Abschnitte für jede Serie, die section-Abtastintervall, und die Anzahl der Reihen für jedes Tier übernommen. Dieses Protokoll wird entscheidend sein, den Überblick über nachträgliche Entfernung von Teilen davon abhalten, das Gehirn Bank für zukünftige Immunhistochemie. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse: Systematische Stichproben auf diese Weise eine gängige Praxis in unserem Labor in den letzten 3 Jahren. Wir hatten viel Erfolg Durchführung Immunhistochemie auf Material, das in Antigen gespeichert wurde erhalten drei Jahre nach, ohne eine Verschlechterung des Signals (Abbildung 1) in Scheiben geschnitten wurde. Darüber hinaus als Teil unseres Gehirns Bank haben wir rund 20.000 systematische Abschnitte des nicht-menschlichen angemeldetPrimatengehirn (Abbildung 2) als Teil unserer langfristigen Forschungs-Pläne. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Abbildung 1. Dies ist ein Ausschnitt aus dem okzipitalen Pol des nicht-menschlichen Primaten ist immungefärbt für NeuN zeigt sowohl Schicht VI und interstitielle weißen Substanz Nervenzellen. Dies insbesondere Abschnitt wurde in Antigen gespeichert bewahren bei -20 ° C für einen Zeitraum von 2 Jahren. Maßstab = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="figure2" /> Abbildung 2. Unsere vervet Gehirn Bank besteht heute aus rund 20.000 systematische Abschnitte aus über 30 Affen.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Systematische Stichproben ist eine kostengünstige Methode soll Forschungsmaterial zu maximieren. Diese Strategie der Probenahme ist so konzipiert, mit dem geltenden nationalen unvoreingenommene Stereologie, dass die systematische Stichproben in der gesamten Region erfordert entsprechen. Es ist wichtig, dass die Reihenfolge der Abschnitte für jede Serie beibehalten wird. In unserem Labor haben wir erfolgreich diese Methode für Banken sowohl Hamster und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten verwendet. Bisher haben wir...

<table><tbody><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Scientific Einbettmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bereich von Interesse<sup&gt; 1</sup&gt;. Um dieses Ziel zu erreichen 6-10 systematische Abschnitte sollten untersucht werden, die den gesamten Aufbau. Typischerweise geht mit der Verarbeitung 1 / 5 Abschnitte, die eine erhebliche Menge an Material unbearbeitet lässt. Um das Material zu maximieren, schlagen wir ein kostengünstiges Verfahren zur Konservierung von fixiertem Gewebe als Teil einer langfristigen Lagerung Forschungsplan. Als Gewebe wird in Scheiben geschnitten und für den gewünschten Fleck oder Antikörper, alternative Abschnitte verarbeitet werden, sollten systematisch in Antigen platziert werden erhalten bei -20 ° C für die zukünftige Verarbeitung. Mit 24-Well-Platten, können Abschnitte, um für den späteren Abruf gestellt werden. Mit dieser Methode kann Gewebe gespeichert und verarbeitet werden für die Immunhistochemie im Laufe der Jahre.

Brain-Banking und systematische Entnahme von biologischem Material bildet die Grundlage für unvoreingenommene Stereologie und maximiert das Potenzial von Daten aus jeder Probe erhalten.

Brain-Banking: Making the Most Ihrer Forschung Proben

Die unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der Gesamtzahl der Neuronen (oder anderer Zelltypen) in einem bestimmten Zielbereich1. Um ...

Zur Vorbereitung dieses Verfahrens sollte das Gehirnblock für den Kryostaten vorbereitet und die Schnittentnahmefrequenz festgelegt werden. Anschließend sollten die Antigenkonservierung und die Objektträger vorbereitet werden. Das Gehirnblock sollte auf dem Spannfutter im Inneren des Kryostaten platziert werden.Wenn das Gehirn sicher im Spannabschnitt bei einer voreingestellten Dicke eingebettet ist, sollten systematisch Schnitte angefertigt werden, sodass Serie eins auf einen Objektträger gelegt wird und weitere Serien in Vertiefungen überführt werden, die zuvor mit Antigen-Konservierungsmittel gefüllt wurden. Sobald der Block vollständig aufgebraucht ist, stellen Sie die Platte als Teil Ihrer Gehirnbank in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal.Hallo, ich bin Dr. Shahin Zur, ebenfalls vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mo Petto, Leiter des Labors für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zu

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Rattenmodell der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD), die die anhaltenden Veränderungen im neuroendokrinen Funktion und die verzögerte langfristige, übertriebene Angstreaktion, die charakteristisch für PTBS-Patienten zeigt. Das Tiermodell und hier beschriebenen Methoden sind nützlich zum Korrelieren Biomarkern in Gehirnkernen, die mechanistische sind, aber nicht bei Patienten gemessen werden, wobei Biomarkern in peripheren weißen Blutzellen, welches kann.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Das Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zum symmetrischen Präparieren eines fixierten postmortalen menschlichen Gehirns und bereitet kleinere Gewebeblöcke für die weitere Analyse vor.

Symmetrische bihemisphärische Schnitte des menschlichen postmortalen Gehirns

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Organisiert Gehirn Schneidverfahren sind erforderlich, spezifische neuropsychiatrischen Phänomene mit endgültiger neuropathologischen Diagnosen zu korrelieren. Gehirn-Stecklinge werden unterschiedlich durchgeführt auf der Grundlage verschiedener klinisch-akademischen Eventualitäten. Dieses Protokoll beschreibt ein symmetrisches Verfahren bihemispheric Hirnschnitt hemisphärischen Unterschiede in der menschlichen Hirnerkrankungen zu untersuchen und zu aktuellen und zukünftigen biomolekularen /...

Symmetrische Bihemispheric Postmortem Gehirn Schneiden Gesund und krankhafte Gehirnbedingungen beim Menschen zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.

Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um einzelne Gehirn-Aging-Trajektorien durch ein Gehirn-Spenden-Programm und die richtige Charakterisierung des Gehirns zu verfolgen. Hirnspender sind an einer langfristigen Längs-Langzeitstudie beteiligt, einschließlich serieller multidimensionaler Bewertungen. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Gehirnverarbeitung und eine genaue Diagnosemethodik.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

Biobank für translationale Medizin: Standardarbeitsanweisungen für optimales Probenmanagement

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.

Verbesserung der Zuverlässigkeit von Prostatatumor-Biobanken durch verbesserte Probenahmetechnik und histologische Charakterisierung

Moderne Neurowissenschaften müssen Unterschiede zwischen vielen Arten erforschen, einschließlich Labornagetiere und Menschen. Dennoch entstehen technische Schwierigkeiten, wenn großhirnige Säugetiere beteiligt sind. Dieser Ansatz adressiert die interartische Variation neuronaler Populationen bei sehr unterschiedlichen Säugetieren und liefert vergleichbare Ergebnisse, die zur Aufdeckung evolutionärer Muster kartiert werden können.

Ein vergleichender Ansatz für quantitative Zellzählungsstudien in sehr unterschiedlichen Säugetierhirnen

Erfahren Sie die systematische Probenaufbereitung von Gehirngewebe für Kryostatschnitte und das Brain-Banking. Diese Methode ermöglicht unverzerrte stereologische Analysen und langfristige Lagerung für Neurowissenschaftler.

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