Name: Brain-Banking: Making the Most Ihrer Forschung Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie die systematische Probenaufbereitung von Gehirngewebe für Kryostatschnitte und das Brain-Banking. Diese Methode ermöglicht unverzerrte stereologische Analysen und langfristige Lagerung für Neurowissenschaftler.

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Die Autoren bedanken sich bei Ikiel Ptito für seine weitere fachliche Unterstützung danken.

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe <ol><li> Tissue sollte gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. </li><li> Das Gehirn soll stereotaxically blockiert, entfernt aus dem Schädel, gewogen und Volumen bestimmt 2. Das Gewebe sollte dann in abgestufter Saccharose-Lösungen mit einer Endkonzentration von 30% Saccharose in Phosphatpuffer cryoprotected werden. Blockiert von Gewebe sollte dann in Isopentan bei -65 ° C eingefroren und bei -80 ° C bis Sie bereit sind zu schneiden sind. </li></ol> Teil 2: Systematische Sampling <ol><li> Systematische Stichproben beruht auf einem richtigen Plan vor dem Schneiden. Die gesamte Region von Interesse sowohl in der rostral-caudalen und dorsalen-ventralen Ausmaß sollte genau definiert werden. Eine stereotaktische Atlas der Arten in Gebrauch ist hilfreich, um die Region von Interesse zu definieren und die Länge der Region von Interesse zu bestimmen. Sobald die Länge der Region von Interesse bestimmt ist es notwendig, das Abtastintervall zu etablieren. Zum Beispiel aus der stereotaktischen Atlas Sie feststellen, dass die gesamte rostro-kaudale Ausdehnung der Region von Interesse von ca. 3 mm in der Länge ist, wenn Schnitte in der Frontalebene. Sie entscheiden dann, mit dem Kryostaten Abschnitt gesetzt bei 50 um, in diesem Tempo werden Sie 60 Abschnitte für den rostral-kaudale Ausdehnung der Region von Interesse sind. Für eine typische unvoreingenommene stereologische Studie 6-10 systematisch abgetastet Abschnitte sind erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. In diesem Beispiel 10 Sektionen gleichmäßig über die rostro-kaudale Ausdehnung Ergebnis in einem Abtastintervall von 1 / 6 Abschnitte verteilt. </li></ol> Teil 3: Erstellung des Gehirns Bank <ol><li> Sobald der Abschnitt Abtastfrequenz bestimmt worden ist, ist der nächste Schritt, um zu bestimmen, die Flecken sofort durchgeführt werden. Zum Beispiel, wenn Sie mit Kresylviolett Färbung die Sie aufnehmen 1 / 6 Abschnitte auf einer Folie. Dies wird series 1 sein. Wenn Sie wissen, dass es vielleicht mehrere potenzielle Antikörper, die Sie gerne laufen, aber entweder wollen die Daten sehen, dass Ihre primäre Fleck stellt oder haben einfach nicht die Zeit, die Immunhistochemie durchzuführen, legen Sie die restlichen 5 Reihe von Abschnitten in der Reihenfolge ihres wurden in Vertiefungen mit Antigen zu erhalten (1% Polyvinylpyrrolidon, 50% Ethylenglykol in o.1M PBS, pH 7,4) in Scheiben geschnitten. Die folgende Tabelle bietet einen Stichprobenplan, bestehend aus 1 Rutsche und 1 Platte (Standard 48-Well-Platte) der Abschnitte als Teil eines Gehirns Bank (Tabelle 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Der Abschnitt Abtastfrequenz hier ist 1 / 6. Der erste Abschnitt ist auf einer Folie für Kresylviolett Färbung gelegt und die nächsten 5 Sektionen werden in Antigen platziert zu bewahren. Nummer des Abschnitts 7 wird dann auf der Folie erfasst und Abschnitte 9-12 sind in Antigen platziert zu bewahren. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis die Region von Interesse oder die Sperrung von Gewebe ist erschöpfend geschnitten. </li><li> Der nächste Schritt ist, um abschließend Abschnitt des Blocks von Gewebe. Legen Sie eine kleine Menge Einbettmedium auf dem Futter und lassen Sie es einfrieren. Legen Sie das Futter in den Mikrotom Kopf und abrasieren genug von den gefrorenen Mediums auf eine ebene Oberfläche haben. Entfernen Sie das Futter aus dem Mikrotom Kopf und Stelle flach innerhalb des Kryostaten. Gießen Einbettmedium auf dem Futter und einen festen Platz im Gehirn blockieren mit dem stereotaxically Schnittseite flach auf dem Futter positioniert. Langsam und vollständig eingebettet in das Gehirn Eindeckmedium. Legen Sie das Futter mit dem Gehirn in das Mikrotom Kopf und Abschnitt mit dem vorher festgelegten Parameter für den Abschnitt Sampling-Frequenz. </li><li> Nachdem der Block des Gewebes wurde abschließend geschnitten und Abschnitte sind in Vertiefungen gegeben, decken Sie die Platte mit dem Deckel, wickeln Sie den Deckel mit Parafilm und in einem -20 ° C Gefrierschrank. Melden Sie sich die Gesamtzahl der Abschnitte für jede Serie, die section-Abtastintervall, und die Anzahl der Reihen für jedes Tier übernommen. Dieses Protokoll wird entscheidend sein, den Überblick über nachträgliche Entfernung von Teilen davon abhalten, das Gehirn Bank für zukünftige Immunhistochemie. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse: Systematische Stichproben auf diese Weise eine gängige Praxis in unserem Labor in den letzten 3 Jahren. Wir hatten viel Erfolg Durchführung Immunhistochemie auf Material, das in Antigen gespeichert wurde erhalten drei Jahre nach, ohne eine Verschlechterung des Signals (Abbildung 1) in Scheiben geschnitten wurde. Darüber hinaus als Teil unseres Gehirns Bank haben wir rund 20.000 systematische Abschnitte des nicht-menschlichen angemeldetPrimatengehirn (Abbildung 2) als Teil unserer langfristigen Forschungs-Pläne. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Abbildung 1. Dies ist ein Ausschnitt aus dem okzipitalen Pol des nicht-menschlichen Primaten ist immungefärbt für NeuN zeigt sowohl Schicht VI und interstitielle weißen Substanz Nervenzellen. Dies insbesondere Abschnitt wurde in Antigen gespeichert bewahren bei -20 ° C für einen Zeitraum von 2 Jahren. Maßstab = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="figure2" /> Abbildung 2. Unsere vervet Gehirn Bank besteht heute aus rund 20.000 systematische Abschnitte aus über 30 Affen.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Systematische Stichproben ist eine kostengünstige Methode soll Forschungsmaterial zu maximieren. Diese Strategie der Probenahme ist so konzipiert, mit dem geltenden nationalen unvoreingenommene Stereologie, dass die systematische Stichproben in der gesamten Region erfordert entsprechen. Es ist wichtig, dass die Reihenfolge der Abschnitte für jede Serie beibehalten wird. In unserem Labor haben wir erfolgreich diese Methode für Banken sowohl Hamster und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten verwendet. Bisher haben wir...

<table><tbody><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Scientific Einbettmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

brain-banking: making the most ihrer forschung proben

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bereich von Interesse<sup&gt; 1</sup&gt;. Um dieses Ziel zu erreichen 6-10 systematische Abschnitte sollten untersucht werden, die den gesamten Aufbau. Typischerweise geht mit der Verarbeitung 1 / 5 Abschnitte, die eine erhebliche Menge an Material unbearbeitet lässt. Um das Material zu maximieren, schlagen wir ein kostengünstiges Verfahren zur Konservierung von fixiertem Gewebe als Teil einer langfristigen Lagerung Forschungsplan. Als Gewebe wird in Scheiben geschnitten und für den gewünschten Fleck oder Antikörper, alternative Abschnitte verarbeitet werden, sollten systematisch in Antigen platziert werden erhalten bei -20 ° C für die zukünftige Verarbeitung. Mit 24-Well-Platten, können Abschnitte, um für den späteren Abruf gestellt werden. Mit dieser Methode kann Gewebe gespeichert und verarbeitet werden für die Immunhistochemie im Laufe der Jahre.

Brain-Banking und systematische Entnahme von biologischem Material bildet die Grundlage für unvoreingenommene Stereologie und maximiert das Potenzial von Daten aus jeder Probe erhalten.

Brain-Banking: Making the Most Ihrer Forschung Proben

Die unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der Gesamtzahl der Neuronen (oder anderer Zelltypen) in einem bestimmten Zielbereich1. Um ...

Zur Vorbereitung dieses Verfahrens sollte das Gehirnblock für den Kryostaten vorbereitet und die Schnittentnahmefrequenz festgelegt werden. Anschließend sollten die Antigenkonservierung und die Objektträger vorbereitet werden. Das Gehirnblock sollte auf dem Spannfutter im Inneren des Kryostaten platziert werden.Wenn das Gehirn sicher im Spannabschnitt bei einer voreingestellten Dicke eingebettet ist, sollten systematisch Schnitte angefertigt werden, sodass Serie eins auf einen Objektträger gelegt wird und weitere Serien in Vertiefungen überführt werden, die zuvor mit Antigen-Konservierungsmittel gefüllt wurden. Sobald der Block vollständig aufgebraucht ist, stellen Sie die Platte als Teil Ihrer Gehirnbank in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal.Hallo, ich bin Dr. Shahin Zur, ebenfalls vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mo Petto, Leiter des Labors für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur systematischen Einlagerung von Gehirngewebe unter Erhalt der Antigene.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um das Forschungsmaterial zu maximieren und als Grundlage für die Durchführung einer unvoreingenommenen Theologie. Beginnen wir also. Dieses Protokoll beschreibt, wie man systematisch Gehirngewebe entnimmt, das fixiert, stereotaktisch in einen Zentimeter dicke Schnitte unterteilt und eingefroren wurde.Um diese früheren Schritte im Detail zu sehen, konsultieren Sie unseren kürzlich erschienenen JoVE-Artikel zur Dissektion des nichtmenschlichen primaten Gehirns im stereotaktischen Raum. Der erste Schritt bei der systematischen Stichprobenziehung besteht darin, ein Stichprobenschema zu erstellen, zu entscheiden, wie Sie Ihr Gewebe schneiden, wie Sie diese Schnitte in Serien oder Proben unterteilen und wie Sie diese Proben anordnen und verfolgen werden. Zunächst konsultieren Sie bei Bedarf einen stereotaktischen Atlas.Definieren Sie eindeutig Ihren Bereich von Interesse in rostraler, kaudaler sowie dorsaler und ventraler Ausdehnung und wählen Sie Ihre Schnittebene. Entscheiden Sie anschließend, wie dick Ihre Schnitte sein sollen, und berechnen Sie, wie viele Schnitte Sie aus Ihrem Bereich von Interesse anfertigen können. Beispielsweise ermitteln Sie anhand des stereotaktischen Atlas, dass die gesamte rostrokaudale Ausdehnung Ihres Bereichs etwa drei Millimeter beträgt.Sie entscheiden sich dann, den Kryostaten auf 50 Mikrometer zum Schneiden einzustellen, und erhalten auf diese Weise 60 koronare Schnitte, die die gesamte Region abdecken. Zu diesem Zeitpunkt können Sie Ihr Stichprobenintervall festlegen. Für eine typische, unvoreingenommene theologische Studie benötigen Sie sechs bis zehn systematisch entnommene Schnitte, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.In diesem Beispiel führen 10 gleichmäßig über die gesamte Ausdehnung des Ros-Coddle-Materials verteilte Schnitte zu einem Stichprobenintervall von jeweils einem aus sechs Schnitten. Nachdem Sie diese Schnittstichprobenfrequenz bestimmt haben, sollten Sie als Nächstes festlegen, welche Färbungen Sie durchführen möchten. Unmittelbar danach bringen Sie die Schnitte, die Sie sofort färben möchten, direkt beim Schneiden des Gewebes unverzüglich auf Objektträger auf.Wenn Sie beispielsweise mit Crestal Violet anfärben, nehmen Sie einen von sechs Schnitten auf einem Objektträger auf. Dies wird Serie eins sein. Die verbleibenden Schnitte lagern Sie in Platten mit Antigen-Preserve für zukünftige immunhistochemische Untersuchungen ein.Das hier gezeigte Probenahmeschema besteht aus zwei Objektträgern und einer standardmäßigen 24-Loch-Platte mit Schnitten als Teil einer Gehirnbank, insgesamt sechs Serien für diesen Gewebeklotz. Der nächste Schritt besteht darin, den Gewebeklotz vollständig am Kryostat-Mikrotom zu schneiden. Zunächst müssen Sie Ihre gefrorene Gewebeprobe auf dem sogenannten Chuck befestigen, der in den Mikrotomkopf eingefügt wird und als Unterlage für Ihre Probe dient.Platzieren Sie zunächst eine kleine Menge Einbettmedium auf dem Blockträger und lassen Sie es gefrieren. Setzen Sie den Blockträger in den Mikrotomkopf ein und schneiden Sie so viel vom gefrorenen Medium ab, bis eine ebene Fläche für Ihre Probe entsteht. Nehmen Sie den Blockträger aus dem Mikrotomkopf und platzieren Sie ihn flach in den Kryostaten.Geben Sie das Einbettmedium auf den Objekthalter und drücken Sie es fest an. Legen Sie den Gehirnblock mit der Schnittfläche langsam und vollständig nach unten auf den Objekthalter. Betten Sie das Gehirnstück in das Montagemedium ein.Platzieren Sie den nun mit dem Gehirn bestückten Halter in den Schneidkopf des Mikrotoms, wobei die vorab festgelegte Schnittabtastrate verwendet wird. Nach dem Anfertigen eines Schnitts entweder diesen auf einem Objektträger befestigen oder in eine vorgegebene Serie in der Platte mit Antigenpräservativ geben; dabei unbedingt darauf achten, die Schnitte in der richtigen Reihenfolge zu belassen. Sie schneiden sie so, dass später auf die Gehirnbank zurückgegriffen und eine weitere systematische Probe entnommen werden kann.Nachdem Sie das Gewebe vollständig in Schnitte zerlegt und die Schnitte in die Vertiefungen gelegt haben, verschließen Sie die Platte mit dem Deckel, umwickeln den Deckel mit Parafilm und stellen sie in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Notieren Sie die Gesamtanzahl der Schnitte in jeder Serie, das Schnittabtastraster sowie die Anzahl der Serien pro Tier. Diese Aufzeichnung ist entscheidend, um die Schnitte nachverfolgen zu können, wenn Sie sie später aus der Gehirnbank für zukünftige Experimente entnehmen.Die systematische Probenahme nach dieser Methode ist in unserem Labor eine etablierte Praxis. In den letzten drei Jahren erzielten wir große Erfolge bei der Durchführung von Immunhistochemie an Material, das drei Jahre lang in Antigen-Präservativ gelagert wurde, ohne dass ein Signalverlust auftrat. Darüber hinaus haben wir im Rahmen unserer Gehirnbank nahezu 20.000 systematische Schnitte des nichtmenschlichen Primatengehirns archiviert.Als Teil unserer langfristigen Forschungspläne haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man eine biologische Probe systematisch entnimmt und im Rahmen langfristiger Forschungsarbeiten konserviert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ein detailliertes Protokoll über die Gesamtanzahl der Serien sowie die Gesamtanzahl der Schnitte pro Serie zu führen. Falls ein Schnitt verloren geht oder beschädigt wird, sollte die entsprechende Schnittnummer im Protokoll vermerkt werden, um ein systematisches Probenahmeverfahren aufrechtzuerhalten.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Biology

Biologie

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