Name: Detektion von Protein Ubiquitination (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie zuverlässige Methoden zur Detektion von Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen und in vitro. Diese Protokolle ermöglichen Forschern, die Rolle von Ubiquitin-Ligasen bei Krankheitsmechanismen zu untersuchen.

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California Institute for Regenerative Medicine gewährt RS1-00331-1 und RL1-00682-1 (bis Z. Zhang);; die amerikanische Parkinson Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt RO1 DC006497, RO1 NS057289 und PO1 ES016738 (bis Z. Zhang) unterstützt Disease Association (bis Z. Zhang und YS Choo) und die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research (Z. Zhang).

Detektion von Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen <ol><li> Transfizieren kultivierten Zellen mit Plasmiden, die das Protein exprimieren von Interesse und (Epitop-markierte Version von) Ubiquitin. </li><li> Machen Sie komplette Zell-Lyse-Puffer (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) mit 2 mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid und Protease-Inhibitoren. </li><li> Lyse-Zellen mit 100 ul Zell-Lyse-Puffer pro Platte (6 cm Schale). Wenn eine größere Schüssel verwendet wird, die Lautstärke entsprechend an. Swirl den Teller vorsichtig, damit der Lyse-Puffer auf das gesamte Gebiet der gewachsenen Zellen. </li><li> Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Zelllysate in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Das Röhrchen wird auf einer heißen Platte sofort für 10 min kochen. </li><li> Shear die Zellen mit einem Ultraschall-Gerät. </li><li> Add 900ul Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Inkubieren Proben bei 4 ° C für 30-60 min mit Rotation. </li><li> Spin der verdünnten Proben bei 20.000 xg für 30 min. Übertragen Sie die resultierende Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Achten Sie darauf, das Pellet stören. </li><li> Messen Sie die Protein-Konzentration. </li><li> Bereiten Protein A-oder G-Agarose Bead-konjugierten Antikörper gegen das Zielprotein in einem kompatiblen Puffer (50% iger Aufschwemmung). Schneiden Sie das schmale Ende eines P-200 Pipettenspitze und Transfer 14-20 ul von Harz zu 500-1.500 ug vorbereitet Zelllysaten für die Immunpräzipitation. Für Zellen mit hoher Transfektionseffizienz wird 500 ug genug sein. Für Zellen mit niedrigen Transfektionseffizienz kann mehr Protein benötigt wird. </li><li> Inkubieren Sie die Zelllysat-Bead-Gemisch bei 4 ° C über Nacht mit einer Rotation. </li><li> Spin down die Perlen bei 5000 xg für 5 min. Den Überstand aspirieren. Waschen Sie den Harz mit dem Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) zweimal. </li><li> Drehen Sie die Perlen für ein letztes Mal bei 20.000 xg für 30 sek. Saugen Sie die restlichen Waschpuffer und kochen das Harz mit 2X SDS-Ladepuffer. </li><li> Tragen Sie die Proben auf eine SDS-PAGE-Gel für Immunoblotting-Analyse. </li><li> Detect Ubiquitin und das Zielprotein mit entsprechenden Antikörpern. Für Immunoblot wir in der Regel erkennen Ubiquitin zuerst. Die Membran wird dann verwendet, um das Protein ausgefällt zu erkennen. </li></ol> Erkennung von Ubiquitin auf Zielprotein durch In-vitro-Assay Ubiquitinierung <ol><li> Machen 5X Ubiquitinierung Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Lagern Sie sie in kleinen Portionen bei -20 ° C bis zu 6 Monate. Einige Protokolle auch hinzufügen, Kreatinphosphat und Kreatinkinase in den Puffer für die ATP-Regeneration 1,2. </li><li> Für jede Reaktion vorzubereiten einer Mischung mit folgendem Inhalt: <table border="1"><tbody><tr><td> 8 ul </td><td> 5X Ubiquitinierung Puffer </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> Ubiquitinierung E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> Ubiquitinierung E2 </td></tr><tr><td> 0,5 ug </td><td> Ubiquitin </td></tr><tr><td> 0,5 ug </td><td> Protein von Interesse </td></tr><tr><td></td><td> Wasser auf 40 ul Gesamtvolumen </td></tr></tbody></table> Als Kontrollen vorbereiten ähnliche Reaktionen in Abwesenheit von entweder E1, E2, oder Ubiquitin. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 1 Stunde oder länger. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer und kochen die Probe für 10 min. </li><li> Tragen Sie die Proben auf SDS-PAGE-Gel für Immunoblotting-Analyse. </li><li> Detect Ubiquitin und das Zielprotein mit entsprechenden Antikörpern. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Präsentation haben wir zum ersten Mal beschrieben Schritte, die Erkennung Ubiquitin Änderung auf ein Protein von Interesse in Säugetierzellen zu erlauben. Um Ubiquitinierung spezifisch nachzuweisen auf das Protein von Interesse, nicht auf nicht-kovalent interagierende Proteine, verwendeten wir eine stringente Bedingung für Zell-Lyse, Immunpräzipitation und Waschen 1,3. Ubiquitination, durch Immunpräzipitation von Zielprotein in solch rauen Bedingungen durch Anti-Ubiquitin-Immunoblot gefolgt erkannt,...

detektion von protein ubiquitination

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinierung, die kovalente Bindung des Polypeptids Ubiquitin an Proteine ​​Ziel, ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Dazu gehören Ubiquitin-aktivierende Enzym E1, Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 und E3-Ubiquitin-Ligase. Im Gegensatz zu E1 und E2, E3 Ubiquitin-Ligasen Display Substratspezifität. Auf der anderen Seite haben zahlreiche deubiquitylating Enzyme Rollen in der Verarbeitung polyubiquitinierte Proteine. Ubiquitination kann zu einer Veränderung der Stabilität des Proteins, zelluläre Lokalisation und biologischen Aktivität führen. Mutationen von Genen in die Ubiquitinierung / deubiquitination Weg oder verändert Ubiquitin-System-Funktion beteiligt sind, mit vielen verschiedenen Krankheiten wie verschiedene Arten von Krebs, Neurodegeneration und metabolischen Erkrankungen. Der Nachweis von veränderten oder normale Ubiquitinierung von Target-Proteinen kann zu einem besseren Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen<em&gt; In vivo</em&gt; Und Reagenzgläser<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Diese Protokolle sind auch nützlich, um anderen Ubiquitin-ähnlichen kleinen Molekülen Modifikation wie sumolyation und neddylation erkennen.

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen<em&gt; In vivo</em&gt; Und Reagenzgläser<em&gt; In-vitro-</em&gt;.

Detektion von Protein Ubiquitination

Die Ubiquitinierung, die kovalente Anheftung des Polypeptids Ubiquitin an Zielproteine, ist eine zentrale posttranslationale Modifikation, die durch einen Satz von ...

Hallo, ich bin Chu aus dem Labor von Jo am Birmingham Institute for Medical Research. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Detektion einer neuartigen Proteinmodifikation. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Parkin oder UBI drei Ligasen und ihr Substrat zu untersuchen.Beginnen wir also. Um mit diesem Protokoll zu starten, transfizieren Sie Zellen mit Plasmiden, die sowohl das Zielprotein als auch eine mit einem Epitop markierte Version von Ubiquitin exprimieren. Lassen Sie die Zellen etwa 40 Stunden lang wachsen, bringen Sie sie dann auf die Laborbank, saugen Sie das flüssige Medium ab und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Lysieren Sie die Zellen anschließend, indem Sie 100 Mikroliter Zelllysepuffer, der 2 % SDS pro sechszölligen Platte enthält, hinzufügen. Schwenken Sie jede Platte, damit der Puffer die Zellen vollständig bedeckt. Verwenden Sie danach einen Zellabstreifer, um die lysierten Zellen zu sammeln, und überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.Stellen Sie das Röhrchen unmittelbar auf einen Heizblock und erhitzen Sie die lysierten Zellen 10 Minuten lang, um die Proteine weiter zu denaturieren und aufzulösen. Verwenden Sie nach dem Erhitzen ein Beschallungsgerät, um die Zellen und ihre DNA zu fragmentieren. Dieser Schritt verringert die Viskosität der Zelllysate.Nach der Beschallung 900 Mikroliter Verdünnungspuffer hinzufügen und die Proben 30 bis 60 Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Nach der Inkubation die verdünnten Proben bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang bei 20.000 Gs zentrifugieren, um lösliche Proteine zu gewinnen. Anschließend vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, das Überstand in ein neues Einor überführen.Zuletzt messen Sie die Proteinkonzentration im Überstand mit einer Methode wie dem hier verwendeten modifizierten Lowry-Assay. Nun sind Sie bereit, mittels Immunpräzipitation Ihr Protein von Interesse von den anderen Proteinen im Überstand zu isolieren. Der erste Schritt der Immunpräzipitation besteht darin, die mit Antikörpern gegen Ihr Protein von Interesse konjugierten Kügelchen vorzubereiten.Sie können handelsübliche Antikörper-gekoppelte Kügelchen verwenden oder Ihren eigenen immobilisierten Antikörper mithilfe von Vernetzern herstellen. Bereiten Sie, wie hier gezeigt, den immobilisierten Antikörper in einem kompatiblen Puffer vor, um eine 50%ige Suspension zur Durchführung der Amino-Fällungsreaktion herzustellen. Schneiden Sie das schmale Ende einer P-200-Pipettenspitze ab und übertragen Sie 14 bis 20 Mikroliter Harz auf 500 bis 1500 Mikrogramm der hergestellten Zelllysate.Passen Sie die Menge des verwendeten Zelllysats an die Transfektionseffizienz Ihrer Zellen an. Lassen Sie das Gemisch aus Zelllysat und Kügelchen über Nacht bei vier Grad Celsius rotieren. Während dieser Zeit bindet der mit den Kügelchen konjugierte Antikörper spezifisch Ihr Zielprotein.Am nächsten Tag die Kügelchen bei 5.000 Gs fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um das Protein zu pelletieren. Nachdem das Protein nun an die Kügelchen gebunden ist, den Überstand abpipettieren und das Harz zweimal mit dem Puffer mit hohem Salzgehalt waschen, indem jeweils fünf Minuten bei 5.000 Gs zentrifugiert wird. Anschließend die Kügelchen bei vier Grad Celsius ein letztes Mal 30 Sekunden bei 20.000 Gs zentrifugieren und den restlichen Waschpuffer abpipettieren.Nachdem Sie nun Ihr Protein von Interesse gereinigt haben, ist es an der Zeit, das Protein auf einem SDS-Page-Gel laufen zu lassen. Erhitzen Sie das Harz mit der zweifachen Menge SDS-Lade-Puffer zum Denaturieren der Proteine und zur Verleihung einer negativen Ladung. Laden Sie Ihre vorbereiteten Proben auf ein SDS-Page-Gel auf.Übertragen Sie die Proteine mithilfe des im Labor üblichen Protokolls für die Westernblot-Analyse auf eine Membran. Inkubieren Sie anschließend den Blot mit Antikörpern gegen Ubiquitin oder das Zielprotein und entwickeln Sie die Membran auf Film, um ubiquitinierte Proteine sichtbar zu machen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Proteinuxbiquitinierung in kultivierten Zellen nachweisen kann.Derselbe Versuch kann in vitro in einem Reagenzglas durchgeführt werden. Die Reaktion hat ein Gesamtvolumen von 40 µL und kann in einem PCR-Röhrchen durchgeführt werden. Bereiten Sie jede Reaktion wie folgt vor.Fügen Sie zuerst den fünffachen UBIQUITINATION-Puffer hinzu, der ein TP und das Reduktionsmittel DIO drei etol, DTT, enthält. Danach fügen Sie die Ubiquitinierungsenzyme E eins und E zwei hinzu. Geben Sie die Substrate, Ubiquitin und das Zielprotein, dazu.Bringen Sie das Gesamtvolumen der Reaktion mit Wasser auf 40 Mikroliter, um Kontrollen herzustellen. Bereiten Sie ähnliche Reaktionen in Abwesenheit von Ubiquitin E1, E2 oder dem Zielprotein vor. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde oder länger.Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer. Erhitzen Sie die Probe 10 Minuten lang zum Kochen. Laden Sie die Proben auf ein SDS-PAGE-Gel auf und führen Sie die Immunoblot-Analyse wie bei dem In-vivo-Experiment durch.Hier ist ein Beispielergebnis dieses Protokolls. Parkinson. Ein mit der Parkinson-Krankheit assoziiertes Protein ist hier das Protein von Interesse. Und Bahn vier zeigt ubiquitinierten Parin.Die typischen starken Banden oder Längenmarker sind oberhalb des Molekulargewichts des unmodifizierten Parin dargestellt, um mehrere experimentelle Bedingungen zu vergleichen, sowie die zellulären Expressionsniveaus des unmodifizierten Zielproteins Parin und Ubiquitin, die ebenfalls bei jeder Bedingung berücksichtigt werden sollten. Dies ist ein Beispiel für eine in-vitro-Parin-Ubiquitinierung: affinitätsgereinigtes Parin wurde in einem in-vitro-Ubiquitinierungsassay in Gegenwart von rekombinantem E1, E2 und Biotin-markiertem Ubiquitin getestet; biotinyliertes, ubiquitiniertes Parin wurde mittels Streptavidin-HRP nachgewiesen. Das ubiquitinierte Parin erscheint als Längenmarker oberhalb des Molekulargewichts des unmodifizierten Parin. Die Läden eins, zwei und vier sind Kontrollen, die kein Ubiquitin, E1, E2 bzw. Parkin enthalten.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Proteine nach einer Impfung in Kulturzellen nachweist. Bei dieser Methode ist es wichtig, das Zelllysat unter stark denaturierenden Bedingungen herzustellen und das Zelllysat vor dem Hinzufügen der markierten Antikörper zu verdünnen. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Extraktion und Reinigung von ubiquitinylierten Peptiden, die Reste von Diglycin-Peptiden aus einer komplexen Peptidmischung enthalten. Das vorgestellte Verfahren kann dabei helfen, ursprüngliche Ubiquitinierungsstellen im Protein zu identifizieren.

Immunaffinitätsbasierte Extraktion von ubiquitinylierten Peptiden: Eine Technik zur selektiven Extraktion von Ubiquitin-markierten Peptiden aus gereinigten Peptidfraktionen

Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit Sondentechnologien, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen der traditionellen chinesischen Medizin und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Screening von Wirkstoffen der traditionellen chinesischen Medizin zur Hemmung der UCHL3-Aktivität basierend auf molekularer Docking- und Deubiquitinierungsenzymsondentechnologie

Ubiquitination ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der Substratprotein-Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse von Ubiquitinationsniveaus. Die Proteinüberexpression in HEK293T Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion induziert, und ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Erfahren Sie zuverlässige Methoden zur Detektion von Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen und in vitro. Diese Protokolle ermöglichen Forschern, die Rolle von Ubiquitin-Ligasen bei Krankheitsmechanismen zu untersuchen.

Detektion von Protein Ubiquitination

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