Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

Wir stellen ein System zur Kultivierung von neurogenen Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems vor, während diese sich zu reifen Neuronen und Gliazellen entwickeln und differenzieren. Das Verfahren beginnt mit der Isolierung von vier Gehirnen aus E16-Rattenembryonen, die anschließend mit Propan digeriert werden. Das Gewebe wird zu einer Einzelzell-Suspension dissoziiert, filtriert, gezählt und in eine Sechs-

Zellkulturen in der Mehrfachbrille werden ein- bis dreimal täglich vorsichtig resuspendiert, um die Bildung von Aggregaten zu ermöglichen. Anschließend werden die Aggregate gesammelt und durch ein 200-Mikrometer-Sieb filtriert, wobei kleine Zellklumpen und Zelltrümmer durch Waschen entfernt werden. Schließlich werden die Aggregate gezählt und auf mit Matrigel beschichteten Deckgläsern ausplattiert.

Hallo, ich bin Coto aus dem Labor von Dr. John L am Department für Veterinär-integrierte Biowissenschaften an der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Gehirnaggregatkulturen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Sicherheitsstufe-drei-Labor, um die Endozyten-Linie, Zellentwicklung und beschleunigte Wechselwirkungen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Bevor Sie starten, haben Sie auf dem Pult sterilisierte Werkzeuge, 70 % Ethanol, ein Unterlagepad zum Arbeiten und 10 cm große Petrischalen für die Dissektion bereit. Medium auf Eis.

Bereiten Sie im Abzug ein Stereomikroskop mit einer Eisplattform und mehreren 10-Zentimeter-Schalen mit Dissektionsmedium, die ebenfalls auf Eis stehen, vor. Stellen Sie abschließend die Lösungen her, die Sie verwenden werden, und erwärmen Sie das Plattierungsmedium in einem Wasserbad auf 37 Grad. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Embryonen vom embryonalen Tag 16 (E 16) von einer Sprague-Dawley-Ratte gewinnen.

Töten Sie zunächst ein trächtiges Weibchen gemäß einem von Ihrem institutionellen Tierversuchsausschuss genehmigten Verfahren. Legen Sie die getötete Ratte auf eine Windelunterlage und besprühen Sie den Bauch mit Alkohol, um ihn zu reinigen. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Bauchhaut einzuklemmen, und mit der anderen Hand eine Schere, um lediglich die Haut zu durchtrennen. Spreizen Sie die Haut auseinander und verwenden Sie ein weiteres Paar sterilisierter Pinzette und Schere, um durch die Muskelschicht zu schneiden.

Als Nächstes entfernen Sie den Uterus und überführen ihn in eine 10 cm große Petrischale, die kaltes Dissektionsmedium enthält. Der nächste Schritt erfolgt im Sicherheitswerkbank unter Verwendung mikrochirurgischer Scheren. Entfernen Sie vorsichtig jedes Embryo aus dem Uterus.

Jetzt ist es an der Zeit, die Gewebegewinnung durchzuführen und zu beginnen. Arbeiten Sie mit den embryonalen Gehirnen. Entnehmen Sie das Gehirn aus jedem Embryo und legen Sie die freigelegten Gehirne in eine saubere 10 cm-Schale mit Dissektionsmedium auf einer Eisplatte. Unter dem Dissektionsmikroskop vervollständigen Sie die Präparation der Gehirne.

Entfernen Sie die Abschnitte des Mittelhirns und des Hinterhirns. Verwenden Sie feine Pinzette, um die Meningen zu entfernen, und überführen Sie das verbleibende Vorderhirn in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das Dissektionsmedium enthält. Nun ist das Gewebe für den nächsten Schritt bereit.

Enzymatische Zell-Dissociation. Bereiten Sie kurz vor Beginn der Verdauung frische Lösungen aus Propan und Trypsin-Inhibitor-Filter vor. Sterilisieren Sie diese und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad.

Entfernen Sie überschüssiges Medium von den dissezierten Gehirnen. Geben Sie anschließend vier Milliliter der hergestellten Propan-Digestionslösung in Ihr 50-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen genau fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Wenn die Zeit abgelaufen ist, entfernen Sie mit einer Pipette die Propanlösung. Geben Sie anschließend fünf Milliliter frisch zubereitete Trypsininhibitorlösung hinzu und stellen Sie das Reagenzglas für zwei bis drei weitere Minuten zurück in das 37 Grad Celsius warme Wasserbad. Wenn die Zeit abgelaufen ist, entfernen Sie die Trypsininhibitorlösung.

Wiederholen Sie die Inkubation mit Trypsin-Inhibitor-Lösung noch dreimal. Nachdem Sie die Trypsin-Inhibitor-Lösung zum letzten Mal entfernt haben, geben Sie 20 Milliliter warmes Plating-Medium pm in Ihr Röhrchen.

Jetzt ist es an der Zeit, die Zellen zu resuspendieren und zu waschen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer 10-Milliliter-Pipette, bis alle Klumpen verschwunden sind, ungefähr 20 bis 30 Mal. Anschließend zentrifugieren Sie sie sieben Minuten lang bei hundert ×g.

Zu diesem Zeitpunkt sollten Ihre Zellen gut voneinander getrennt sein. Nach sieben Minuten entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in 10 Milliliter Plattierungsmedium, um die Zellen zu waschen.

Danach erneut abzentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Waschung sowie Zentrifugation wiederholen. Schritt nach der zweiten Wäsche.

Suspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter Aggregatkulturmedium und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb. Zählen Sie abschließend die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer.

Und nun können Sie den dissoziierten Gehirnzellen erlauben, Aggregate zu bilden. Nach der Zellzählung suspendieren Sie die dissoziierten Zellen in Kulturmedium für Aggregate mit einer Dichte von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht beschichteten 6-Loch-Platte.

Die Zellen werden drei Nächte lang jeden Tag vorsichtig resuspendiert. Einmal mithilfe einer P1000-Pipette, beginnen die Zellen am Tag der Aggregatplattierung, Aggregate zu bilden. Nachdem die Zellen drei Nächte lang gewachsen sind, werden die Zellen erneut vorsichtig resuspendiert und die Suspension durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen filtriert.

Lassen Sie die Aggregate etwa drei bis fünf Minuten lang auf den Boden des Röhrchens sedimentieren. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, geben Sie Medium hinzu, resuspendieren Sie die Aggregate vorsichtig und lassen Sie sie erneut sedimentieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals.

Um tote Zellen, einzelne Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, überprüfen Sie mithilfe des Mikroskops, ob die Überstände noch nicht aggregierte Zellen und Trümmer enthalten. Nachdem Sie die Aggregate gründlich gewaschen haben, resuspendieren Sie sie vorsichtig im gleichen Medium und zählen Sie die Aggregate, um ihre Konzentration zu bestimmen. Anschließend stellen Sie die Dichte der Aggregate auf etwa 25 bis 30 Aggregate pro 50 Mikroliter ein.

Jetzt ist es an der Zeit, Deckgläser mit Aggregaten zu besiedeln. Überführen Sie Aliquote von je 1000 Mikroliter der Aggregatsuspension in 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen, da sich die Aggregate tendenziell am Röhrchenboden absetzen. Es ist daher entscheidend, mehrere Röhrchen mit der Aggregatsuspension für die Aussaat vorzubereiten. Die in diesem Schritt verwendeten Deckgläser sind mit dem Zellkultursubstrat Matrigel beschichtet, das durch eine Übernacht-Inkubation bei 37 Grad Celsius aufgebracht wurde.

Nachdem Sie Alec-Watt der aggregierten Suspension hergestellt haben, nehmen Sie die Kulturplatte mit den mit Matrigel beschichteten Deckgläsern aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Lösung von jedem. Waschen Sie die Deckgläser mit warmer PBS und anschließend mit DD H2O.

Sie sind nun bereit für die Aussaat von Aggregaten, um die Deckgläser mit Aggregaten zu besiedeln. Drehen Sie das Reagenzglas mit der Aggregatsuspension um, um die Aggregate zu vermischen und gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Aggregatsuspension in die Mitte jedes Deckglases.

Stellen Sie die Platte vorsichtig zurück in den Inkubator, ohne weitere Störungen zuzulassen, damit sich die Aggregate gleichmäßig auf dem Deckglas anheften können. Die Dichte der Aggregate ist entscheidend; wenn die Aggregate zu dicht beieinander liegen oder die Besiedlungsdichte hoch ist, neigen sie dazu, vier bis sechs Stunden nach der initialen Ansiedlung miteinander zu verschmelzen. Geben Sie 500 Mikroliter Kulturmedium in jedes Loch.

Um die Aggregatkultur aufrechtzuerhalten, wechseln Sie alle drei bis vier Tage die Hälfte des Kulturmediums. Beim Mediumwechsel fügen Sie das frische Medium entlang der Seitenwand der Vertiefung hinzu, um die Aggregate nicht zu stören. Einige Stunden, nachdem sich die Aggregate auf dem Deckglas angeheftet haben, können Neuritauswüchse aus den Aggregaten beobachtet werden.

Axone wachsen in den ersten zwei Wochen schnell und bilden reichlich Verbindungen zwischen den Aggregaten aus. Ggl-Progenitoren wandern radial aus den Aggregaten aus und differenzieren sich im Laufe der Zeit in Astrozyten und reife Oligodendrozyten. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man CS-Aggregate kultiviert.

Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kapazität korrekt anzugeben und sicherzustellen, dass das Aggregat gleichmäßig verteilt ist. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.