Name: Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregatkulturen zur Untersuchung der Entwicklung von Neuronen und Gliazellen. Diese Methode ermöglicht die Differenzierung multipotenter Vorläuferzellen in kontrollierter Umgebung.

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Diese Studie wurde teilweise durch eine Anschubfinanzierung von der Texas A &amp; M University finanziert

Vorbereitung vor der Dissektion Chirurgische Instrumente: sterilisieren alle Dissektion Schere und Pinzette von Autoklaven Deckglas Reinigung: <ol><li> Weichen Sie alle Deckgläser (15mm im Durchmesser für 24-Well-Platte) in 1L Gras Becherglas in 33% HCl für mindestens 24 h </li><li> Waschen mit fließendem Wasser für 10 min mit gelegentlichen schütteln, um alle verbleibenden HCl zu entfernen </li><li> Spülen mit Millipore-Wasser </li><li> Ablassen von Wasser aus </li><li> Soak Deckgläser in 95-98% Ethanol </li><li> Transfer Deckgläser zu einem sauberen Tuch auf einem flachen Teller und an der Luft trocknen die Deckgläser </li><li> Transfer Deckgläschen in ein Becherglas, mit Alufolie abdecken und Autoklaven Hinweis: Deckgläser kann in diesem Stadium gespeichert werden </li><li> Legen Sie individuelle Deckglas in die Kultur-Platten. Bereit für die Beschichtung </li></ol> Deckglas-Beschichtung: <ol><li> Verdünnen Sie 100 x Lager von Poly-D-Lysin (PDL, 10 mg / ml in 0,5% Rinderserumalbumin in PBS, als Aliquots bei -20 ° C gelagert) mit PBS und Filter-sterilisiert (0,22 um) </li><li> Coat Deckgläser mit 1 x PDL-Lösung (~ 0,15 ml / cm 2) für 2 h bei 37 ° C im Brutschrank </li><li> Entfernen PDL-Lösung und 3 x waschen mit sterilem ddH 2 O und trocken Deckgläser komplett </li></ol> Hinweis: Coat genug Deckgläser / Platten für jede Sektion. PDL-beschichtete Deckgläser kann für ein paar Wochen bei 4 ° C gelagert werden Medien und Lösungen Dissection (DM): Verwenden Sie sterile eiskalt Hanks Balanced Salt Solution (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14175) ergänzt mit 10 mM HEPES (Invitrogen 15630). Aggregate Kulturmedien: Die DMEM/NBB27 Medium enthält DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM Natriumpyruvat, 0,75 Glutamax, 60μg/ml N-Acetylcystein, 5 ug / ml Insulin, 10nm d-Biotin und 1% Penicillin / Streptomycin. Um 100 ml des Aggregats Kulturmedium mischen 50 ml DMEM (w / o Pyruvat / Glutamin, Invitrogen 11960), 50 ml Neurobasal Medium (Invitrogen 211034), 375 ul Glutamax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg Natrium-Pyruvat (Sigma p2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17504), 6,3 mg N-Acetylcystein (Sigma A8199), 1 ml Sato Lager (100 x Lager, siehe unten), 25 ul d-Biotin Lager (4000 x Lager, 40 uM in PBS als Aliquots bei -20 ° C. Sigma B4639), 100 ul von Insulin (1000 x Lager, 5 mg / ml in 0,01 N HCl als Aliquots bei -20 ° C gelagert, Sigma 16634) und 1 ml Penicillin gespeichert / Streptomycin (100 x Lager, Invitrogen 15140), Filter-sterilisiert und bei 4 ° C. Sato 100 x Stammlösung: Zu 40 ml der zu machen: Mix 40 ml Neurobasal mit 400 mg apo-Transferrin (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 ul von Progesteron (25 mg / ml Ethanol, als gespeicherte Aliquots bei -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg Putrescin (Sigma P7505) und 40 ul von Natriumselenit (30 nM in PBS, als Aliquots bei -20 ° C gelagert, Sigma S5261). Filter sterilisieren Sato Stammlösung und speichern als Aliquots bei -20 ° C. Neuron plating Medium (PM): Neurobasalmedium, 2% B27, 2 mM Glutamin (100x Lager, Aliquots bei -20 ° C, Invitrogen 25030 gespeichert), 25 um Glutaminsäure (100 Aktien, bei -20 ° C gelagert) und 1% Penicillin / Streptomycin. Neuron Kulturmedium (CM): Neurobasalmedium, 2% B27, 2 mM Glutamin (100x Lager, Aliquots bei -20 ° C gelagert) und 1% Penicillin / Streptomycin. 5-FdU Lager: 100x Lager, 1 mM 5-Fluor-2&#39;-desoxyuridin (Sigma F0503) and1mM Uridin (Sigma U3003) in Neurobasalmedium. Filter sterilisiert und gelagert als Aliquots bei -20 ° C. Papainverdau Lösung (make frisch vor Dissektion): <ol><li> Lösen 3,2 mg L-Cystein (Sigma C-7352) in 4ml DM </li><li> Der pH-Wert auf etwa 7,4 mit 1N NaOH (Test auf pH-Teststreifen) und im Wasserbad bei 37 ° C Hinweis: Führen Sie den nächsten Schritt nach rechts, bevor Gewebe Verdauung (siehe unten). </li><li> Add Papain, um eine endgültige Konzentration von 20 Einheiten / ml </li><li> Filter sterilisieren (0,22 mm), und in Wasserbad bei 37 ° C </li></ol> Trypsin-Inhibitor-Lösung (make frisch vor Dissektion): <ol><li> Lösen Sie 0,2 g Trypsin-Inhibitor (Sigma T7295) in 20ml DM </li><li> Überprüfen Sie pH und pH-Wert auf ~ 7,4 mit 1 N NaOH </li><li> Filter sterilisieren und in Wasserbad bei 37 ° C </li></ol> Brain-Dissection Setup: <ul><li> Sterilisiert Zangen und Scheren </li><li> 70% Ethanol </li><li> Saubere Seidenpapier und DIAPer Pad auf der Bank </li><li> 10cm Petrischalen mit eiskaltem DM für Gebärmutter und Fötus auf der Bank </li><li> Ice Plattform Dissektionsmikroskop </li><li> 2-3 6cm Gerichte mit DM auf Eis </li><li> Warm PM in einem 37 ° C Wasserbad </li></ul><ol><li> Euthanize eine schwangere Sprague-Dawley Ratten (E16) nach einem Verfahren von Ihrem Institutional Animal Care genehmigt und uns Committee (IACUC) </li><li> Legen Sie die Ratte auf die Windel-Pad und spay Alkohol auf die Bauchregion </li><li> Sie mit einer Pinzette auf die Bauchhaut und eine Schere zu halten, um eine V-Form Schnitt schneiden nur die Haut </li><li> Gespreizten der Haut und verwenden Sie ein anderes sterilisiert Pinzette und Schere, um durch die Muskelschicht geschnitten </li><li> Entpacken Sie die Kette der Embryosäcke und überführen sie in eine 10 cm Schüssel mit eiskaltem DM </li><li> Mit einer Mikrodissektion Schere, vorsichtig jedem Embryo aus dem Sack und das Gehirn von jedem Embryo, und legen Sie befreite Gehirn in eine saubere Schüssel mit 10cm DM auf ein Eis-Plattform </li><li> In einem Laminar Kapuze und unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Mittelhirn / Hinterhirn Abschnitte, und verwenden Sie feinen Pinzette Meningen zu entfernen, und übertragen Sie die gereinigt Kortex / Hippocampus, eine neue 6cm Schale mit DM auf einen Eisbeutel Hinweis: In dieser Phase wird das Gewebe bereit für die Enzym-Verdauung. </li><li> Machen Papain und Trypsin-Inhibitor-Lösung und Filter sterilisieren </li><li> Entfernen Sie überschüssiges DM aus Rinden / hippocampi </li><li> Add 4ml der vorbereiteten Papainverdau Lösung </li><li> Übertragen Sie alle Inhalte auf einen 50ml Tube und Ort der Falcon-Röhrchen in ein Wasserbad bei 37 ° C für genau 5 min </li><li> Entfernen Papain-Lösung mit Pipette </li><li> Add 5ml Trypsin-Inhibitor-Lösung, wirbeln die Röhre, und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2-3 min </li><li> Entfernen Trypsin-Inhibitor-Lösung </li><li> Wiederholen Sie Schritt 13 und 14 dreimal </li><li> Fügen Sie 20ml warmen PM </li><li> Verreiben, bis alle Klümpchen verschwunden sind (~ 20-30 mal) </li><li> Zentrifuge bei 100xg für 7min </li><li> Das Pellet in 10ml PM und waschen zweimal durch Zentrifugation </li><li> Das Pellet in 10ml PM für regelmäßige Neuron Kulturen oder in NBB27/DMEM für aggregierte Kulturen </li><li> Pass die Zellen durch ein 70μm-Zelle Siebe </li><li> Graf lebenden Zellen </li><li> Gehen Sie zu aggregieren Kulturen wie unten beschrieben oder Platte die Zellen für die regelmäßige Neuronenkulturen Hinweis: Bei diesem Schritt, hoch angereichertes Neuron Kulturen können durch Ausplattieren der dissoziierten Zellen auf PDL-Beschichtung Platten bei einer Dichte von 200-640 Zellen / mm 2 je nach Zweck der Experimente erreicht werden. Nachdem die Zellen gebunden haben (~ 2-4h), ersetzen Medium mit warmen Uhr. Wenn Kultivierung für längere Zeit, am Tag 4, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit warmem CM. Für hochreine neuronalen Kulturen, mitotische Inhibitor 5-FdU (Endkonzentration 10 nM) sind DIV2 hinzugefügt werden, um nicht-neuronalen Zell-Proliferation (dh während DIV2-3) zu hemmen. Nach der Erholung in CM für 2 Tage werden die Zellen Puls wieder mit 5-FdU für weitere 2 Tage (DIV 6-7) durch eine vollständige Mediumwechsel behandelt, gefolgt. Danach ersetzen die Hälfte des Mediums mit frischem, warmen CM alle 3-4 Tage. Neuronen sind für bis zu 4 Wochen lebensfähig. </li></ol> Aggregates Vorbereitung und Beschichtung <ol><li> Suspend dissoziierten Zellen in NBB27/DMEM Medium mit 1x Sato, 10ng/ml CNTF und 10 um Forskolin bei einer Dichte von 2x10 6 Zellen / ml </li><li> Transfer-2ml Zellsuspension in jede Vertiefung einer unbeschichteten 6-Well-Platte </li><li> Kultur für 3 Nächte. Jeder Tag, sanft resuspendieren die Zellen einmal mit einem P1000 Pipetman Hinweis: Die Zellen beginnen zu Aggregaten (Abbildung 1). </li><li> Am Tag vor der gesamten Beschichtung, beschichten Platte / Deckgläser mit Matrigel: <ul><li> Verdünnen Lager Matrigel (growth factor reduziert, BD Biosciences 354230) 1:20 mit kaltem DMEM auf Eis Hinweis: Matrigel Aliquots sollten pro Hersteller-Protokoll vorbereitet werden. Alle Tipps, sollte Eppendorf-Röhrchen und Lösungen für die Herstellung Aliquots der Bestand sich kalt an Matrigel Polymerisation zu vermeiden. Aliquots von Matrigel werden bei -80 ° C gehalten und wieder aufgetaut bei 4 ° C. </li><li> Coat zuvor PDL-beschichtete Deckgläser mit 300μl/well der verdünnten Lösung Matrigel über Nacht in einem 37 ° C Inkubator </li><li> Mit warmem PBS, dann waschen Teller mit warmen sterilen ddH 2 O und lassen Sie die Platten in den Inkubator. </li></ul></li><li> 3 Tage nach der Aggregatbildung, sanft die Zellen wieder und Sieb die Suspension durch ein 200 um Maschenweite in ein 50ml Falcon-Röhrchen. Lassen Aggregate zum Boden des Röhrchens durch die Schwerkraft (~ 3-5min) begleichen </li><li> Entfernen Sie vorsichtig überstehende </li><li> Add Medium vorsichtig resuspendieren der Aggregate und lassen Sie sie wieder absetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, um abgestorbene Zellen, einzelne Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Verwenden Mikroskop zu prüfen, ob der Überstand enthalten noch nicht aggregierten Zellen und Fremdkörpergefühls </li><li> Vorsichtig resuspendieren die Aggregate im gleichen NBB27/DMEM Medium (Abbildung 1) und zählen Aggregate </li><li> Passen Sie die Dichte der Aggregate zu etwa 25-30 aggreggats/50ul </li><li> Transfer-Aliquots (500-1000μl) des Aggregats Suspension 2ml Eppendorf-Röhrchen für die Beschichtung Hinweis: Da Aggregate zu beruhigen, um den Boden der Rohre neigen, ist es wichtig, mehrere Rohre des Aggregats Aufhängung für die Beschichtung zu machen. Vorsichtig resuspendieren die Aggregate häufig vor der Aussaat sie auf beschichtete Deckgläser oder Kultur Platten ähnliche Anzahl von Aggregaten auf jeder Deckglas vernickelt gewährleisten. </li><li> Nehmen Sie die Kultur Platte mit Matrigel-beschichteten Deckgläser Inkubator. Remove-Lösung aus jeder Vertiefung, waschen Sie die Deckgläser mit warmem PBS und ddH 2 O, und dann kurz antrocknen. Sie sind nun für insgesamt Aussaat bereit </li><li> Invert ein Röhrchen mit insgesamt Aufhängung, damit sie gleichmäßig vor der Aussaat verteilt werden. Legen Sie 50 ul der aggregierten Suspension in die Mitte jedes Deckglas, und legte sanft die Platte zurück zum Inkubator ohne weitere Störung zu ermöglichen Aggregate gleichmäßig Wert auf das Deckglas Hinweis: Die Dichte der Aggregate ist von entscheidender Bedeutung. Wenn Aggregate ausgesät sind zu nahe beieinander oder wenn die Aussaatdichte hoch ist, neigen sie dazu, miteinander verschmelzen, wie sie wachsen. </li><li> Fügen Sie zusätzliche DMEM/NBB27medium (500 ul) in jede Vertiefung 4-6 h später oder am nächsten Morgen früh </li><li> Um die Aggregat-Kultur, die Hälfte ändern das Medium alle 3-4 Tage. Wenn Veränderungen mittel, darauf achten, nicht zu den Aggregaten zu stören und dies wird durch Zugabe von Medium sanft entlang der Seitenwand des gut gemacht. Hinweis: Nur wenige Stunden nach der Aggregate an die Platte, Neuritenwachstum von der Aggregate beobachtet werden können. Axone wachsen schnell in den ersten zwei Wochen und bilden reichlich Verbindungen zwischen den Aggregaten (Abbildung 2). Gliazellen Vorfahren radial wandern aus der Aggregate und differenzieren im Laufe der Zeit in Astrozyten und Oligodendrozyten reifen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Phase kontrastreiche Bilder von Zellen bilden Aggregate an verschiedenen Tagen und Aggregate nach dem Waschen. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Phase kontrastreiche Bilder eines Aggregats Kultur 2 und 12 Tage nach ausgesät auf Matrigel-beschichteten Deckgläschen.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Frühe Studien berichteten Bildung von Synapsen und reife Myelin in Rotation vermittelte frei schwebenden aggregierten Kulturen 1. Das ZNS Aggregat-Kultur hier beschriebene System vereint serumfreies Wachstum von multipotenten Vorläuferzellen in dreidimensionalen Aggregaten mit dem Komfort der traditionellen 2D-Kulturen auf Analysen der Zell-Entwicklung, Migration und Differenzierung in vitro zu erleichtern. Das System kann modifiziert und für neurale Vorläuferzellen verwendet werden Stammzel...

herstellung von ratten-gehirn-aggregate kulturen für neuron und glia development studies

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Eine In-vitro-System, rekapituliert die Entwicklung und Differenzierung von Vorläuferzellen zu reifen Neuronen und Gliazellen im zentralen Nervensystem (ZNS), wäre eine leistungsstarke Plattform für Neurowissenschaftler liefern zu axo-gliale Interaktionen, Eigenschaften und Differenzierung von multipotenten Vorläuferzellen, und das Fortschreiten der oligodendroglialen untersuchen Linie Zellen auf zellulärer und molekularer Ebene. Wir beschreiben hier eine ZNS-Aggregat-Kultur-System aus embryonalen Ratte Vorderhirn, die in einem Serum-freiem Medium gehalten werden können bis zu 3-4 Wochen und ist in unserem Labor als Modell zu Neuron-Glia-Interaktion und ZNS Myelinisierung Studie verwendet. Dieses Video wird gezeigt, wie zu isolieren und zu wachsen diese CNS aggregierten Kulturen aus E16 Rattenhirn. Ferner ist aus dem gleichen Gehirn Dissektion kann hochangereichertes regelmäßigen dissoziierten neuronalen Kulturen leicht erhalten werden und für verschiedene Studien über ZNS-Neuronen oder für Co-Kulturen mit anderen Zellen.

A-Protokolle für eine embryonale Rattenhirn Aggregat-Kultur-System beschrieben wird. Multipotente Vorläuferzellen in die Aggregate entwickeln können und differenzieren sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten.

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

Ein In-vitro-System, das die Entwicklung und Differenzierung von Vorläuferzellen zu reifen Neuronen und Gliazellen im zentralen Nervensystem (ZNS) nachbildet ...

Wir stellen ein System zur Kultivierung von neurogenen Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems vor, während diese sich zu reifen Neuronen und Gliazellen entwickeln und differenzieren. Das Verfahren beginnt mit der Isolierung von vier Gehirnen aus E16-Rattenembryonen, die anschließend mit Propan digeriert werden. Das Gewebe wird zu einer Einzelzell-Suspension dissoziiert, filtriert, gezählt und in eine Sechs-Zellkulturen in der Mehrfachbrille werden ein- bis dreimal täglich vorsichtig resuspendiert, um die Bildung von Aggregaten zu ermöglichen. Anschließend werden die Aggregate gesammelt und durch ein 200-Mikrometer-Sieb filtriert, wobei kleine Zellklumpen und Zelltrümmer durch Waschen entfernt werden. Schließlich werden die Aggregate gezählt und auf mit Matrigel beschichteten Deckgläsern ausplattiert.Hallo, ich bin Coto aus dem Labor von Dr. John L am Department für Veterinär-integrierte Biowissenschaften an der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Gehirnaggregatkulturen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Sicherheitsstufe-drei-Labor, um die Endozyten-Linie, Zellentwicklung und beschleunigte Wechselwirkungen zu untersuchen.Beginnen wir also. Bevor Sie starten, haben Sie auf dem Pult sterilisierte Werkzeuge, 70 % Ethanol, ein Unterlagepad zum Arbeiten und 10 cm große Petrischalen für die Dissektion bereit. Medium auf Eis.Bereiten Sie im Abzug ein Stereomikroskop mit einer Eisplattform und mehreren 10-Zentimeter-Schalen mit Dissektionsmedium, die ebenfalls auf Eis stehen, vor. Stellen Sie abschließend die Lösungen her, die Sie verwenden werden, und erwärmen Sie das Plattierungsmedium in einem Wasserbad auf 37 Grad. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Embryonen vom embryonalen Tag 16 (E 16) von einer Sprague-Dawley-Ratte gewinnen.Töten Sie zunächst ein trächtiges Weibchen gemäß einem von Ihrem institutionellen Tierversuchsausschuss genehmigten Verfahren. Legen Sie die getötete Ratte auf eine Windelunterlage und besprühen Sie den Bauch mit Alkohol, um ihn zu reinigen. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Bauchhaut einzuklemmen, und mit der anderen Hand eine Schere, um lediglich die Haut zu durchtrennen. Spreizen Sie die Haut auseinander und verwenden Sie ein weiteres Paar sterilisierter Pinzette und Schere, um durch die Muskelschicht zu schneiden.Als Nächstes entfernen Sie den Uterus und überführen ihn in eine 10 cm große Petrischale, die kaltes Dissektionsmedium enthält. Der nächste Schritt erfolgt im Sicherheitswerkbank unter Verwendung mikrochirurgischer Scheren. Entfernen Sie vorsichtig jedes Embryo aus dem Uterus.Jetzt ist es an der Zeit, die Gewebegewinnung durchzuführen und zu beginnen. Arbeiten Sie mit den embryonalen Gehirnen. Entnehmen Sie das Gehirn aus jedem Embryo und legen Sie die freigelegten Gehirne in eine saubere 10 cm-Schale mit Dissektionsmedium auf einer Eisplatte. Unter dem Dissektionsmikroskop vervollständigen Sie die Präparation der Gehirne.Entfernen Sie die Abschnitte des Mittelhirns und des Hinterhirns. Verwenden Sie feine Pinzette, um die Meningen zu entfernen, und überführen Sie das verbleibende Vorderhirn in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das Dissektionsmedium enthält. Nun ist das Gewebe für den nächsten Schritt bereit.Enzymatische Zell-Dissociation. Bereiten Sie kurz vor Beginn der Verdauung frische Lösungen aus Propan und Trypsin-Inhibitor-Filter vor. Sterilisieren Sie diese und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Entfernen Sie überschüssiges Medium von den dissezierten Gehirnen. Geben Sie anschließend vier Milliliter der hergestellten Propan-Digestionslösung in Ihr 50-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen genau fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Wenn die Zeit abgelaufen ist, entfernen Sie mit einer Pipette die Propanlösung. Geben Sie anschließend fünf Milliliter frisch zubereitete Trypsininhibitorlösung hinzu und stellen Sie das Reagenzglas für zwei bis drei weitere Minuten zurück in das 37 Grad Celsius warme Wasserbad. Wenn die Zeit abgelaufen ist, entfernen Sie die Trypsininhibitorlösung.Wiederholen Sie die Inkubation mit Trypsin-Inhibitor-Lösung noch dreimal. Nachdem Sie die Trypsin-Inhibitor-Lösung zum letzten Mal entfernt haben, geben Sie 20 Milliliter warmes Plating-Medium pm in Ihr Röhrchen.Jetzt ist es an der Zeit, die Zellen zu resuspendieren und zu waschen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer 10-Milliliter-Pipette, bis alle Klumpen verschwunden sind, ungefähr 20 bis 30 Mal. Anschließend zentrifugieren Sie sie sieben Minuten lang bei hundert ×g.Zu diesem Zeitpunkt sollten Ihre Zellen gut voneinander getrennt sein. Nach sieben Minuten entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in 10 Milliliter Plattierungsmedium, um die Zellen zu waschen.Danach erneut abzentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Waschung sowie Zentrifugation wiederholen. Schritt nach der zweiten Wäsche.Suspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter Aggregatkulturmedium und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb. Zählen Sie abschließend die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer.Und nun können Sie den dissoziierten Gehirnzellen erlauben, Aggregate zu bilden. Nach der Zellzählung suspendieren Sie die dissoziierten Zellen in Kulturmedium für Aggregate mit einer Dichte von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht beschichteten 6-Loch-Platte.Die Zellen werden drei Nächte lang jeden Tag vorsichtig resuspendiert. Einmal mithilfe einer P1000-Pipette, beginnen die Zellen am Tag der Aggregatplattierung, Aggregate zu bilden. Nachdem die Zellen drei Nächte lang gewachsen sind, werden die Zellen erneut vorsichtig resuspendiert und die Suspension durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen filtriert.Lassen Sie die Aggregate etwa drei bis fünf Minuten lang auf den Boden des Röhrchens sedimentieren. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, geben Sie Medium hinzu, resuspendieren Sie die Aggregate vorsichtig und lassen Sie sie erneut sedimentieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals.Um tote Zellen, einzelne Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, überprüfen Sie mithilfe des Mikroskops, ob die Überstände noch nicht aggregierte Zellen und Trümmer enthalten. Nachdem Sie die Aggregate gründlich gewaschen haben, resuspendieren Sie sie vorsichtig im gleichen Medium und zählen Sie die Aggregate, um ihre Konzentration zu bestimmen. Anschließend stellen Sie die Dichte der Aggregate auf etwa 25 bis 30 Aggregate pro 50 Mikroliter ein.Jetzt ist es an der Zeit, Deckgläser mit Aggregaten zu besiedeln. Überführen Sie Aliquote von je 1000 Mikroliter der Aggregatsuspension in 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen, da sich die Aggregate tendenziell am Röhrchenboden absetzen. Es ist daher entscheidend, mehrere Röhrchen mit der Aggregatsuspension für die Aussaat vorzubereiten. Die in diesem Schritt verwendeten Deckgläser sind mit dem Zellkultursubstrat Matrigel beschichtet, das durch eine Übernacht-Inkubation bei 37 Grad Celsius aufgebracht wurde.Nachdem Sie Alec-Watt der aggregierten Suspension hergestellt haben, nehmen Sie die Kulturplatte mit den mit Matrigel beschichteten Deckgläsern aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Lösung von jedem. Waschen Sie die Deckgläser mit warmer PBS und anschließend mit DD H2O.Sie sind nun bereit für die Aussaat von Aggregaten, um die Deckgläser mit Aggregaten zu besiedeln. Drehen Sie das Reagenzglas mit der Aggregatsuspension um, um die Aggregate zu vermischen und gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Aggregatsuspension in die Mitte jedes Deckglases.Stellen Sie die Platte vorsichtig zurück in den Inkubator, ohne weitere Störungen zuzulassen, damit sich die Aggregate gleichmäßig auf dem Deckglas anheften können. Die Dichte der Aggregate ist entscheidend; wenn die Aggregate zu dicht beieinander liegen oder die Besiedlungsdichte hoch ist, neigen sie dazu, vier bis sechs Stunden nach der initialen Ansiedlung miteinander zu verschmelzen. Geben Sie 500 Mikroliter Kulturmedium in jedes Loch. Um die Aggregatkultur aufrechtzuerhalten, wechseln Sie alle drei bis vier Tage die Hälfte des Kulturmediums. Beim Mediumwechsel fügen Sie das frische Medium entlang der Seitenwand der Vertiefung hinzu, um die Aggregate nicht zu stören. Einige Stunden, nachdem sich die Aggregate auf dem Deckglas angeheftet haben, können Neuritauswüchse aus den Aggregaten beobachtet werden.Axone wachsen in den ersten zwei Wochen schnell und bilden reichlich Verbindungen zwischen den Aggregaten aus. Ggl-Progenitoren wandern radial aus den Aggregaten aus und differenzieren sich im Laufe der Zeit in Astrozyten und reife Oligodendrozyten. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man CS-Aggregate kultiviert.Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kapazität korrekt anzugeben und sicherzustellen, dass das Aggregat gleichmäßig verteilt ist. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Forschung

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Biologie

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Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

Dieses Papier beschreibt die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten sympathischen Neuronen aus den überlegenen zervikalen Ganglien. Es bietet auch detaillierte Protokolle für immunzytochemische Färbung und für die Vorbereitung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie-Analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen aus embryonalen überlegenen Cervical Ganglia für morphologische und proteomische Analyse

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Lernen Sie die Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregatkulturen zur Untersuchung der Entwicklung von Neuronen und Gliazellen. Diese Methode ermöglicht die Differenzierung multipotenter Vorläuferzellen in kontrollierter Umgebung.

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

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