Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

Wir stellen ein System zur Kultivierung von neurogenen Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems vor, während diese sich zu reifen Neuronen und Gliazellen entwickeln und differenzieren. Das Verfahren beginnt mit der Isolierung von vier Gehirnen aus E16-Rattenembryonen, die anschließend mit Propan digeriert werden. Das Gewebe wird zu einer Einzelzell-Suspension dissoziiert, filtriert, gezählt und in eine sechsgliedrige Platte verteilt.

Zellkulturen in der Mehrfachbrille werden ein- bis zweimal täglich vorsichtig resuspendiert, um über zwei bis drei Tage die Bildung von Aggregaten zu ermöglichen. Anschließend werden die Aggregate gesammelt und durch ein 200-Mikrometer-Sieb filtriert, wobei kleine Zellklumpen und Zelltrümmer durch Waschen entfernt werden. Schließlich werden die Aggregate gezählt und auf mit Matrigel beschichteten Deckgläsern ausplattiert.

Hallo, ich bin Coto aus dem Labor von Dr. John L in der Abteilung für Veterinärmedizinische Integrierte Biowissenschaften an der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Gehirnaggregatkulturen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserer Stufe drei, um die Endozytenlinie, Zellentwicklung und beschleunigte Wechselwirkungen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Bevor Sie starten, haben Sie auf dem Pult sterilisierte Werkzeuge, 70 % Ethanol, ein Unterlagepad zum Arbeiten und 10 cm große Petrischalen für die Dissektion bereit. Medium auf Eis.

Bereiten Sie im Abzug ein Stereomikroskop mit einer Eisplattform sowie mehrere 10-Zentimeter-Schalen mit Dissektionsmedium, die ebenfalls auf Eis liegen, vor. Stellen Sie abschließend die Lösungen her, die Sie verwenden werden, und erwärmen Sie das Plattenmedium auf 37 Grad in einem Wasserbad. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Embryonen vom embryonalen Tag 16 (E 16) von einer Sprague-Dawley-Ratte gewinnen.

Töten Sie zunächst ein trächtiges Weibchen gemäß einem von Ihrem institutionellen Tierversuchsausschuss genehmigten Verfahren humane. Legen Sie die getötete Ratte auf eine Wickelunterlage und besprühen Sie den Bauchbereich mit Alkohol, um ihn zu reinigen. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Bauchhaut zusammenzuklemmen, und mit der anderen Hand eine Schere, um lediglich die Haut zu durchtrennen. Spreizen Sie die Haut auseinander und verwenden Sie ein weiteres Paar sterilisierter Pinzette und Schere, um durch die Muskelschicht zu schneiden.

Als Nächstes entfernen Sie die Gebärmutter und überführen sie in eine 10 cm große Petrischale, die kaltes Dissektionsmedium enthält. Der nächste Schritt erfolgt im Sicherheitswerkbank unter Verwendung von mikrochirurgischen Dissektionscheren. Entfernen Sie vorsichtig jedes Embryo aus der Gebärmutter.

Jetzt ist es an der Zeit, die Gewebegewinnung durchzuführen und zu beginnen. Arbeiten Sie mit den embryonalen Gehirnen. Entnehmen Sie das Gehirn aus jedem Embryo und legen Sie die freigelegten Gehirne in eine saubere 10 cm-Schale mit Dissektionsmedium auf einer Eisplatte. Beenden Sie die Dissektion der Gehirne unter dem Stereomikroskop.

Entfernen Sie die Abschnitte des Mittelhirns und des Hinterhirns. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Hirnhäute zu entfernen, und überführen Sie das verbleibende Vorderhirn in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das das Dissektionsmedium enthält. Nun ist das Gewebe für den nächsten Schritt bereit.

Enzymatische Zell-Dissociation. Bereiten Sie kurz vor Beginn der Verdauung frische Lösungen aus Propan und Trypsin-Inhibitor-Filter vor. Sterilisieren Sie diese und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad.

Entfernen Sie überschüssiges Medium von den dissezierten Gehirnen. Geben Sie anschließend vier Milliliter der zubereiteten Propan-Digensionslösung in Ihr 50-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen genau fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Wenn die Zeit abgelaufen ist, verwenden Sie eine Pipette, um die Propanlösung zu entfernen. Geben Sie anschließend fünf Milliliter frisch zubereitete Trypsininhibitorlösung hinzu und stellen Sie das Röhrchen für zwei bis drei weitere Minuten zurück in das 37 Grad Celsius warme Wasserbad. Wenn die Zeit abgelaufen ist, entfernen Sie die Trypsininhibitorlösung.

Wiederholen Sie die Inkubation mit Trypsin-Inhibitor-Lösung noch dreimal. Nachdem Sie die Trypsin-Inhibitor-Lösung zum letzten Mal entfernt haben, geben Sie 20 Milliliter warmes Plating-Medium pm in Ihr Reagenzglas.

Jetzt ist es an der Zeit, die Zellen zu resuspendieren und zu waschen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer 10-Milliliter-Pipette, bis alle Klumpen verschwunden sind, ungefähr 20 bis 30 Mal. Anschließend zentrifugieren Sie sie sieben Minuten lang bei hundert ×g.

Zu diesem Zeitpunkt sollten Ihre Zellen gut voneinander getrennt sein. Nach sieben Minuten entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in 10 Milliliter Plattierungsmedium, um die Zellen zu waschen.

Dann erneut abzentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Waschung sowie Zentrifugation wiederholen. Schritt nach der zweiten Waschung.

Suspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter Aggregatkulturmedium und passieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb. Zählen Sie abschließend die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer.

Und nun können Sie den dissoziierten Gehirnzellen erlauben, Aggregate zu bilden. Nach der Zellzählung suspendieren Sie die dissoziierten Zellen in einem Aggregatkulturmedium mit einer Dichte von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht beschichteten 6-Loch-Platte.

Die Zellen werden drei Nächte lang jeden Tag vorsichtig resuspendiert. Einmal mithilfe einer P1000-Pipette, beginnen die Zellen am Tag der Aggregatplattierung, Aggregate zu bilden. Nachdem die Zellen drei Nächte lang gewachsen sind, resuspendieren Sie die Zellen erneut vorsichtig und filtrieren die Suspension durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen.

Lassen Sie die Aggregate etwa drei bis fünf Minuten lang auf den Boden des Röhrchens sedimentieren. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, geben Sie Medium hinzu, resuspendieren Sie die Aggregate vorsichtig und lassen Sie sie erneut sedimentieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals.

Um tote Zellen, einzelne Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, überprüfen Sie mithilfe des Mikroskops, ob die Überstände noch nicht aggregierte Zellen und Trümmer enthalten. Nachdem Sie die Aggregate gründlich gewaschen haben, resuspendieren Sie sie vorsichtig im gleichen Medium und zählen Sie die Aggregate, um ihre Konzentration zu bestimmen. Anschließend stellen Sie die Dichte der Aggregate auf etwa 25 bis 30 Aggregate pro 50 Mikroliter ein.

Jetzt ist es an der Zeit, Deckgläser mit Aggregaten zu besiedeln. Überführen Sie Aliquots von 1000 Mikroliter der Aggregatsuspension in 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen, da sich die Aggregate dazu neigen, sich am Boden der Röhrchen abzusetzen. Es ist daher entscheidend, mehrere Röhrchen mit der Aggregatsuspension für die Plattenbeprobung anzusetzen. Die in diesem Schritt verwendeten Deckgläser sind über eine Übernacht-Inkubation bei 37 Grad Celsius mit einem Zellkultursubstrat, Matrigel, beschichtet.

Nachdem Sie Alec-Watt der Gesamtsuspension hergestellt haben, nehmen Sie die Kulturplatte mit den mit Matrigel beschichteten Deckgläsern aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Lösung von jedem. Waschen Sie die Deckgläser mit warmer PBS und anschließend mit DD H2O.

Sie sind nun bereit für die Aggregatbepflanzung, um die Deckgläser mit Aggregaten zu besiedeln. Drehen Sie das Reagenzglas mit der Aggregatsuspension um, um die Aggregate zu vermischen und gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie dann 50 µL der Aggregatsuspension in die Mitte jedes Deckglases.

Stellen Sie die Platte vorsichtig zurück in den Inkubator, ohne sie weiter zu stören, damit sich die Aggregate gleichmäßig auf dem Deckglas anheften können. Die Dichte der Aggregate ist entscheidend; wenn die Aggregate zu dicht beieinander liegen oder die Besiedlungsdichte hoch ist, neigen sie dazu, vier bis sechs Stunden nach der initialen Ansiedlung miteinander zu verschmelzen. Geben Sie 500 µL Kulturmedium in jedes Loch.

Um die Aggregatkultur aufrechtzuerhalten, wechseln Sie alle drei bis vier Tage die Hälfte des Kulturmediums. Beim Mediumwechsel fügen Sie das frische Medium entlang der Seitenwand der Vertiefung hinzu, um die Aggregate nicht zu stören. Einige Stunden nachdem die Aggregate an dem Deckglas angeheftet sind, können Neuritauswüchse aus den Aggregaten beobachtet werden.

Axone wachsen in den ersten zwei Wochen schnell und bilden reichlich Verbindungen zwischen den Aggregaten aus. Ggl-Progenitoren wandern radial aus den Aggregaten aus und differenzieren im Laufe der Zeit in Astrozyten und reife Oligodendrozyten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man CS-Aggregate kultiviert.

Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kapazität korrekt anzugeben und sicherzustellen, dass das Aggregat gleichmäßig verteilt ist. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.