Name: Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung einzelner synaptischer Vesikelexozytose in retinalen bipolaren Zellen von Goldfischen mittels TIRF-Mikroskopie. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in Neurotransmitterfreisetzungsmechanismen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Grant EY 14990 unterstützt.

Teil 1: Dissection und Bipolar Zellisolation <ol><li> Bereiten Sie Lösungen in Tabelle 2 aufgeführt; Der pH-Wert von Beringer &quot;(extern)-Lösungen sollten mit NaOH auf 7,4 eingestellt und der pH-Wert der internen Lösung sollte auf 7,2 mit CsOH eingestellt werden. Schützen interne Lösung vor Licht mit Alufolie und halten Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung; </li><li> Dark-Anpassung einen Goldfisch für mindestens 30 Minuten vor der Dissektion; </li><li> Während das Tier dunkel passt, bereiten 5 mL der Hyaluronidase (Typ V Hyaluronidase, 1100 Einheiten / ml in niedrigen Ca 2 + Ringer; Sigma, St. Louis, MO) und 10 ml der L-Cystein (0,5 mg / mL in niedrigen Ca 2 + Ringer-) Lösungen und wiegen das Papain (gefriergetrocknetes Pulver, 40 Einheiten / ml, Sigma, St. Louis, MO) für 5 ml der Verdauung Lösung; </li><li> Euthanize die Goldfische durch schnelle Enthauptung mit chirurgischer Schere und zerstören das Gehirn und das Rückenmark mit einem # 11 Skalpell; </li><li> Entfernen Sie die Augen durch die Zerstörung der extra-Augenmuskeln mit Hilfe eines # 7 gebogenen Pinzette Dumont und Schneiden des Sehnervs mit Iris Schere; </li><li> Legen Sie ein Auge Glühbirne auf einem Stück Filterpapier und Punktion der Sclerallimbus mit der Spitze eines Nr. 11 Skalpell; </li><li> Führen Sie die Klinge aus einem Paar von Vannas Schere innerhalb der punktierten ganzen und schneiden Sie die ganze vordere Segment entfernt; </li><li> Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier auf der Oberseite des restlichen Augenbecher und üben einen gewissen Druck, um das Papier mit Glaskörper einweichen; </li><li> Heben Sie das Filterpapier mit der Netzhaut verbunden ist und schneiden Sie den Sehnerv mit einem Nennwert von Vannas Schere; </li><li> Legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut in einem 35 mm Kunststoff-Kulturschale mit Hyaluronidase-Lösung und Abziehen der Netzhaut vom Filterpapier mit Hilfe von # 7 Dumont Pinzetten; </li><li> Cut der Netzhaut in 4-6 Stücke mit der Hälfte der industriellen Stahl einseitig geschliffene Klinge und ließ es in die Hyaluronidase-Lösung für 20 Minuten zu sitzen; </li><li> Während des Wartens auf Hyaluronidase in Kraft treten, 5 ml der L-Cystein-Lösung, die Papain und lassen Sie es sich, bis die Flüssigkeit transparent (ca. 5-10 Minuten); </li><li> Waschen Sie die Teile der Netzhaut 3x in niedrigen Ca 2 + Ringer und ließ sie in der Papain-Lösung setzen sie für 30-35 Minuten; </li><li> Waschen Sie die Teile der Netzhaut 3x in niedrigen Ca 2 + Ringer und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 ° C in einer 35 mm Kunststoff-Kulturschale mit niedrigem Ca 2 + Ringer; </li><li> Um distanzieren die Zellen, legen Sie ein Stück der Netzhaut in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 ml niedrige Ca 2 + Ringer und langsam verreiben der Netzhaut durch Pipettieren es rauf und runter mit einem Glas Dissoziation Pipette vorsichtig, keine Luftblasen zu produzieren. Dissoziation Pipetten werden durch Aufheizen der Spitze einer Glas-Pasteurpipette mit einem Bunsenbrenner und leicht verbiegen mit Hilfe der anatomischen Pinzette hergestellt; </li><li> Platte die isolierten Zellen durch Zugabe von einem Tropfen des retinalen Suspension auf eine hausgemachte Aufnahme Kammer zuvor mit 2 ml niedrige Ca 2 + Ringer gefüllt. Die Kammer besteht aus der unteren Hälfte eines 35-mm-Kunststoff-Kulturschale mit einem kreisrunden Loch in der Mitte und einem runden Deckglas von 1,78 Brechungsindex Glas (PlanOptik, Deutschland) geklebt, um den Boden mit einem Silizium-Elastomer (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Teil 2: Bipolarzelle Be-und Wash Out TIRF Bildgebung von synaptischen Vesikeln erfolgt am besten mit Hilfe einer objektiven Typ TIRFM Mikroskop mit einer sehr hohen NA objektive und einer empfindlichen Kamera durchgeführt. Für unsere Experimente, wählen wir ein 1,65 NA Objektiv (Apo x100 O HR, NA 1,65, Olympus, Japan) mit einem EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ) zu verwenden. Die Verwendung der sehr hohen NA Ziel erfordert den Einsatz von hohem Brechungsindex Deckgläser und Immersionsflüssigkeit (di-Iodmethan mit Schwefel). Unter unseren Bedingungen ist Anregungslicht zu einer exponentiell abklingenden Feld mit einer Länge konstant von ca. 50 nm beschränkt. <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex (M-Serie, Brechungsindex = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ), die Mikroskop-Objektiv; </li><li> Legen Sie die Aufnahme Kammer vorsichtig auf der Oberseite des Mikroskop-Objektivs und vorsichtig montieren Masseelektrode und Superfusion Ausfahrt Rohr Kammer; </li><li> Lassen Kammer Mikroskop sitzen für 10-20 Minuten, damit Zellen zu sinken und sich an der Unterseite; </li><li> In der Zwischenzeit bereiten 5 ml einer 1 mM Trolox ® ((±)- 6-Hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbonsäure; Sigma, St. Louis, MO)-Lösung in hoher K + Ringer- . Beschallen, bis es gelöst; </li><li> Bereiten Sie 15 ml ADVASEP-7 Waschlösung: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) in niedrigen Ca 2 + Ringer. Beachten Sie, dass ADVASEP-7 Verwendung optional ist und kann bei Bedarf unterdrückt werden; </li><li> Spülen Sie die Superfusion lines und fügen ADVASEP-7 Waschlösung, niedrige Ca 2 + Ringer und Ringer-Kontrolle der Superfusion System; </li><li> Pull loading Pipetten aus dünnwandigen Borosilikatglas (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Puffer Pipette Widerstände sind in den 1,5-2,5 MOhm-Bereich; </li><li> Bereiten Sie den FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) Styryl) pyridinium Dibromid &quot;, eine spezielle Verpackung&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA)-Lösungen. Stellen Sie zunächst eine 1 mM Lager von zusätzlich 160 ul destilliertem Wasser auf ein Fläschchen (100 mg) des FM1-43 ®. Diese Aktie kann bei 4 ° C aufbewahrt werden bis zu einer Woche. Anschließend 5 ul des FM1-43 ® bis 1 mL hohen K + Ringer + 1mM Trolox ®. Protect-Lösung von Licht mit Aluminiumfolie und halten Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung; </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Hellfeld Licht auf und die Suche nach intakter bipolaren Zellen. Leicht tippen Sie auf das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Neuronen fest an den Boden der Kammer angebracht ist; </li><li> Positionieren Sie die Superfusion Stift in der Nähe der Zelle von Interesse und kontinuierlich versorgen die Vorbereitung mit niedrigen Ca 2 + Ringer; </li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung und fügen Sie einen roten langen Pass Filter (dh RG630, Schott, Deutschland), um den optischen Pfad zur Anregung des FM Farbstoff zu minimieren; </li><li> Füllen Sie einen Laden Pipette mit 10 ul der FM Farbstofflösung, montieren Sie die Pipette in den Mikromanipulator und senken Sie die Pipette auf die Vorbereitung ohne Überdruck, bis sie an der gleichen Bildebene als die bipolare Zelle, die Sie laden möchten, ist. Vergewissern Sie sich, mindestens zwei Elektrodenhalter: die eine für den FM-Farbstoff kann nicht für Patch-Clamp verwendet werden, oder es kann die intrazelluläre Lösung verunreinigen; </li><li> Position der Puffer Öffnung in einem Abstand von etwa 10 pm aus der Axonterminal, drehen Sie die Superfusion System aus und puff der Farbstoff-Lösung für 10 Sekunden durch Drehen der Pipette Überdruck auf; </li><li> Drehen Sie den Überdruck ab und, ohne Bewegung der Pipette, 30 Sekunden warten; </li><li> Schalten Sie die Superfusion auf und tauchen den Raum in ADVASEP-7-Lösung für 5 Minuten. In der Zwischenzeit, entfernen Sie den Puffer Pipette aus dem Bad; </li><li> Nach 5 Minuten zu niedrigen Ca 2 + Ringer-Schalter und versorgen die Kammer für 25-30 Minuten, um das Entfernen von überschüssigem Farbstoff zu ermöglichen. </li></ol> Teil 3: Patch-Clamp-und TIRFM Imaging <ol><li> Während der Vorbereitung ist das Auswaschen, ziehen Patch-Pipetten aus dickwandigem Borosilikatglas (B150-86 bis 10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch-Pipette Widerstände sind in der 8-10 MOhm-Bereich; </li><li> Nach Auswaschen beendet ist, legen Sie das Axon-Terminal in der Mitte des Sichtfeldes; </li><li> Füllen Sie ein Patch-Pipette mit 7μL der internen Lösung, tippen Sie auf die Pipette, um loszuwerden, Luftblasen, Mantel der Pipette mit geschmolzenem Dentalwachs (Sticky Wax; Kerr Corporation, Orange, CA) und montieren Sie ihn in den Mikromanipulator; </li><li> Schalten Sie die Pipette Überdruck auf und senken Sie die Pipette langsam auf die Vorbereitung. Überprüfen Pipette Widerstand in den Verstärker und richtige Pipette Offsets und Kapazität mit dem jeweiligen Verstärker steuert; </li><li> Schalten Sie die Superfusion auf Ringer-Kontrolle. So erstellen Sie eine Gigaseal zwischen der Pipette und der Zelle, leicht berühren die Spitze der Elektrode gegen die Zellkörper und drehen Sie die Pipette Überdruck ab, während sanft Anlegen von Unterdruck an der Elektrode; </li><li> Während versiegelt, wählen Sie &quot;ganze Zelle&quot;-Modus in den Verstärker und setzen Sie die Zelle Haltepotential bis -60 mV; </li><li> Wählen Sie eine Region von Interesse, mit der Imaging-Software, die die ganze Axonterminal umfasst, schalten Sie das Hellfeld Licht aus und durch kurzes Aussetzen (30 ms) das Terminal mit dem 488 nm Laser, finden Sie den richtigen Brennebene für TIRF Bildgebung; </li><li> Pause in die Zelle, indem Sie die &quot;zappen&quot;-Befehl des Verstärkers während der Anwendung leicht negativen Druck auf die Pipette; </li><li> Richtig für die Zell-Kapazität und Vorwiderstand, und wenden Sie dann die Spannung Protokoll von Interesse, während die Abbildung der Bewegung von synaptischen Vesikeln. Es ist in dieser Phase wichtig, dass die Spannung Protokoll, um die Bildrate synchronisiert. In unserem Fall, jedes Bild 30 ms lang ist, so dass die Spannung Veränderungen in Vielfachen dieses Wertes (dh alle 300 ms oder 10 Frames); </li><li> Warten Sie mindestens 40 Sekunden zwischen den Prüfungen für die Wiederherstellung zu ermöglichen; </li><li> So überprüfen Sie die Position der synaptischen Bänder, fotografieren, während Sie den 561 nm Laser auf. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Der Versuchsaufbau. A 488 nm-Laser (blau) wird an die Peripherie der hinteren Brennebene des Objektivs ausgerichtet und leidet unter Totalreflexion, wenn es das Glas-wässrigen Medium-Schnittstelle erreicht. Das elektromagnetische Feld des reflektierten Strahls erzeugt regt das Fluorophor in den synaptischen Vesikeln am nächsten an der bott geladenom des Glases Kammer, die dann fluoreszieren (grün). Das Fluoreszenzlicht wird dann auf das Auge des Beobachters (siehe Bild) oder zu einer CCD-Kamera geleitet. Das Membranpotential der abgebildeten Zellen gleichzeitig von Patch-Clamp ihnen kontrolliert. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Beziehung zwischen eingehenden Signale (die Membran-Spannung) und der neuronalen Ausgang (Exozytose). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Typische Ergebnisse. Links: Hellfeldbild eines isolierten Goldfisch bipolaren Zellen. Oben rechts: TIRF Bild von den synaptischen Vesikeln in der bipolaren Zellen Axonterminal mit FM 1-43 geladen ® und abgebildet mit der 488 nm-Laser (FM Farbstoff). Unten rechts: Bild der gleichen Klemme nach dem Patchen der Zelle und die Abbildung der Axon-Terminal mit dem 561 nm-Laser. Synaptic Bänder werden durch die Rhodamin-basierte RIBEYE-bindende Peptid (Rpep_rhod) gekennzeichnet. Tabelle 1: Spezifische Reagenzien und Geräte. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Name </td><td> Typ </td><td> Hersteller </td><td> Katalog </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Table </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Inverses Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> - </td><td> Ausgestattet mit einer Wolfram-Lampe für Hellfeld und eine seitliche Öffnung Port für TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Lamp Power Source </td><td> Olymp </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dichroitische Filter </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Emission Filter </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O HR </td><td> Ziel </td><td> Olymp </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Glass Filter </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm Laser </td><td> Kohärent </td><td> - </td><td> Verwenden Sie bei minimalem Stromverbrauch </td></tr><tr><td> - </td><td> Verschluss </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Shutter-Treiber </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm Laser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Verschluss </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Shutter-Treiber </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusion Pressure Kit </td><td> Superfusion-System </td><td> Automatisieren Scientific </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusion Pen </td><td> Superfusion-System </td><td> Automatisieren Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Superfusion System Controller </td><td> Automatisieren Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM-CCD-Kamera </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7,1 </td><td> Imaging Software </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Patch-Clamp-Verstärker </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Puls </td><td> Verstärker Software </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Mikromanipulator </td><td> Sutter Instrument </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Elektrodenhalter </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> Für 1,5 mm OD Glas, 2 Stück </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Borosilikat Capillary Glass </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Ohne Faden </td></tr><tr><td> B150-86 bis 10 </td><td> Borosilikat Capillary Glass </td><td> Sutter Instrument </td><td> - </td><td> Mit Filament </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Mikroelektroden-Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> - </td><td> Ausgestattet mit 3x3 Kästchen Filament-und Klimakammer </td></tr><tr><td> - </td><td> Pressure Vacuum Air Pump </td><td> Thomas Scientific </td><td> 7893B05 </td><td> Erstellt Vakuum, Flüssigkeiten von Kammer-und Überdruck für Pipetten entfernen </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Analyse-Software </td><td> MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 mm Kunststoff-Petrischalen </td><td> Falke </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> High Refractive Index Glass </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Brechungsindex 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Serie M </td><td> High Refractive Index Flüssigkeit </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Brechungsindex = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Silicon-Elastomer-Kit </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutathion </td><td> Tripeptide </td><td> EMD Chemicals </td><td></td><td> Kostenlose radical scavenger </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Enzym </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Typ V </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Aminosäure </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Aktiviert Papain </td></tr><tr><td> Papain </td><td> Enzym </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> Von Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Vitamin E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Radikalfänger </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfoniertes B-Cyclodextrin-Derivat </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Reduziert FM 1-43 ® Hintergrundfluoreszenz </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Fluoreszenzfarbstoff </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Special Packaging&quot; </td></tr><tr><td> Sticky Wax </td><td> Pipette Beschichtungsmittel </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Verringert Pipette Kapazität </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Physiologische Lösungen in dieser Studie verwendet. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> Low Ca 2 + Ringer- </td><td> Control-Ringer- </td><td> Hohe K + Ringer- </td><td> Interne Lösung </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mm </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutathion </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CH 3 CsO 3 S * </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 200 mL </td><td> 100 mL </td><td> 5 ul </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> * Cäsium Methansulfonat. ** RIBEYE-bindende Peptid: Rhodamin + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

Die Vorteile der Ziel-Typ TIRF-Mikroskopie werden, dass 1) es hervorragende optische Schnitte bietet durch die Beschränkung Anregungslicht auf einen schmalen Bereich in der Brennebene des Objektivs und minimiert dadurch out-of-focus Licht, 2), da Licht fällt exponentiell mit der Entfernung kann eine Bewegung in vertikaler Richtung als eine Änderung in der Fluoreszenz-Intensität überwacht werden; 3) effiziente Lichtausbeute durch die hohe numerische Apertur Ziel 1,5. Der größte Nachteil dieser Technik ist, dass es zu bildg...

imaging exocytose in retinal bipolaren zellen mit tirf-mikroskopie

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie ist eine Technik, dass die Studie die Geschehnisse an der Zellmembran ermöglicht, durch selektive Darstellung von fluoreszierenden Molekülen, die zu einem hohen Brechungsindex Substanz wie Glas am nächsten sind,<sup&gt; 1</sup&gt;. In diesem Artikel wenden wir diese Technik, um Bild Exozytose synaptischer Vesikel in der Netzhaut bipolaren Zellen aus dem Goldfisch Netzhaut isoliert. Diese Neuronen sind sehr geeignet für diese Art der Studie aufgrund ihrer großen Axonterminalen. Durch die gleichzeitige Patch-Clamp der bipolaren Zellen, ist es möglich, die Beziehung zwischen präsynaptischen Spannung und synaptische Freisetzung untersuchen<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Synaptischer Vesikel innerhalb der bipolaren Zellen Terminals sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff (FM 1-43 ®) von geladenen Co-schnaufend dem Farbstoff und einem Ringer-Lösung mit einem hohen K<sup&gt; +</sup&gt; Konzentration auf die synaptischen Terminals. Dies depolarisiert die Zellen und regt die Endozytose und damit Farbstoffaufnahme in die glutamaterge Vesikel. Nach dem Waschen der überschüssige Farbstoff entfernt für etwa 30 Minuten werden die Zellen bereit für sein Patch gespannt und bebildert gleichzeitig mit einem 488 nm-Laser. Die Patch-Pipette Lösung enthält ein Rhodamin-basierte Peptid, das selektiv an den synaptischen Bandes Protein RIBEYE<sup&gt; 4</sup&gt;, Damit die Kennzeichnung Bänder speziell, wenn die Klemmen mit einem 561 nm Laser abgebildet werden. Dies ermöglicht die genaue Lokalisierung der aktiven Zonen und die Trennung von synaptischen aus extra-synaptischen Ereignisse.

In diesem Video zeigen wir, wie Label und visualisieren einzelne synaptische Vesikel Exozytose und Menschenhandel in Goldfische Netzhaut bipolaren Zellen mit insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie.

Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (Total Internal Reflectance Fluorescence Microscopy, TIRF) ist eine Technik, die die Untersuchung von Ereignissen an der Zellmembran ermöglicht, indem eine selektive...

Dieses Verfahren beginnt mit der Dissektion der Netzhaut von adulten Goldfischen, also des Nervengewebes an der Hinterseite des Auges. Die Netzhäute werden 35 Minuten lang in eine enzymatische Lösung gegeben, gespült und mit einer feuerpolierten Glaspipette aufgewirbelt, um die Zellen zu dissoziieren. Anschließend werden die Zellen auf Deckgläser mit hohem Brechungsindex aufgebracht und in Kunststoffkulturschalen montiert.Isolierte bipolare Zellen werden anhand ihrer charakteristischen Morphologie identifiziert, um die Endigungen zu beladen. Wir puffen 10 Sekunden lang eine Lösung mit FM 1-43 auf die Zellen und warten danach 30 Sekunden, bevor der Farbstoff weggewaschen wird. Nach einer 30-minütigen Waschphase werden die Zellen angezapft, geclampet und mittels TIRF-Mikroskopie abgebildet.Hallo, mein Name ist Christina Jovi vom ZEC-Labor der Abteilung für Zell- und Molekularphysiologie an der medizinischen Fakultät der Yale University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um die Exozytose in lebenden retinalen Bipolarzellen mithilfe der TURF-Mikroskopie zu untersuchen. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um Mechanismen der synaptischen Freisetzung zu erforschen.Beginnen wir also. Dunkeladaptieren Sie einen Goldfisch mindestens 30 Minuten vor der Präparation. Nach der Enthauptung und Entfernung des Auges legen Sie eine Augenbulbe auf ein Stück Filterpapier und verwenden die Spitze einer Skalpellklinge Größe 11, um die sklerale Limbus zu durchstechen. In das entstandene Loch hinein.Verwenden Sie eine Bonna-Schere, um das gesamte vordere Segment abzuschneiden. Legen Sie anschließend ein kleines Stück Filterpapier auf die verbleibende Augenschale und üben Sie leicht Druck aus, um den Glaskörper aufsaugen zu lassen. Heben Sie das Filterpapier mit der daran haftenden Netzhaut an und durchtrennen Sie mit einer VNA-Schere den Sehnerv.Legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut in eine 35-Millimeter-Kunststoffkulturschale, die eine hohe Alur-Lösung enthält, und verwenden Sie Dumont-Pinzetten der Größe sieben, um die Netzhaut vom Filterpapier abzulösen. Anschließend schneiden Sie die Netzhaut mit der Hälfte einer industriellen Einwegklinge aus Kohlenstoffstahl in vier bis sechs Stücke und lassen sie 20 Minuten lang in der Hyaluronidase-Lösung stehen. Währenddessen, während Sie warten, bis die Hyaluronidase wirkt, geben Sie fünf Milliliter L-Cystein-Lösung zum Papain hinzu und lassen es etwa fünf bis zehn Minuten stehen, bis die Flüssigkeit transparent wird. Waschen Sie die Netzhautstücke dreimal in einer Ringer-Lösung mit niedrigem Calciumgehalt und lassen Sie sie 30 bis 35 Minuten in der Papain-Lösung stehen.Nach 35 Minuten Inkubation in der Papain-Lösung die Netzhautstücke dreimal waschen. Die Stücke in eine 35 Millimeter große Kunststoffkulturschale überführen, die Ringer-Lösung mit niedrigem Calciumgehalt enthält, und die Schale bei 12 bis 14 Grad Celsius lagern, bis Sie bereit sind, die Zellen zur Dissoziation der Zellen zu trennen.Stellen Sie zunächst eine Dissoziationspipette her, indem Sie die Spitze einer Glas-PE oder Pipette mit einem Bunsenbrenner erhitzen und sie dann mit anatomischen Pinzetten leicht verbiegen. Geben Sie ein Stück Retina in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das eine Lösung mit niedrigem Calciumgehalt (Ringer-Lösung) enthält, und dissoziieren Sie die Retina langsam, indem Sie sie vorsichtig mit der hergestellten Dissoziationspipette mehrmals auf- und abpipettieren. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen, und geben Sie zur Plättierung der isolierten Zellen einen Tropfen der Retinasuspension in eine selbstgebaute Ableitkammer, die mit Ringer-Lösung mit niedrigem Calciumgehalt gefüllt ist.Die Kammer besteht aus der unteren Hälfte einer 35-Millimeter-Kunststoffkulturschale mit einem runden Loch in der Mitte und einer runden Deckglasplatte aus Glas mit einem Brechungsindex von 1,78, die an der Unterseite befestigt ist. Nachdem die Dissektion und die Isolierung der Bipolarzellen abgeschlossen sind, können wir mit dem Beladen und Ausspülen der Bipolarzellen beginnen. In diesem Experiment ist es am besten, ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop mit einem Objektiv mit sehr hoher numerischer Apertur und einer empfindlichen Kamera zu verwenden.In diesem Video verwenden wir ein Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,65 und eine elektronenvervielfachende ladegekoppelte Vorrichtung. Geben Sie zunächst einen Tropfen Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex auf das Mikroskopobjektiv. Platzieren Sie die Aufnahmekammer auf dem Mikroskopobjektiv.Befestigen Sie die Masselektrode und die Überströmungs-Auslassleitung sorgfältig an der Kammer. Lassen Sie die Kammer 10 bis 20 Minuten auf dem Mikroskop stehen, damit die Zellen absinken und am Boden haften können. Danach spülen Sie die Überströmungsleitungen aus und fügen Sie Spüllösung hinzu.Niedrig-Kalium-Ringer-Lösung und Kontroll-Ringer-Lösung an das Überströmungssystem anschließen. Das Hellfeldlicht des Mikroskops einschalten und nach intakten bipolaren Zellen suchen. Das Mikroskop leicht antippen, um sicherzustellen, dass die Neuronen fest am Boden der Kammer haften.Positionieren Sie den Überströmungsstift nahe einer intakten Zelle und perfundieren Sie das Präparat kontinuierlich mit einer Ringer-Lösung mit niedrigem Calciumgehalt. Schalten Sie nun das Licht im Raum aus und fügen Sie einen roten Langpassfilter in den optischen Strahlengang ein, um die Anregung des fluoreszierenden Farbstoffs zu minimieren. Füllen Sie eine Lade-Pipette mit 10 Mikrolitern der fluoreszierenden Farbstofflösung.Befestigen Sie es am Mikromanipulator und senken Sie es anschließend ohne Verwendung der Überdruckoption auf das Präparat ab, bis es sich in derselben Fokusebene wie die ausgewählte bilar Zelle befindet. Positionieren Sie die Öffnung des Puffers in einem Abstand von etwa 10 Mikrometern vom Axonterminal. Schalten Sie das Überströmungssystem aus und geben Sie die Farbstofflösung 10 Sekunden lang durch Einschalten des Überdrucks an der Pipette ab.Schalten Sie nun den Überdruck aus, ohne die Pipette zu bewegen. Warten Sie 30 Sekunden, schalten Sie das Überströmungssystem ein und spülen Sie die Kammer fünf Minuten lang mit Spüllösung. In der Zwischenzeit entfernen Sie die Pufferpipette aus dem Bad.Nach fünf Minuten das SUPERFUSION-System auf eine Ringer-Lösung mit niedrigem Calciumgehalt umschalten und 25 bis 30 Minuten perfundieren, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen, nachdem das Beladen und Ausspülen der bipolaren Zellen abgeschlossen ist. Nun können wir mit der Patch-Clamp-Technik und der T-I-R-F-M-Bildgebung beginnen. Nach Abschluss des Ausspülens die Elektrodenhalter wechseln, um eine Kontamination Ihrer Patch-Pipette mit Farbstoff zu vermeiden.Platzieren Sie das Axonende in der Mitte des Sichtfelds. Füllen Sie eine Patch-Pipette mit sieben Mikrolitern Innenlösung. Klopfen Sie sie leicht, um Luftblasen zu entfernen.Überziehen Sie es mit geschmolzenem Zahnwachs und befestigen Sie es dann im Mikromanipulator. Drehen Sie die Pipette um, schalten Sie den Druck ein und senken Sie die Pipette langsam auf das Präparat ab. Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand und nehmen Sie erforderliche Korrekturen vor.Als Nächstes, bei eingestellter Ringer-Lösung am Überströmungssystem, bilden Sie einen Giga-Seal zwischen der Pipette und der Zelle, indem Sie die Spitze der Elektrode leicht mit dem Zellkörper berühren. Mit abgeschaltetem Überdruck an der Pipette wenden Sie vorsichtig Unterdruck auf die Elektrode an, während der Verschluss besteht. Wählen Sie den Ganzzell-Modus im Verstärker aus und stellen Sie das Haltepotential der Zelle auf minus 60 Millivolt ein.Verwenden Sie nun eine Bildgebungssoftware, um einen interessierenden Bereich auszuwählen, der das gesamte Axonterminal umfasst. Schalten Sie das Hellfeldlicht aus und belichten Sie das Terminal kurz mit dem 488 Nanometer Laser. Finden Sie die richtige Fokusebene für die TIRF-Bildgebung.Als Nächstes durch Anwendung des Zap-Befehls des Verstärkers und leicht negativen Drucks an der Pipette in die Zelle eindringen, die Zellkapazität und Serienwiderstand korrigieren und dann das Spannungsprotokoll anwenden, während die Bewegung synaptischer Vesikel abgebildet wird. Zwischen den Versuchen mindestens 40 Sekunden warten, um eine Erholung zu ermöglichen.Zunächst wählen wir eine bipolare Zelle in der Hellfeldmikroskopie aus. Anschließend zoomen wir heran und füllen ihr Axonterminal mit dem fluoreszierenden Farbstoff. Nach einer 30-minütigen Spülphase kann das beladene Terminal mittels Interferenzmikroskopie zusammen mit der Bewegung fluoreszierender glutamaterger Vesikel abgebildet werden.Hier führen wir über die Patch-Pipette ein Rib-Eye-Bindungspeptid ein, das es uns ermöglicht, die Position synaptischer Ribbons bei der Abbildung mit einem 561 Nanometer Laser zu erkennen. Anschließend depolarisieren wir die Zellen und bilden die Vesikelbewegung mit dem 488 Nanometer Laser ab. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man retinale Bipolarzellen isoliert und mit einem fluoreszierenden Farbstoff belädt sowie diese Neuronen patcht, klemmt und gleichzeitig mit Turf-Mikroskopie abbildet.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen nicht zu stark dem Laser auszusetzen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015). Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen,...

Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) zur Visualisierung exozytärer Ereignisse in kortikalen Neuronen. Ein pH-empfindlicher Marker für grün fluoreszierendes Protein (GFP) fluoresziert bei der Vesikelfusion, wobei die selektive TIRF-Anregung die membranproximale Exozytose...

Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse 

Polarisation-basierte Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) ermöglicht die Echtzeit-Erkennung von Zellmembrandynamik. Dieser Artikel beschreibt die Umsetzung der pTIRFM für das Studium der Membran Umbau während regulierten Exozytose. Die Technik ist generalisierbar auf andere Prozesse in der Zellbiologie, die Veränderungen in Membranform, die direkt oder indirekt beteiligen.

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Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

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In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

Erfahren Sie die Visualisierung einzelner synaptischer Vesikelexozytose in retinalen bipolaren Zellen von Goldfischen mittels TIRF-Mikroskopie. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in Neurotransmitterfreisetzungsmechanismen.

Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

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