Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Dieses Verfahren beginnt mit der Dissektion der neuralen Netzhaut erwachsener Goldfische, d. h. des Nervengewebes im hinteren Teil des Auges. Die Netzhaut wird 35 Minuten lang in eine enzymatische Lösung gelegt, gespült und mit einer feuerpolierten Glaspipette versorgt, um die Zellen zu dissoziieren. Die Zellen werden dann auf hochbrechende Glasdeckgläser plattiert und in Kunststoff-Gewebekulturschalen montiert.

Isolierte bipolare Zellen sind an ihrer ausgeprägten Morphologie der Lastklemmen zu erkennen. Wir paffen 10 Sekunden lang mit einer Lösung, die FM 1 43 enthält, und warten 30 Sekunden, bevor wir den Farbstoff wegwaschen. Nach einer 30-minütigen Waschung werden die Zellen gepflastert, geklemmt und mit TIRF-Mikroskopie abgebildet.

Hallo, mein Name ist Christina Jovi vom ZEC-Labor in der Abteilung für Zelluläre und Molekulare Physiologie an der Yale University School of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung der Exozytose in lebenden retinalen Bipolarzellen mittels Rasenmikroskopie. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um Mechanismen der synaptischen Freisetzung zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um mit der Dunkelheit zu beginnen, passen Sie einen Goldfisch mindestens 30 Minuten lang an, bevor Sie ihn sezieren. Legen Sie nach der Enthauptung und Augenentfernung einen Augenbulbus auf ein Stück Filterpapier und stechen Sie mit der Spitze einer Skalpellklinge Nr. 11 in den Sklerallimbus im Inneren des punktierten Lochs.

Schneide mit einer Bonna-Schere das gesamte vordere Segment ab. Legen Sie dann ein kleines Stück Filterpapier auf den restlichen Optikbecher und üben Sie etwas Druck aus, wodurch dies geschieht. Um den Glaskörper aufzusaugen, heben Sie das Filterpapier mit der aufgesetzten Netzhaut an und schneiden Sie mit einer VNA-Schere den Sehnerv durch.

Legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut in eine 35-Millimeter-Plastikschale mit hoher Aluminiumlösung und ziehen Sie die Netzhaut mit einer Dumont-Pinzette Nummer sieben vom Filterpapier ab. Schneiden Sie dann mit der Hälfte einer einschneidigen Klinge aus industriellem Kohlenstoffstahl die Netzhaut in vier bis sechs Stücke und lassen Sie sie 20 Minuten lang in der Hyaluronidase-Lösung sitzen, während Sie darauf warten, dass die Hyaluronidase wirkt, fügen Sie dem Papain fünf Milliliter L-Cystein-Lösung hinzu und lassen Sie sie etwa fünf bis 10 Minuten einwirken, bis die Flüssigkeit transparent wird. Waschen Sie die Netzhautstücke dreimal in kalziumarmer Ringerlösung und lassen Sie sie 30 bis 35 Minuten in der Papainlösung einwirken.

Nach 35 Minuten Inkubation in der Papainlösung. Waschen Sie die Netzhautstücke dreimal. Übertragen Sie die Stücke in eine 35 Millimeter große Plastikschale mit kalziumarmen Ringern und lagern Sie die Schale bei 12 bis 14 Grad Celsius, bis Sie bereit sind, mit der Dissoziation der Zellen zu beginnen, um die Zellen zu dissoziieren.

Stellen Sie zuerst eine Dissoziationspipette her, indem Sie mit einem Brötchen und einem Brenner die Spitze eines Glas-PEs oder einer Pipette erhitzen und dann mit einer anatomischen Pinzette leicht biegen. Legen Sie ein Stück Netzhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit kalziumarmer Ringerlösung und iterieren Sie die Netzhaut langsam, indem Sie sie vorsichtig mit der hergestellten Dissoziationspipette auf und ab pipettieren. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen, und geben Sie die isolierten Zellen mit einem Tropfen der Netzhautsuspension in eine selbstgemachte Aufnahmekammer, die mit kalziumarmer Ringerlösung gefüllt ist.

Die Kammer besteht aus der unteren Hälfte der 35 Millimeter großen Kulturschale aus Kunststoff mit einem kreisförmigen Loch in der Mitte und einem kreisförmigen Deckglas aus 1,78 Brechungsindexglas, das auf den Boden geklebt ist. Nachdem die Dissektion und die Isolierung der bipolaren Zellen abgeschlossen sind, sind wir bereit, mit dem Laden und Auswaschen der bipolaren Zellen zu beginnen. In diesem Experiment ist es am besten, ein objektives Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop mit einem Objektiv mit sehr hoher numerischer Apertur und einer empfindlichen Kamera zu verwenden.

In diesem Video verwenden wir ein Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,65 und ein ladungsgekoppeltes Gerät zur Elektronenmultiplikation. Geben Sie zunächst einen Tropfen Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex in das Mikroskop. Objektiv. Platzieren Sie die Aufnahmekammer auf dem Mikroskop. Objektiv.

Montieren Sie die Erdungselektrode und das Superfusionsaustrittsrohr vorsichtig an der Kammer. Lassen Sie die Kammer 10 bis 20 Minuten lang auf dem Mikroskop stehen, damit die Zellen absinken und am Boden haften können. Spülen Sie anschließend die Superfusionsleitungen und fügen Sie Waschlösung hinzu.

Ringerlösung mit niedrigem Kalziumgehalt und Kontrollringerlösung für das Superfusionssystem. Schalten Sie das Hellfeldlicht des Mikroskops ein und suchen Sie nach intakten Bipolarzellen. Klopfen Sie leicht auf das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Neuronen fest am Boden der Kammer befestigt sind.

Positionieren Sie den Superfusionsstift in der Nähe einer intakten Zelle und perfundieren Sie das Präparat kontinuierlich mit einer kalziumarmen Ringerlösung. Schalten Sie nun das Licht im Raum aus und fügen Sie dem Strahlengang einen roten Langpassfilter hinzu, um die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs zu minimieren. Füllen Sie eine Ladepipette mit 10 Mikrolitern Fluoreszenzfarbstofflösung.

Montieren Sie es in den Mikromanipulator und senken Sie es dann ohne die Überdruckoption auf das Präparat ab, bis es sich in der gleichen Brennebene wie die ausgewählte Gallenzelle befindet. Positionieren Sie die Pufferöffnung in einem Abstand von etwa 10 Mikrometern vom Axonterminal. Schalten Sie das Superfusionssystem aus und blasen Sie die Farbstofflösung 10 Sekunden lang auf, indem Sie die Pipette über Druck einschalten.

Drehen Sie nun den Überdruck aus und ohne die Pipette zu bewegen. Warten Sie 30 Sekunden, schalten Sie das Superfusionssystem ein und baden Sie die Kammer fünf Minuten lang in Waschlösung. In der Zwischenzeit die Kugelpipette aus der Badewanne nehmen.

Schalten Sie das SUPERFUSION-System nach fünf Minuten auf kalziumarme Ringerlösung um und perfundieren Sie sie 25 bis 30 Minuten lang, um die Entfernung von überschüssigem Farbstoff zu ermöglichen, wobei die bipolare Zellbeladung und die Auswaschung abgeschlossen sind. Wir sind bereit, mit dem Patch-Clamping und der T-I-R-F-M-Bildgebung zu beginnen. Wechseln Sie nach Abschluss des Auswaschens die Elektrodenhalter, um eine Kontamination Ihrer Patch-Pipette mit Farbstoff zu vermeiden.

Platzieren Sie das Axonterminal in der Mitte des Sichtfeldes. Füllen Sie eine Patch-Pipette mit sieben Mikrolitern interner Lösung. Tippen Sie darauf, um Luftblasen zu entfernen.

Beschichten Sie es mit geschmolzenem Zahnwachs und montieren Sie es dann in den Mikromanipulator. Schalten Sie die Pipette auf und senken Sie die Pipette langsam auf das Präparat ab. Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand und nehmen Sie gegebenenfalls Korrekturen vor.

Wenn das Superfusionssystem so eingestellt ist, dass es die Ringerlösung kontrolliert, schaffen Sie als Nächstes eine Giga-Versiegelung zwischen der Pipette und der Zelle, indem Sie die Spitze der Elektrode leicht gegen den Zellkörper berühren. Wenn der Überdruck der Pipette ausgeschaltet ist, üben Sie vorsichtig Unterdruck auf die Elektrode aus, während sie versiegelt ist. Wählen Sie im Verstärker den Ganzzellenmodus und stellen Sie das Haltepotenzial der Zelle auf minus 60 Millivolt ein.

Verwenden Sie nun eine Bildgebungssoftware, um einen Bereich von Interesse auszuwählen, der das gesamte Axonterminal umfasst. Schalten Sie das Hellfeldlicht aus und setzen Sie die Klemme kurz dem 488-Nanometer-Laser aus. Finden Sie die richtige Fokusebene für die TIRF-Bildgebung.

Brechen Sie dann mit dem Zap-Befehl des Verstärkers in die Zelle ein, während Sie einen leicht negativen Druck auf die Pipette ausüben, um die Zellkapazität und den Serienwiderstand zu korrigieren. Und dann wenden Sie das Spannungsprotokoll an, während Sie die Bewegung der synaptischen Vesikel abbilden. Warten Sie zwischen den Versuchen mindestens 40 Sekunden, um eine Wiederherstellung zu ermöglichen.

Zuerst wählen wir eine Bipolarzelle in der Hellfeldmikroskopie. Dann zoomen wir hinein und beladen seinen Axonanschluss mit dem Fluoreszenzfarbstoff. Nach einer 30-minütigen Reinigung kann das geladene Terminal zusammen mit der Bewegung fluoreszierender glutamaterger Vesikel intermikroskopisch abgebildet werden.

Hier führen wir ein Rib-Eye-bindendes Peptid durch die Patch-Pipette ein, das es uns ermöglicht, die Position der synaptischen Bänder zu sehen, wenn sie mit einem 561-Nanometer-Laser abgebildet werden. Anschließend depolarisieren wir die Zellen und bilden die Vesikelbewegung mit dem 488-Nanometer-Laser ab. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie retinale Bipolarzellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff dissoziieren und belasten sowie diese Neuronen patchen, klemmen und gleichzeitig mit der Rasenmikroskopie abbilden können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen nicht zu stark dem Laser auszusetzen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.