Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Das ist also die erste Art von Perlen, die ich verwenden werde. Sie sind die blauen Gelperlen. Sie sind weich.

Also muss ich eine gepoolte Glaspipette am Ende einer Mundpipette verwenden, um diese Kügelchen auf Xs zu platzieren. Die zweite Art von Perle, die ich demonstrieren werde, sind Heparin-Acrylkügelchen. Es handelt sich um eine steife Art von Perle, und ich werde diese Perlen mit einer Wolframnadel auf X Explantate setzen. Das sind also die Glaskapillarrohre, die ich zuerst mit dem Bunsenbrenner schmelzen werde.

Dann ziehe ich sie, um eine feinere Spitze zu erzeugen. Also halte ich das Kapillarrohr in der Mitte der Flamme und rolle es, während das Rohr schmilzt. Ich spüre, wie es weich wird.

Ich hebe es aus der Flamme und ziehe es dann. Ich werde mit diesem diamantbestückten Stift eine Linie über das Kapillarrohr ätzen, damit ich einen schönen geraden Schnitt habe. Dann werde ich die Enden flammenpolieren, um es zu reinigen.

Ich werde die Kapillare durch die Flamme führen, um das Ende zu polieren und die Öffnung kleiner zu machen, damit sie eine Perle einfangen kann, anstatt dass die Perle durch die Kapillare geht. Wichtig zu beachten ist, dass Sie das Kapillarrohr nicht zu lange in der Flamme halten möchten. Es ist eigentlich ein sehr schneller Durchgang, sonst dichtet es ab.

Normalerweise mache ich mehrere davon, weil viele von ihnen dort herauskommen, wo die Spitze durch die Flamme versiegelt ist. Es ist schwer zu kontrollieren, also machst du einfach mehrere. Dies ist ein Beispiel für eines, bei dem die Spitze versiegelt wurde.

Dies ist ein Beispiel für eine gute Pipette. Ich habe 250 Mikroliter der Agel-Kügelchen in dieses Einor-Röhrchen pipettiert, und ich werde sie fünfmal mit einem Milliliter PBS waschen, um die Azi-Lösung zu entfernen, in der sie eingeweicht sind. Ich warte etwa drei Minuten, bis sich die Kügelchen abgesetzt haben, dann sauge ich das überschüssige PBS ab und wiederhole dies noch viermal.

Die Kügelchen haben sich noch nicht ganz abgesetzt, also haben sich die Kügelchen abgesetzt und ich werde das überschüssige PBS absaugen und dies viermal wiederholen. Und am Ende füge ich 300 Mikroliter des PBS hinzu und beginne mit den Kügelchen zu arbeiten. Dies ist eine Standard-Mundpipette und ich nehme einfach die Kapillare, die ich gezogen habe, und schiebe sie etwa ein Drittel des Weges nach oben.

Füllen Sie zunächst die Pipetten mit PBS. Es füllt sich in der Regel nur durch eine Kapillarwirkung. Das ist also ein Deckel von einer 30-Millimeter-Kulturschale und ich habe ein Tröpfchen Perlen in Blau gegeben.

Und daneben befindet sich ein kleines Tröpfchen PBS. Und in diesem Gericht befindet sich hier ein Fünf-Mikroliter-Tröpfchen Proteinlösung. In diesem Fall ist es B und P vier, aber Sie können ein Protein Ihrer Wahl mit der Mundpipette verwenden.

Ich werde eine Perle von diesem blauen Kreis hierher übertragen, spüle sie einmal in das Tröpfchen PBS. Dann nehme ich die Kugel mit der Mundpipette und lege sie in das Tröpfchen mit Proteinlösung und inkubiere sie entweder bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde oder vier Grad für mehrere Stunden. Da sehen Sie also einen Pool von Perlen in PBS und ich muss Perlen auswählen, die die richtige Größe haben.

Wenn sie zu klein sind, gehen sie einfach durch die Mundpipette. Sie müssen einfach am Ende sitzen. So, jetzt seht ihr, dass ich mir dort ein paar Perlen ausgesucht habe, drei größere Perlen und drei kleinere Perlen.

Ich werde die größeren Kügelchen im Experiment verwenden. Ich werde jetzt eine große Kugel aus dem Tröpfchen PBS auf das Tröpfchen der Proteinlösung übertragen. Und um das zu tun, ziehe ich meine Zunge vorsichtig von der Mundpipette weg.

Es ist keine Saugbewegung, sondern nur, um etwas negativen Druck auszuüben. Und dann übertrage ich es und lege dann im Grunde meine Zunge wieder über den Mund. Pfeifenkopf, der nicht bläst, sondern nur etwas positiven Druck ausübt, um den Beat vom Ende wegzudrücken.

Ich habe jetzt fünf Kügelchen in der Proteinlösung, und ich werde sie mehrere Stunden lang bei vier Grad inkubieren, oder alternativ bei Raumtemperatur für eine halbe Stunde bis eine Stunde. Das ist also die Kulturschale, die die Membran enthält, die im Medium schwebt, zusammen mit den Auberginen, die ich bereits seziert habe. Ich werde die Spitze meiner Pipette nehmen und etwas von dem Medium einsaugen.

Ich werde die Perlen nur einmal in einem Tröpfchen Medium abspülen, unmittelbar bevor ich die Perle auf den X-Plan lege. Dies sind die Wolframnadeln, die ich verwenden werde, um die Acrylperlen aufzunehmen und zu platzieren. Das ist die Wolframnadel und sie ist jetzt in ihrer Halterung.

Und das sind feine Zangen. In einem 45-Grad-Winkel. Ich werde meine Wolframnadel in einer Pinzette verwenden, um eine Perle aus diesem PBS-Pool zu heben und die Perle auf ein Tröpfchen Proteinlösung zu übertragen.

So wie ich es mit den Agelperlen gemacht habe. Wie bei den Agelperlen habe ich auch diese Acrylkügelchen fünfmal in PBS gespült und ein Tröpfchen auf diese Platte übertragen. Ich werde dann meine Wolframnadel in einer Pinzette verwenden, um eine Perle auf ein Tröpfchen Protein zu übertragen und zu inkubieren, genau wie ich es mit den Gelkügelchen getan habe.

Es ist also ein Anheben der Perle. Ich habe meine rechte Hand fest gegen den Tisch gedrückt und benutze meinen linken Zeigefinger, um die Nadel zu stabilisieren, während ich in die Flüssigkeit hinuntergehe, ich berühre leicht eine Perle mit einer Nadel und hebe sie langsam aus der Flüssigkeit heraus. Manchmal fällt es von der Nadel, also gehen Sie einfach zurück und holen Sie sich eine andere.

Jetzt habe ich mit meiner linken Hand die 45-Grad-Winkelzange. Mit den Spitzen nach unten berühre ich die Perle und die Nadel mit der Flüssigkeit und benutze sie. Drücke sie mit der Spitze der Pinzette vorsichtig einfach ab.

Jetzt habe ich also fünf Kügelchen in Protein. Okay, also mit meiner rechten Hand habe ich die Wolframnadel in der Perle, und meine linke Hand, meine Pinzette wieder mit der Spitze nach unten, so wie ich sie abstoße. Die vier, ich werde es hier auf dem x Explan noch einmal machen. Inkubieren Sie bei 37 Grad und die Zeit hängt vom jeweiligen Assay ab.