Name: Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Embryonen für elektrophysiologische Ableitungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der neuromuskulären Entwicklung in vivo.

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Teil 1: Ausrüstung und Zubehör <ol><li> Eine gute Dissektionsmikroskop ist für den Embryo Dissektionen erforderlich; 40-facher Vergrößerung wird vorgeschlagen, mit 25X Okulare bis maximal die Vergrößerung zu erhöhen. </li><li> Feine Pinzette (Nummer 5) sind für die manuelle Selektion von Embryonen und devitellinization von Embryonen erforderlich. </li><li> Ausrüstung zu machen und zu ändern gutes Glas Nadeln erforderlich ist. Gezogen-Glas-Nadeln sind für die Präparation erforderlich. Wir bevorzugen massivem Glas für die Präparation (länger), aber Standard dickwandigen Glasröhren (Außendurchmesser 1-1,5 mm) arbeitet als gut. Einige Leute benutzen feinen Wolfram-Nadeln, elektrolysiert, um die gewünschte Schärfe in ein Bad von 1M NaOH mit einem 10 + Amp Spartransformator Batterie. Geschärft Wolfram Dissektion Nadeln haben den Vorteil, dass sie relativ robust und langlebig sind. Hohlglas Nadeln (gebildet ähnlich Klemmelektroden Patch) sind Kunststoffschlauch befestigt und verwendet bei der Präparation für Saug-und Ausweisung von Kochsalzlösung, sowie die kontrollierte Abgabe von Leim. Eine Vielzahl von Glas-Abzieher sind für die Herstellung von Glas Nadeln. Computer-Programmierung Abzieher kann voreingestellt werden, um eine Vielzahl von Formen und Größen zu ziehen. Die Brown-Flaming Modelle (Sutter Instrument Co.) sind weit verbreitet begünstigt. Ein zusammengesetztes Mikroskop (20-40fach Objektiv) zur Verfügung stehen sollte untersuchen und verändern Elektroden vor dem Gebrauch. </li><li> Zwei Arten von Lösungen werden häufig verwendet, um die Bad embryonalen Gewebe während der Präparation: 1) &quot;Standard&quot; (Jan und Jan, 1976a) oder &quot;modifizierten Standardtarif&quot; (Broadie, 2000) Salinen, basierend auf Lösungen üblicherweise für die Aufnahme in andere wirbellose eingesetzt und 2) &quot;Hämolymphe-like&quot; (HL) Salinen (Stewart et al 1994), einen Kompromiss zwischen den Standard-Kochsalzlösung und die Ionenkonzentrationen in der Drosophila Hämolymphe gemessen. Es wird darauf hingewiesen, dass keines dieser Salinen genau imitieren die chemische Zusammensetzung der Hämolymphe in vivo (Broadie, 2000). Standard-Kochsalzlösung enthält (in mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl 2, 72 Saccharose, 5 TES, pH 7,2. Experimentatoren möchten vielleicht auch kommerziell hergestellte Insekten Kochsalzlösung (z. B. Schneider Insect Media), die ungeeignet für die elektrophysiologische Ableitung aber wahrscheinlich für die Gesundheit der exponierten Gewebe zu schützen, ist zu prüfen. </li></ol> Teil 2: Embryo Staging und Dissection <ol><li> Für eine optimale Eiersammlung, halten jung (&lt;7 Tage), gesunde männliche und weibliche Fliegen (20-40) auf frischen Verlegung Töpfe für 2-3 Tage. Legen Töpfen häufig bestehen aus 100 ml Kunststoffbecher (Tri-Pour) perforiert, um eine ausreichende Luftzirkulation, für eine 60 mm-Agar-Platte geben. Agar-Platten enthalten Apfel-oder Traubensaft mit Agar gehärtet. Einige Rezepte gibt, aber ein Beispiel ist wie folgt: 700 ml Wasser, 25-30 g Agar, 300 ml Saft-Konzentrat (Trauben-oder Apfel), 0,5 g Methylparaben (p-hydroxymethylbenzoate) und 30g Zucker. Autoclave das Wasser und Agar-Agar, und separat kochen p-hydroxymethylbenzoate mit dem Zucker und Saft. Mix der Agar-und Saft-Lösungen und schnell in 60 mm-Platten zu gießen, Entfernung von Blasen. </li><li> Vor Entnahme der Eizellen, sind Fliegen mit Hefepaste (7 Gramm Bäckerhefe in 9 ml Wasser bei 4 ° C gelagert) auf frische Platten, mindestens zweimal täglich für mindestens zwei Tage gewechselt zugeführt. Am Tag 3, sollte ein guter Topf produzieren 100-200 Eier pro Stunde. Bessere Eiablage befindet sich auf einem Topf auf die Seite mit dem Agar in eine Metallplatte geritzt gepflegt beobachtet. Viele Embryonen werden in gelegt werden oder neben dem Kratzer. </li><li> Zum Sammeln einer großen Anzahl von Embryonen, sanft Transfer der Embryonen von der Agarplatte in einen Korb mit einem Pinsel. Ein Korb kann mit einem 15 oder 50 ml Zentrifugenröhrchen erfolgen. Schneiden Sie den unteren, wobei genügend Fläche, um einen Bildschirm (70 um Maschenweite) zwischen dem Deckel und dem oberen Ende des Röhrchens Falle. Spülen Sie die Embryonen mit dH 2 0 und in einer Petrischale mit frischem 50% bis 100% Bleichmittel auf die äußere Chorion zu entfernen. Alternativ können Eier einzeln gesammelt werden mit feinen Pinzetten und dechorionated, indem man sie manuell in einen Tropfen Bleichmittel. De-chorionation kann von 30 Sekunden bis 2 Minuten (frische Bleiche ist viel schneller) zu nehmen, und sollte unter der Dissektionsmikroskop überwacht werden. Die Entfernung des Chorion macht die glänzenden, transparent Dotterhaut. Dechorionated Eier sollten kurz abgespült werden, oder die in Kochsalzlösung, als Bleichmittel schnell zerstört devitellinized Gewebe. </li><li> Es ist wichtig, sorgfältig zu Embryonen, um die gewünschte Entwicklungsalter. Die definierten Drosophila Embryonalstadien (1-17; Campos-Ortega und Hartenstein, 1985) sind nicht sinnvoll, da alle funktionellen neuromuskulären Entwicklung tritt im späten Stadium 16 oder Stufe 17. So Embryonen werden von Entwicklungs-Stunden inszeniert bei 25 ° C in einem befeuchteten Inkubator, in Stunden nach der Befruchtung oder, häufiger, nach der Eiablage (AEL). Unter diesen Bedingungen dauert der Embryogenese 21 + / - 1 Stunde bei 25 ° C. </li><li> Eier von einer zeitlich Ei-lay (1-2 Std.s), die entsprechend gealtert sind als nächstes für morphologischen Kriterien angesehen. Nach gründlichem Waschen in dH 2 O, sind die dechorionated Eier in einer Kunststoff-Petrischale (unter dH 2 O) für die Anzeige platziert. Richtig Inszenierung kann mit morphologischen Kriterien mit reflektierte Licht mit einem Dissektionsmikroskop (Campos-Ortega und Hartenstein, 1985) bestätigt werden. Ältere im Spätstadium Embryonen (22-24h AEL) am Rande der Schlupf in der Regel durch die Segmentierung der Kutikula und aufgeblasen Luftröhre anerkannt. Embryonen können auch genotypisiert mit GFP-Balancer und ein Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop mit geeigneten Filtern werden. </li><li> Für Dissektion sind dechorionated und entwicklungspolitisch inszeniert Embryonen beigefügt (Rückenseite nach oben) auf einem Deckglas unter einem Tropfen Kochsalzlösung (siehe Schritt 1.5). Die Embryonen werden von der Dotterhaut durch Punktion der Membran in der Nähe der vorderen oder hinteren Ende mit einem Glas-Mikropipette oder Wolfram Nadel, und dann vorsichtig die Befreiung der Embryo aus der Membran entfernt. In Vorbereitung für die Präparation, sollte der Embryo auf dem Deckglas mit der dorsalen Fläche nach oben (dorsal bis Dissektion wird das ventrale Nervensystem und neuromusculature für Experimente aussetzen positioniert werden. Doch der Embryo kann natürlich auch auf andere Weise positioniert werden, um Zugang zu anderen zu erleichtern Gewebe.) </li><li> Embryonen im Frühstadium (&lt;16 Stunden AEL) direkt an Glas oder Glas mit Polylysin (Poly-L-Lysin-Hydrobromid; Broadie und Bate, 1993a, b) beschichtet reinigen. Ältere Embryonen (&gt; 16 Stunden AEL), folgende Nagelhaut Bildung muss geklebt werden, ideal für Sylgard-beschichtet (Dow Corning) Deckgläser. Ein Wasser-Polymerisation von Cyanacrylat chirurgische oder tierärztliche Klebstoff verwendet wird (Broadie und Bate, 1993c, d). Der Leim wird durch einen kleinen Glaselektrode Pipette (10-20 Mikrometer Innendurchmesser Spitze) an einen Gummischlauch mit dem Leimfluss durch den Mund Druck gesteuert ausgeliefert. Es muss während der Leim Lieferung genommen werden, da der Kleber polymerisiert schnell bei Kontakt mit der Salzlösung. Beachten Sie auch, dass Kleben nicht in Kochsalzlösung mit keinen oder geringen zweiwertigen Ionen-Konzentrationen durchgeführt werden, wie der Klebstoff erfordert zweiwertige Ionen zu polymerisieren. Kleine Mengen von Klebstoff werden zuerst verwendet werden, um fest an den Kopf und Schwanz. </li><li> Nachdem die Enden der Embryo in die Deckglas geklebt wird ein Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einer Glaselektrode oder geschärft Wolframnadel gemacht. Dies wird dadurch erleichtert, indem Sie vorsichtig Perforieren der Schnittführung vor dem endgültigen Schnitt. Die Seiten des Einschnitts werden dann auf das Deckglas mit mehr geklebt, sanft verteilen Embryo flach. Die inneren Organe einschließlich des Darms, Fettkörper und, optional, Luftröhre werden dann durch Absaugen mittels einer Glaspipette an Gummischlauch (Broadie und Bate 1993a-c) entfernt. Der Embryo ist jetzt angebracht flach auf dem Deckglas werden, Epidermis sich mit der Bauchseite des zentralen Nervensystems, der peripheren Nerven und somatische Muskulatur für Experimente ausgesetzt. </li></ol>

Präzise Inszenierung von Embryonen ist kritisch aufgrund der schnellen Reifung der funktionellen Eigenschaften über den zeitlichen Verlauf von nur einigen Stunden. Mehrere Probleme erschweren diese Inszenierung. Erstens verwenden die meisten Forscher timed Eier legt, um Embryonen, sondern die Eiablage Zeit enorm variieren von Tier zu Tier unter verschiedenen Bedingungen (Broadie et al. 1992). Insbesondere neigen Frauen auf eine begrenzte Diät, um befruchtete Eier über einen längeren Zeitraum vor der Verlegung zu behalte...

<table><tbody><tr><td>Embryokollektionskäfige</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (für 60-mm-Schale; andere Größen erhältlich)</td><td>Käfige können auch selbst hergestellt werden, z. B. aus perforierten Dreihalskolben, wie im Video gezeigt</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Erhältlich bei verschiedenen Unternehmen</td><td>Chirurgischer Kleber haftet besser auf mit Sylgard beschichteten Deckgläsern</td></tr><tr><td>Feines Glasrohr, Außendurchmesser 1,0–1,5 mm</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Zum Ziehen feiner Glasnadeln für die Dissektion und von Röhrchen zur Kleberapplikation</td></tr><tr><td>Plastikschläuche, zum Anschluss an Glaspipette für Mundabsaugung und Kleberauftrag</td><td>Tygon</td><td></td><td>Der Innendurchmesser des Schlauchs muss dem Außendurchmesser des Glases entsprechen.</td></tr></tbody></table>

ernte und vorbereitung drosophila embryonen für die elektrophysiologische ableitung und andere verfahren

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila ist ein führender genetisches Modell für die Untersuchung der beiden embryonalen Entwicklung und funktionelle Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Felder ganz von einander getrennt, mit weitgehend unabhängigen Geschichten und Wissenschaft. Allerdings ist die Schnittstelle zwischen diesen in der Regel unterschiedliche Felder der Entwicklungsprogramme zugrunde liegenden Erwerb von funktionellen elektrischen Signal-Eigenschaften und die Differenzierung von funktionellen chemischen Synapsen während der letzten Phasen der neuronalen Schaltkreis Bildung. Diese Schnittstelle ist ein äußerst wichtiges Gebiet für die Untersuchung. In Drosophila treten diese Phasen der funktionalen Entwicklung über einen Zeitraum von &lt;8 Stunden (bei ​​25 ° C) während des letzten Drittels der Embryogenese. Diese späte Entwicklungsphase galt lange Zeit als unlösbar zu Ermittlungen wegen der Ablagerung von einem harten, undurchlässigen epidermale Kutikula. Ein Durchbruch Fortschritt war die Anwendung von Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber, die lokal an der Nagelhaut kann angewendet werden, um kontrollierte Präparation des Late-Stage-Embryonen zu ermöglichen. Mit einem dorsalen Längsschnitt, kann der Embryo flach gelegt werden, Freilegung der Bauchmark und Körper Wand Muskulatur experimentelle Untersuchung. Dieses System wurde stark genutzt zu isolieren und zu charakterisieren genetische Mutanten, die embryonale Synapsenbildung beeinträchtigen und damit zeigen, die molekularen Mechanismen, über die Spezifikation und Differenzierung von Synapsen-Verbindungen und funktionelle synaptische Signalisierung Eigenschaften.

Diese Technik macht die Drosophila embryonale neuromusculature für die Immunhistochemie oder elektrophysiologische Ableitung. Es ist für das Studium frühen Ereignisse in neuromuskulären Entwicklung oder Durchführung Elektrophysiologie in Mutanten, die nicht brüten können nützlich.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila ist ein herausragendes genetisches Modell für die Untersuchung sowohl der Embryonalentwicklung als auch der funktionalen Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Bereiche recht ...

Um elektrophysiologische Ableitungen an Drosophila-Embryonen durchzuführen, müssen diese zuerst geerntet, koordiniert und präpariert werden. Mithilfe eines wasserhärtenden chirurgischen Klebers, der die Embryonen auf Deckgläsern stabilisiert, wird eine kontrollierte Präparation ermöglicht. Anschließend werden die inneren Organe der stabilisierten Embryonen entfernt, um das ventrale ZNS, die peripheren Nerven und die somatische Muskulatur freizulegen. Hallo, ich bin Dave Featherstone vom Department für Biowissenschaften hier an der University of Illinois in Chicago.Hallo, ich bin Ton aus dem Labor von Dave Featherstone am Department für Biowissenschaften der University of Illinois in Chicago. Heute zeigen wir Ihnen, wie man späte Embryonen von Joof sammelt und manuell disseziert. Wir verwenden dieses Verfahren im Allgemeinen im Labor, um elektrophysiologische Tests zur Untersuchung der Entwicklung und Funktion des neuromuskulären Systems von Joof vorzubereiten, die ich Ihnen in einer weiteren anstehenden Jo Ova-Präsentation zeigen werde.Beginnen wir also. Dieses Protokoll startet mit der Sammlung von Embryonen, einem gängigen Verfahren, das in einer Vielzahl von JoVE-Experimenten verwendet wird und das wir nun überprüfen werden. Stellen Sie eine Mischung aus 20 bis 40 jungen männlichen und weiblichen Fliegen in einem Legigefäß zusammen.Stellen Sie sie in eine befeuchtete Kammer bei 25 Grad Celsius. Um das Entwicklungsstadium des Embryos genau abschätzen zu können, sollten Temperatur und Luftfeuchtigkeit konstant gehalten werden. Obwohl kommerzielle Legeschalen erhältlich sind, können diese auch aus perforierten 100-mL-Plastikbechern hergestellt werden, die auf 60-mm-Äpfelbohrplatten passen.Das Rezept für den Apfelbohrer ist in dem schriftlichen Protokoll zu finden. Perforationen im Becher können mit einer erhitzten Sonde angebracht werden und sollten kleiner sein als erwachsene Fliegen. Die Platten werden mit einer Portion Hefepaste ergänzt, die die Weibchen dazu anregt, viele Eier abzulegen; mischen Sie Hefe und Wasser zu einer konsistenzähnlichen Erdnussbutter und verteilen Sie diese mit einem Spatel auf den Platten.Wechseln Sie die Platte zweimal täglich und klopfen Sie die Fliegen von der Platte ab. Nun kann ich eine neue Platte aufsetzen, die zurück in den Inkubator kommt. In der Zwischenzeit kann ich überprüfen, wie viele Eier bis zum dritten Tag hier abgelegt wurden.Ein gutes Gefäß sollte 100 bis 200 Eier pro Stunde produzieren, wobei die höchste Eiablage zwischen Tagesanbruch und spätem Vormittag erfolgt. Um die Sammlung zu vereinfachen, sollten Kratzer oder Kerben mit einem Meißel in die Sammelplatte der Schnecke eingebracht werden, da die meisten Eier in oder neben diesen Kratzern abgelegt werden. Den Fliegen wird für ein bis zwei Stunden Zeit zur Eiablage gegeben, sodass Embryonen im späten Entwicklungsstadium gewonnen werden können; dieser Zeitraum kann jedoch je nach Experiment variieren.Die Methoden zur Sammlung von Embryonen variieren ebenfalls je nach der Anzahl an Embryonen, die für das Experiment benötigt werden. Für die Dissektion und Elektrophysiologie werden vergleichsweise wenige Embryonen benötigt, die in diesem Fall vorsichtig mit feinen Pinzetten von den Platten aufgenommen werden können. Um das äußere Chorion zu entfernen, spülen Sie die Embryonen mit destilliertem Wasser ab und geben Sie sie in eine Schale, die frisches 50 bis 100 %iges Bleichmittel enthält; überwachen Sie die Embryonen dabei unter einem Stereomikroskop.Nach 30 bis 120 Sekunden löst sich die Chorion und gibt die glänzende, transparente Vitellinmembran frei. Da Bleichmittel die vitellinisierten Gewebe schnell zerstören kann, sollten die entchlorinierten Eier kurz gespült oder in Salzlösung gegeben werden. Legen Sie die entchlorinierten Eier in eine Kunststoffkulturschale, die destilliertes Wasser enthält.Zu diesem Zeitpunkt können sie visuell genotypisiert werden, indem nach GFP-Markern mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop und geeigneten Filtern gesucht wird; nach der Sortierung der gewünschten Exemplare wird mit der Dissektion fortgefahren. Da die Embryonen zu klein für Dissektionsnadeln sind, ist eine gewisse Vorbereitung erforderlich. Ältere Embryonen mit entwickelter Cuticula müssen mit Cyanoacrylat-Chirurgie- oder Veterinärkleber – auch bekannt als histo aal – auf soagarbeschichtete Deckgläser geklebt werden.Blau eignet sich gut, da es bei Kontakt mit einer Lösung, die zweiwertige Ionen enthält, polymerisiert. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie ein gewünschtes Embryo unter einem Tropfen Salzlösung mit der dorsalen Seite nach oben auf einen mit Zigarrenlack beschichteten Deckglas übertragen. Entfernen Sie die Vitellinmembran, indem Sie mit einer Glas-Mikropipette oder einer Wolframelektrode einen kleinen Schnitt in die Membran machen.Dann lösen Sie das Embryo vorsichtig von der Membran. Embryonen im frühen Entwicklungsstadium heften sich direkt an sauberes Glas oder an mit Poly-L-Lysin beschichtetes Glas. Ältere Embryonen befestigen Sie an mit Sardinen beschichteten Deckgläsern, indem Sie chirurgischen Kleber über eine kleine Glaspipette, die an einen Gummischlauch angeschlossen ist, zuführen.Der Kleberfluss wird mit dem Mund gesteuert. Verwenden Sie kleine Mengen Kleber, um Kopf und Schwanz fest zu verbinden. Gehen Sie dabei vorsichtig vor, da der Kleber in der Salzlösung schnell aushärtet.Um das stabilisierte Embryo zu dissezieren, perforieren Sie vorsichtig eine Linie entlang der dorsalen Mittellinie mit einer Glas-Elektrode oder einer angespitzten Wolframnadel. Verwenden Sie dasselbe Werkzeug, um einen Schnitt durch die Perforationen zu führen. Dabei ist es entscheidend, dass die Dissektionsnadel stets in einem flachen Winkel gehalten wird, um die ventrale Neuromuskulatur nicht zu beschädigen.Entfernen Sie anschließend die inneren Organe vorsichtig durch Absaugen mit einer Glaspipette, die an einen Gummischlauch angeschlossen ist. Spreizen Sie das Embryo flach aus, indem Sie weiteren Kleber verwenden, um die Ränder des Schnitts auf dem Deckglas zu befestigen. Sobald alle inneren Organe abgesaugt sind, sind das ventrale zentrale Nervensystem, die peripheren Nerven und die somatische Muskulatur für Experimente zugänglich.An diesem Punkt ist das Embryo bereit für elektrophysiologische Ableitungen oder kann für die Immunhistochemie fixiert und anschließend mit herkömmlichen Techniken mikroskopisch untersucht werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man spätere Stadien bis hin zu weicheren Embryonen isoliert und präpariert. Die Anwendung von Operationskleber und die Präparation der Embryonen werden zunächst frustrierend sein, aber es gibt keine geheimen Tricks.Sie müssen über mehrere Wochen hinweg durch Übung die Feinmotorik entwickeln, aber allmählich wird der Anteil erfolgreicher Präparationen zunehmen. Bitte sehen Sie sich unser anderes Geo-Video an, das die Aufzeichnungskonfigurationen von Muskelzellen und motorischen Neuronen im Detail zeigt. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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