Name: Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie elektrophysiologische Aufzeichnungen an Muskeln und Motorneuronen in Drosophila-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Funktionen und neuronaler Entwicklung.

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Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen erfordert die manuelle Manipulation und Präparation. Die Gesundheit der Vorbereitung und konsequente Qualität der Aufnahmen, hängt von einer in der Lage, schnell und sauber vorbereiten fragile embryonalen Gewebe für die Aufnahme, und führen Sie dann das Experiment. Experimentatoren sollten in beiden embryonalen Dissektionen und Patch-Clamp-Elektrophysiologie beherrschen, bevor Sie beides auf einmal anzugehen. Die Aufnahmen k...

elektrophysiologische aufzeichnung in der drosophila embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila ist ein führender genetisches Modell für die Untersuchung der beiden embryonalen Entwicklung und funktionelle Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Felder ganz von einander getrennt, mit weitgehend unabhängigen Geschichten und Wissenschaft. Allerdings ist die Schnittstelle zwischen diesen in der Regel unterschiedliche Felder der Entwicklungsprogramme zugrunde liegenden Erwerb von funktionellen elektrischen Signal-Eigenschaften und die Differenzierung von funktionellen chemischen Synapsen während der letzten Phasen der neuronalen Schaltkreis Bildung. Diese Schnittstelle ist ein äußerst wichtiges Gebiet für die Untersuchung. In Drosophila treten diese Phasen der funktionalen Entwicklung über einen Zeitraum von &lt;8 Stunden (bei ​​25 ° C) während des letzten Drittels der Embryogenese. Diese späte Entwicklungsphase galt lange Zeit als unlösbar zu Ermittlungen wegen der Ablagerung von einem harten, undurchlässigen epidermale Kutikula. Ein Durchbruch Fortschritt war die Anwendung von Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber, die lokal an der Nagelhaut kann angewendet werden, um kontrollierte Präparation des Late-Stage-Embryonen zu ermöglichen. Mit einem dorsalen Längsschnitt, kann der Embryo flach gelegt werden, Freilegung der Bauchmark und Körper Wand Muskulatur experimentelle Untersuchung. Whole-Cell-Patch-Clamp-Techniken kann dann eingesetzt werden, um von individuell identifizierbaren Neuronen und somatischen Muskeln aufzuzeichnen. Diese Aufnahme-Konfigurationen verwendet worden, um das Aussehen und die Reifung der Ionenströme und Aktionspotential Ausbreitung in beide Neuronen und Muskeln zu verfolgen. Genetische Mutationen nicht diese elektrischen Eigenschaften charakterisiert worden, um die molekulare Zusammensetzung von Ionenkanälen und damit verbundene Signal-Komplexen zeigen, und um die Erforschung der molekularen Mechanismen der funktionellen Differenzierung zu beginnen. Ein besonderer Schwerpunkt ist die Montage von synaptischen Verbindungen, sowohl in das zentrale Nervensystem und Peripherie. Die glutamatergen neuromuskulären Synapse (NMJ) ist am leichtesten zugängliche, eine Kombination von optischen bildgebenden und elektrophysiologischen Aufzeichnung. Ein Glas Saugelektrode wird verwendet, um die peripheren Nerven zu stimulieren, mit exzitatorischen Kreuzung Strom (EJC) Aufnahmen in der Spannungs-geklemmt Muskel gemacht. Diese Aufnahme wurde die Konfiguration verwendet werden, um die funktionale Differenzierung der Synapse-Chart, und verfolgen Sie das Aussehen und die Reifung der präsynaptischen Freisetzung von Glutamat Eigenschaften. Darüber hinaus können postsynaptischen Eigenschaften unabhängig über iontophoretischen oder Druck-Anwendung von Glutamat untersucht direkt auf den Muskel Oberfläche, um das Aussehen und die Reifung der Glutamat-Rezeptor-Felder zu messen. So können sowohl prä-und postsynaptischen Elemente einzeln oder in Kombination während der embryonalen Synaptogenese überwacht werden. Dieses System wurde stark genutzt zu isolieren und zu charakterisieren genetische Mutanten, die embryonale Synapsenbildung beeinträchtigen und damit zeigen, die molekularen Mechanismen, über die Spezifikation und Differenzierung von Synapsen-Verbindungen und funktionelle synaptische Signalisierung Eigenschaften.

Elektrophysiologischen Ableitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen erlauben Analysen der Entwicklung von Muskel-und Neuron elektrische Eigenschaften, sowie die Charakterisierung der funktionellen Synaptogenese im glutamatergen neuromuskulären Synapse und zentralen cholinergen und GABAergen Synapsen.

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Drosophila ist ein herausragendes genetisches Modell für die Untersuchung sowohl der embryonalen Entwicklung als auch der funktionalen Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Fachbereiche recht ...

Elektrophysiologische Ableitungen von Muskeln und Motoneuronen können von einer ordnungsgemäß präparierten Körperwand eines Oph-Embryos erhalten werden. Die Muskeln 6, 7, 12 oder 13 können einfach mittels Ganzzell-Ableitung konfiguriert werden, und robuste Ströme mit kleiner Amplitude können nach Herstellung einer Gigaseal-Ableitung an der neuromuskulären Verbindung gemessen werden. Eine Saugelektrode kann verwendet werden, um einen motorischen Nerv in der Nähe der Austrittsstelle aus dem ZNS anzusaugen und präsynaptische Reize zu liefern, während gleichzeitig die Ganzzellströme im postsynaptischen Muskel gemessen werden.Alternativ kann eine Pipette verwendet werden, um erregende Neurotransmitter nahe der Ableitelektrode über Iontophorese oder Druckeinspritzung zuzuführen. Hallo, ich bin Ton aus dem Labor von Dave am Department für Biowissenschaften der University of Illinois in Chicago. Heute werde ich Ihnen die elektrophysiologische Ableitung der neuromuskulären Verbindung im Embryonalstadium sowie der zentralen Neuronen zeigen.Mit diesen Verfahren untersuchen wir die Funktion und Entwicklung des neuromuskulären Systems von Joof. Diese Techniken wurden ursprünglich von Kendall Brody entwickelt, dann an David Fit Stone weitergegeben und schließlich an mich. Heute gebe ich sie an Sie weiter.Dieses Verfahren setzt voraus, dass die Embryonen im Voraus korrekt geerntet und präpariert werden. Um zu sehen, wie dies durchgeführt wird, betrachten Sie die begleitende Veröffentlichung von Jo, Brody Featherstone und Chen. Elektrophysiologische Ableitungen von embryonalen Muskeln und Neuronen der Jossa nutzen Standard-Whole-Cell-Patch-Clamp-Techniken. Zunächst wird der präparierte Embryo in eine kleine Plexiglas-Ableitkammer gegeben.Der Bereich für die Physiologie-Aufzeichnung ist durch einen Faradayschen Käfig elektrisch abgeschirmt und auf einem vibrationsgedämpften Tisch platziert. Die Kammer wird im Durchlicht mit einem aufrechten Compound-Mikroskop mit KY-Optik und einem 40x-Objektiv mit großer Arbeitsdistanz für Wassereintauchung betrachtet. Objektivaufzeichnungen werden üblicherweise unterhalb der Raumtemperatur durchgeführt, da es mit steigender Temperatur zunehmend schwieriger wird, Oph-Muskeln mit der Patch-Clamp-Technik zu untersuchen.Die Aufnahmeelektrode sollte einen Endwiderstand von fünf bis 10 Megaohm aufweisen und bis zu einem inneren Durchmesser von etwa einem Mikrometer thermisch poliert werden. An der Spitze werden die Aufnahmeelektroden rückgefüllt mit einer physiologischen Lösung, die Kaliumchlorid und Saccharose enthält. Ein versilberter Chlorid-Elektrodendraht wird in das Bad mit Standard-Salzlösung gelegt, die auch bei der Embryodissektion verwendet wird.Die Signale werden mithilfe eines Patch-Clamp-Verstärkers verstärkt, digital gefiltert und zur späteren Analyse gespeichert. Jedes für Patch-Clamp-Experimente geeignete System kann verwendet werden, wie beispielsweise die Geräte und Software von Axon. Instrumente ermöglichen es nun, Zellen aus drei verschiedenen Geweben des embryonalen Nervensystems zu stimulieren und von den Muskeln, Neuronen an der NMJ und zentralen Motoneuronen abzuleiten.Mit dieser Embryopräparation können bei den meisten Experimenten sämtliche embryonalen Muskeln abgeleitet werden. Konzentrieren Sie sich auf die Gruppe der vier longitudinalen ventralen Muskeln 6, 7, 12 und 13, insbesondere auf Muskel 6 im vorderen Abdomen, zwei bis drei zur Ableitung von den dorsalen Muskeln. Der Embryo muss dorsal nach unten gerichtet verklebt und bei jungen Embryonen entlang der ventralen Mittellinie präpariert werden.Bevor die Muskelableitung erfolgt, ist keine enzymatische Behandlung erforderlich. Bei späteren Embryonen mit entwickelten Cuticula bildet sich jedoch vor der Patch-Ableitung auch eine Muskelhülle aus. Diese muss durch kurzes Eintauchen in eine Kollagenase entfernt werden.Die meisten Ableitungen werden in der Ganzzell-Ableitungskonfiguration durchgeführt, die leicht aus dem zellangehefteten Zustand durch leichten Saugdruck oder einen elektrischen Impuls erreicht wird. Das ist ein kurzer elektrischer Reiz. Es handelt sich um eine elektrische Stimulation, die bekanntermaßen die Zellmembran zum Platzen bringt.Ein Ganzzell-Aufbau: Die Abschlusswiderstände an der Muskulatur liegen typischerweise über einem Gigaohm; Ganzzellströme werden üblicherweise innerhalb von weniger als drei Minuten nach der Bildung des Abschlusses erhalten. Der Serienwiderstand erhöht sich in den meisten Fällen deutlich, und die Zellen können eine erhöhte Leckage entwickeln. Für das Patch-Clamp-Verfahren müssen die Embryonen mindestens 14 Stunden alt sein, da frühere Entwicklungsstadien ungeeignet sind.Umfangreiche elektrische Kopplung zwischen Myotuben führt dazu, dass Spannungsclamping ungenau ist, um Patch-Clamp-Aufnahmen von Muskelzellen durchzuführen. Typische Haltepotentiale liegen zwischen minus 60 und minus 80 Millivolt, und sowohl Spannungsclamping- als auch Stromclamping-Methoden können verwendet werden. Erfolgreiche Ganzzell-Aufnahmen bei minus 60 Millivolt gehen mit robusten spontanen synaptischen Strömen einher, die von wenigen bis zu mehreren hundert Pikoampere reichen, wie hier dargestellt. Große NMJ-Ströme können durch Stimulation des motorischen Nervs mit Saug-Elektroden hervorgerufen werden. Diese können aus einer Vielzahl von fasergefüllten Glaselektroden gezogen werden und sollten zur Erzielung der gewünschten Konfiguration mit sanftem Unterdruck am Pipettenzieher ein kurzes Segment des entsprechenden segmentalen motorischen Nervs nahe dem Austrittspunkt des ZNS aufnehmen. Um eine enge Abdichtung zu bilden, eignet sich eine kurze Stimulation mit einer experimentell bestimmten Intensität, üblicherweise zwischen ein und fünf Volt, am besten. Eine zuverlässige Stimulation wird erreicht, indem die Reizstärke um ein bis zwei Volt über der experimentell bestimmten Schwelle eingestellt wird.Postsynaptische NMJ-Glutamatrezeptoren können aktiviert werden, indem der Neurotransmitter Glutamat angewendet wird; geladene Moleküle wie Glutamat können mittels Iontophorese an die NMJ abgegeben werden. Pipetten mit hohem Widerstand werden verwendet, um Rezeptoren abzubilden, und Pipetten mit niedrigerem Widerstand, um die gesamte Glutamatrezeptorantwort abzuschätzen. Iontophorese-Pipetten werden mit einer 100 Millimolar-L-Glutamat-Lösung beladen.Um den L-Glutamat freizusetzen, verwenden Sie einen kurzen Puls negativen Stroms mit einem kleinen positiven Rückstrom, um ein Austreten von Glutamat oder anderen ungeladenen Molekülen zu verhindern. Glutamat oder jedes ungeladene Molekül kann auch mittels Druckeinspritzung an die NMJ abgegeben werden. Verwenden Sie für die Druckeinspritzung ein bis zwei Millimolar Glutamat und applizieren Sie eine äußere Kraft von fünf bis 10 PSI auf die Pipette, unter Verwendung eines Pico-Spritzers.Die durch Nervenstimulation oder Glutamatapplikation bei minus 60 Millivolt hervorgerufenen NMJ-Ströme liegen typischerweise zwischen 1500 und 2000 Pikoa mpere. Viele embryonale Neuronen können einzeln anhand ihrer Soma-Position und der Morphologie ihrer Projektionen identifiziert werden. Die meisten experimentellen Ableitungen konzentrierten sich auf eine Gruppe von fünf oberflächlichen dorsalen Neuronen im embryonalen ventralen Nervenstrang.Um von diesen Neuronen aufzuzeichnen, muss die Neuromascheide des ventralen Nervenstrangs durch eine kurze fokale Behandlung mit Protease entfernt werden. Die Zellkörper werden entscheibt, indem 0,5 bis 1 % Protease im Aufzeichnungsverfahren über eine Patch-Pipette mit großem Durchmesser zugegeben werden, mit der das Scheidenmaterial in die Pipette, die die Protease enthält, hineingesaugt wird. Sanfte Mundabsaugung kann verwendet werden, um das Scheidenmaterial wiederholt in die Pipette hinein und heraus zu bewegen. Nach einer bis zwei Minuten platzt die Scheide.Die Zellen liegen nun für das Ganzzell-Patch-Clamp-Verfahren frei. Dieses Aufnahmeparadigma erfordert nicht, dass Salzlösung zirkuliert oder erwärmt wird. Die äußere Aufnahmesalzlösung bei dieser Präparation unterscheidet sich von derjenigen, die bei der Ableitung von Muskeln verwendet wird.Die Patch-Pipette kann mit Lucifer Yellow beladen werden, um später die Position und Morphologie der Patch-Zelle zu visualisieren. Hier ist ein zentrales Motoneuron, das Lucifer Yellow aufgenommen hat und mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wurde. Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufnahmen werden bei Haltepotentialen von minus 60 Millivolt bei 18 Grad Celsius durchgeführt.Aufzeichnungen im Strom-Klemm-Modus sind ebenfalls möglich. Neuronen können mit den Neurotransmittern Acetylcholin oder GABA stimuliert werden. Diese werden am Zellkörper mithilfe der Iontophorese oder Druckeinspritzung appliziert, wie auch bei Ableitungen von NJS. Nachdem eine Ganzzellverbindung hergestellt wurde, werden zunächst spontane Ströme beobachtet. Dies ist eine Minute Rohdaten, die von einem embryonalen ventralen longitudinalen Muskel sechs erhalten wurden, der bei minus 60 Millivolt im patch-clamp-Modus und ohne Stimulation gehalten wurde. Eine gesunde Präparation zeigt typischerweise starke spontane synaptische Aktivität, die hier durch die zahlreichen nach unten gerichteten Stromabweichungen dargestellt ist.Hier sind Daten vom selben Muskel mit Stimulation, die mithilfe einer Saugpipette an dem zum Muskel führenden motorischen Nerv angewendet wurde. Dies führte zu mehreren abwärts gerichteten Ausschlägen des Stroms, die evozierte synaptische Ströme oder EJC darstellen. Dies sind Daten vom selben Muskel, der durch einen Millimolar Glutamat reiz wurde, das mittels Druckausstoß appliziert wurde.Der Glutamat öffnet Rezeptoren, die zu starken nach unten gerichteten Ausschlägen führen. Im vorliegenden Fall sind zwei Spuren dargestellt, die zwei aufeinanderfolgende Applikationen von Glutamat repräsentieren. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man elektrophysiologische Ableitungen von spätstadiigen Geo-Soft-Embryonen durchführt; elektrophysiologische Ableitungen werden im Allgemeinen mit standardmäßigen Patch-Clamp-Techniken durchgeführt, die hier nicht näher beschrieben werden können.Im Idealfall hat jede Person, die an Ihren weichen Embryonen Ableitungen vornehmen möchte, die Patch-Clamp-Technik bereits an einer einfacheren Präparation erlernt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Isolierung von ganzen Gehirnen von adulten Drosophila in Vorbereitung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen mit Standard ganzen Zelle-Technologie. Es enthält Bilder von GFP-markierten Zellen und Neuronen während der Aufnahme angesehen.

Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Diese Technik macht die Drosophila embryonale neuromusculature für die Immunhistochemie oder elektrophysiologische Ableitung. Es ist für das Studium frühen Ereignisse in neuromuskulären Entwicklung oder Durchführung Elektrophysiologie in Mutanten, die nicht brüten können nützlich.

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Dieses Protokoll beschreibt extrazellulären Aufnahme der Aktionspotentialantworten durch labellar Geschmack Neuronen in Drosophila gefeuert.

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Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

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