Name: Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Lernen Sie eine sichere Methode zur Protein-Färbung in Polyacrylamid-Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel oder Essigsäure. Dieses Protokoll ermöglicht eine klare Visualisierung von Proteinbanden bereits nach einer Minute.

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Wir möchten die technische Unterstützung von Ines Racke anzuerkennen.

Teil 1: Vorbereitung der CBB Färbelösung <ol><li> 60-80 mg der CBB G-250 werden in 1 Liter bidestilliertem Wasser unter Rühren für 2-4 Stunden gelöst. Schließlich wird mit 3 ml konzentrierter HCl auf den dunkelblauen Lösung unter Rühren für eine weitere Minute hinzugefügt und im Dunkeln aufbewahrt für eine spätere Verwendung. Die Lösung kann für mehrere Wochen aufbewahrt werden bis zu mehreren Monaten, ohne seine Färbung Effizienz. </li><li> Konzentrierte HCl sollte mit der üblichen Sorgfalt und unter einer Abzugshaube verwendet gehandhabt werden. Die endgültige Lösung wird auf ca. pH 2, so sollten Handschuhe benutzt werden und jede Berührung mit der Haut sollte vermieden werden. </li></ol> Teil 2: SDS-PAGE <ol><li> Entsprechende Aliquots der Protein-Proben werden mit Ladepuffer auf eine Endkonzentration von 1x Ladepuffer gemischt. Wir verwenden 2x Ladepuffer mit 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 bei 25 ° C), 2 mM EDTA, 4% SDS, 200 mM DTT, 0,02% Bromphenolblau und 50% Glycerin. Weitere Lade-Puffer für SDS-PAGE können ebenso verwendet werden. </li><li> Protein-Proben werden für ca. 5 min vor dem Laden erwärmt. Inzwischen ist der Gel-Elektrophorese Kammer für den Lauf vorbereitet. Wir verwenden vorgefertigte 4-12% NuPAGE © Bis-Tris Gele (Invitrogen) in einer XCell SureLock ® Mini-Cell (Invitrogen) mit MES-Puffer als Laufpuffer aber jede andere Gels und Elektrophorese-System kann ebenso verwendet werden. </li><li> Protein-Proben auf das Gel und Elektrophorese für 50 min bei 220 V laufen geladen. </li></ol> Teil 3: Die Färbung des Gels <ol><li> Das Gel Kassette wird demontiert und das Gel in ein Feld für die nachfolgenden Waschschritte platziert. </li><li> Etwa 100 ml zweifach destilliertem Wasser wird das Gel hinzu und erhitzt in der Mikrowelle für 30 Sekunden. Heizung sollte gestoppt werden, bevor Sieden auftritt. Die Box mit dem Gel wird dann auf einem Schüttler für 3-5 min gegeben. und dieser Waschschritt wird zweimal mit frischem Wasser wiederholt. </li><li> Genug CBB Färbelösung wird hinzugefügt, um das Gel in die Box und das Feld in der Mikrowelle für 10 Sekunden erhitzt decken. ohne zu kochen. Die Box mit dem Gel wird dann auf einem Schüttler zur Fertigstellung der Färbung gelegt. Bereits nach 1 Minute, können Proteinbanden beobachtet, nach 15-30 min. die Färbung ist stark genug, in den meisten Fällen. </li><li> Die Färbelösung wird abgegossen und 50-100 ml zweifach destilliertem Wasser wird zugesetzt, um weitere Entfärbung der hellblauen Hintergrund des Gels auf einem Schüttler. Das Wasser kann durch frisches Wasser für die weitere Entfärbung bei Bedarf ersetzt werden. </li><li> Das Gel kann gescannt, fotografiert zu werden oder getrocknet für die langfristige Lagerung </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse: Siehe Abb.. 1 für eine richtig gefärbten Gel nach dem beschriebenen Verfahren. Siehe Abb.. 2 für ein Gel, das nicht schon lange genug vor der Färbung und Rest-SDS gewaschen hemmt effizienten Färbung. Beachten Sie, dass der Marker Gassen (*) die gleiche Menge an Marker-Proteine ​​enthalten. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Abb.. 1: Vertreter Gel gefärbt nach dem Laden der Proben einer Proteinreinigung (*: Molekulargewichtsmarker). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Abb.. 2: CBB gefärbten Gel, das nicht schon lange genug vor dem CBB-Färbung gewaschen. Die Proteinbanden erscheinen schwächer (beachten Sie, dass der Marker Spur * die gleiche Menge an Protein, wie in Abb.. 1 enthält).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

Keine widerstreitenden Interessen. Das oben beschriebene Verfahren wurde ursprünglich in einer Patentanmeldung durch EM Wondrak veröffentlicht (siehe Ref.).

<ul><li> Die Waschschritte sind entscheidend für die effiziente Färbung der Proteine. Eine reduzierte Waschzeit unter 2 min oder reduziertem Volumen von Wasser (&lt;50 ml) kann in hellblauen Proteinbanden, wahrscheinlich aufgrund der höheren Mengen an restlichem SDS im Gel führen. </li><li> Wenn die Proteine ​​gehen, um durch Massenspektrometrie analysiert werden, die Heizung Schritte in der Mikrowelle übersprungen werden soll, ist die Zeit für das Waschen des Gels erweitert, um ca. 10 min in jedem Schritt und die Färbung der Zeit, bis die Band...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>Es könnte auch ein anderes CBB G-250 verwendet werden</td></tr><tr><td>Konzentrierte HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

färbung von proteinen in gelen mit coomassie g-250 ohne organische lösungsmittel und essigsäure

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In der klassischen Protein Färbeprotokollen mit Coomassie Brilliant Blue (CBB), Lösungen mit hohen Gehalten von toxischen und brennbaren organischen Lösungsmitteln (Methanol, Ethanol oder 2-Propanol) und Essigsäure sind zur Fixierung verwendet, Färben und Entfärben von Proteinen in einem Gel nach SDS -PAGE. Zur Beschleunigung der Verfahren, Erhitzen der Färbelösung in der Mikrowelle für eine kurze Zeit wird häufig verwendet. Dies führt in der Regel Verdampfung von giftigen oder gefährlichen Methanol, Ethanol oder 2-Propanol und ein starker Geruch von Essigsäure im Labor, die vermieden aus Sicherheitserwägungen sollte. In einem Protokoll ursprünglich in zwei Patentanmeldungen EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) veröffentlicht wurde, ist eine alternative Zusammensetzung der Färbelösung beschrieben, in denen keine organischen Lösungsmittel oder Säuren verwendet wird. Die CBB ist in bidestilliertem Wasser gelöst (60-80mg CBB G-250 pro Liter) und 35 mM HCl ist als einzige weitere Verbindung in die Färbelösung aufgenommen. Die CBB Staning des Gels wird nach SDS-PAGE und gründliches Waschen des Gels in bidestilliertem Wasser getan. Durch Erhitzen des Gels während des Waschens und Färbeschritte, kann der Prozess schneller beendet sein und keine giftigen oder gefährlichen Kombinationspräparate sind verdampft. Die Färbung von Proteinen tritt bereits innerhalb von 1 Minute nach dem Erwärmen des Gels in Färbelösung und ist voll nach 15-30 min mit einem leicht blauen Hintergrund, die komplett bei längerer Waschen der gefärbten Gel in bidestilliertem Wasser entfärbt entwickelt, ohne dass die gefärbten Proteins Bands.

Ein kurzes Protokoll für Protein-Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in Polyacrylamidgelen wird ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Essigsäure als in der klassischen Färbeverfahren mit CBB beschrieben.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In klassischen Proteinfärbeprotokollen unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue (CBB) enthalten die Lösungen hohe Anteile an toxischen und entzündlichen organischen Lösungsmitteln ...

Zur Durchführung dieses Verfahrens wird Kumasi Brilliant Blue oder CBG 250 in einem Liter zweifach destilliertem Wasser unter Rühren zwei bis vier Stunden lang gelöst. Anschließend wird Salzsäure unter weiterem Rühren für eine Minute zu der dunkelblauen Lösung gegeben, und die Lösung wird zur späteren Verwendung lichtgeschützt aufbewahrt. Nach der Probenvorbereitung der Proteine und der SDS-PAGE wird die Gelfolie auseinandergebaut und das Gel zur dreimaligen anschließenden Waschung mit zweifach destilliertem Wasser in eine Box gelegt.Nach dem dritten Waschschritt wird das Wasser durch ausreichend CBB-Färbelösung ersetzt, um das Gel in der Box zu bedecken. Die Box wird für 10 Sekunden in der Mikrowelle erhitzt und anschließend mit dem Gel auf einen Schüttler gestellt. Zum Abschluss der Färbung können Proteinbanden nach einer Minute beobachtet werden.Hallo, ich bin Amri Lawrence aus der Proteinexpression und -reinigung beim Cough-Facility in Emberin Heidelberg. Heute zeigen wir Ihnen ein Protokoll zur Färbung von Proteinen mit Coomassie-Blaug 250 in Chloridgelen. Im Gegensatz zu klassischen Färbemethoden verwendet unser Protokoll keine organischen Lösungsmittel oder Essigsäure.Wir verwenden dieses Protokoll, um unsere Proteine nach jedem Reinigungsschritt zu analysieren. Beginnen wir also. Um die CBB-Färbelösung herzustellen, werden 60 bis 80 Milligramm CBB in einem Liter zweifach destilliertem Wasser unter zweibis vierstündigem Rühren gelöst.Nachdem das CBV gelöst ist, die Lösung in einen Abzug überführen. Im Abzug vorsichtig drei Milliliter konzentrierte Salzsäure zu der dunkelblauen Lösung hinzufügen. Während einer Minutenlänge Rührphase sollten Handschuhe getragen werden, da die endgültige Lösung einen pH-Wert von zwei aufweisen wird.Nach der Herstellung wird die Lösung dunkel gelagert, um sie später zu verwenden. Die Lösung kann wochen- oder sogar monatelang gelagert werden, ohne ihre Färbewirksamkeit zu verlieren. Zum Vorbereiten von Proteinproben für die SDS-Gelelektrophorese werden geeignete Aliquots der Proteinproben mit Pufferpuffer in einer Endkonzentration von 1× Ladebuffer vermischt und die Proteinproben vor dem Beladen etwa fünf Minuten erhitzt.Während die Proben erhitzt werden, bereitet man die Gelelektrophoresekammer für den Lauf vor. Wir verwenden vorgefertigte Gele in einer Mini-Zelle mit MES-Puffer als Laufpuffer. Es kann jedoch jedes andere Gel- und Elektrophorese-System verwendet werden.Die erhitzten Proteinproben werden anschließend auf das Gel aufgetragen und 50 Minuten lang bei 220 Volt elektrophoretisch wandern gelassen. Sobald die SDS-Gelelektrophorese abgeschlossen ist, wird die Gelschachtel auseinandergebaut und das Gel in eine Box mit 100 Milliliter zweifach destilliertem Wasser gelegt. Für die anschließenden Waschschritte wird die Box 30 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzt.Die Erwärmung sollte gestoppt werden, bevor das Sieden eintritt. Nach der Behandlung in der Mikrowelle wird die Box mit dem Gel auf einen Schüttler gestellt und drei bis fünf Minuten lang geschüttelt; dieser Waschschritt wird zweimal mit frischem Wasser wiederholt. Nach den drei Wasserwäschen wird die CBB-Färbeflösung zur Bedeckung des Gels in der Box hinzugefügt, und die Box wird für 10 Sekunden in der Mikrowelle erhitzt, ohne dass es zum Sieden kommt.Anschließend wird die Box mit dem Gel auf einen Schüttler gestellt, um die Färbung abzuschließen. Proteinbande können bereits nach einer Minute sowie nach 15 bis 30 Minuten beobachtet werden. Die Färbung ist in der Regel ausreichend intensiv.Die Färbelösung wird abgegossen und 50 bis 100 Milliliter bidestilliertes Wasser hinzugefügt. Um den hellblauen Hintergrund des Gels weiter zu reduzieren, kann das Wasser auf einem Schüttler durch frisches Wasser ersetzt werden, um die Entfärbung fortzusetzen. Bei Bedarf kann das Gel nun gescannt, fotografiert oder zur Langzeitlagerung getrocknet werden.Ein nach diesem Verfahren gefärbtes Gel sollte folgendermaßen aussehen. In diesem Gel sind die Proteinbanden gut und deutlich sichtbar angefärbt. Der Hintergrund ist dabei vernachlässigbar.Die erste mit einem Sternchen markierte Spur enthält Molekulargewichtsmarker. Dagegen sieht ein Gel, das vor der Färbung nicht ausreichend gewaschen wurde, wie folgt aus: In diesem Gel waren die Waschschritte zu kurz, sodass die Proteinbanden nicht ausreichend angefärbt wurden. Beachten Sie, dass die mit einem Sternchen markierte Spur dieselbe Menge an Proteinen der Molekulargewichtsmarker wie in einem vorherigen Gel enthält, jedoch eine weniger effiziente Färbung zeigt.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Proteine in Polyamidgelen mit Coomassie-Brillantblau färbt, ohne giftige oder entzündliche organische Lösungsmittel verwenden zu müssen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Waschschritte entscheidend für eine effiziente Proteinanfärbung sind. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nach der Trennung durch elektrophoretische Methoden können Proteine ​​in einem Gel durch mehrere Färbemethoden nachgewiesen werden. Die Färbung von Proteinen mit Coomassie Blue, Silver Färbung, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sind in diesem Video demonstriert.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang...

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur kombinierten Alcian-Blau- und Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykan-Oligosaccharid-Fragmenten. Diese kombinierte Färbetechnik verstärkt die Banden von Glykosaminoglykan-Polymeren unterschiedlicher Länge in Polyacrylamid-Gelen erheblich.

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Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

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Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll umreißt eine neue fluoreszierende Färbung Technik für Gesamt-Protein Nachweis in Polyacrylamid-Gele. Das Protokoll nutzt eine Sonde, Silber Ionen-spezifische Fluoreszenz Turn-on, die Ag+erkennt-Proteinkomplexe, und gewisse Einschränkungen der traditionellen chromogenen Silber Flecken beseitigt.

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion und Visualisierung von aggregierten und löslichen Proteinen aus Escherichia coli nach Behandlung mit einem proteotoxischen antimikrobiellen Mittel. Nach diesem Verfahren kann ein qualitativer Vergleich der Proteinaggregatbildung in vivo in verschiedenen Bakterienstämmen und/oder zwischen Behandlungen ermöglicht werden.

Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach Behandlung von Escherichia coli mit einem proteotoxischen Stressor

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Lernen Sie eine sichere Methode zur Protein-Färbung in Polyacrylamid-Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel oder Essigsäure. Dieses Protokoll ermöglicht eine klare Visualisierung von Proteinbanden bereits nach einer Minute.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

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