Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Um dieses Verfahren zu beginnen, wird Kumasi Brilliant Blue oder CBG two 50 in einem Liter bi-destilliertem Wasser aufgelöst, indem zwei bis vier Stunden lang gerührt wird. Salzsäure wird später unter Rühren für eine weitere Minute zu der dunkelblauen Lösung gegeben, und die Lösung wird für die spätere Verwendung im Dunkeln gelagert. Nach der Vorbereitung der Proteinprobe und der STS-Seite wird die Gelkassette zerlegt und das Gel in eine Box gegeben, in der drei aufeinanderfolgende Waschschritte mit bi-destilliertem Wasser durchgeführt werden.

Nach dem dritten Waschschritt wird das Wasser durch ausreichend CBB-Färbelösung ersetzt, um das Gel in der Box zu bedecken. Die Schachtel wird 10 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzt und dann auf einen Shaker gestellt. Zum Abschluss der Färbung können Proteinbanden nach einer Minute beobachtet werden.

Hallo, ich bin Amri Lawrence von der Anlage zur Reinigung von Proteinexpression bei Emberin Heidelberg. Heute zeigen wir Ihnen ein Protokoll für die Färbung von Proteinen mit Cooma Brilliant Blue G hundred 50 in Chloridgelen. Im Gegensatz zu klassischen Färbemethoden kommen in unserem Protokoll keine organischen Lösungsmittel oder Essigsäure zum Einsatz.

Wir verwenden dieses Protokoll, um unsere Proteine nach jedem Reinigungsschritt zu analysieren. Also lasst uns loslegen. Zur Herstellung der CBB-Färbelösung werden 60 bis 80 Milligramm CBB in einem Liter destilliertem Wasser unter zwei- bis vierstündigem Rühren gelöst.

Nachdem das CBV aufgelöst ist, geben Sie die Lösung in einen Abzug. Geben Sie im Abzug vorsichtig drei Milliliter konzentrierte Salzsäure in die dunkelblaue Lösung. Wenn Sie eine Minute lang umrühren, sollten Handschuhe getragen werden, da die endgültige Lösung einen pH-Wert von zwei hat.

Sobald die Lösung hergestellt ist, wird sie für die spätere Verwendung im Dunkeln aufbewahrt. Die Lösung kann wochenlang oder bis zu mehreren Monaten gelagert werden, ohne ihre Färbewirkung zu verlieren. Zur Vorbereitung von Proteinproben für die SDS-Seite werden geeignete Aliquots von Proteinproben mit dem Ladepuffer auf eine Endkonzentration von einem x Ladepuffer gemischt und die Proteinproben vor dem Laden etwa fünf Minuten lang erhitzt.

Während die Proben erhitzt werden, wird die Gelelektrophoresekammer für den Lauf vorbereitet. Wir verwenden vorgefertigte Gele in einer Minizelle mit MES-Puffer als Laufpuffer. Es kann jedoch jedes andere Gel- und Elektrophoresesystem verwendet werden.

Die erhitzten Proteinproben werden dann für 50 Minuten bei 220 Volt auf das Gel und den Elektro-Ost geladen. Wenn die SDB-Seite fertig ist, wird die Gelkassette zerlegt und das Gel in eine Schachtel mit 100 Millilitern destilliertem Wasser gegeben. Für die anschließenden Waschschritte wird die Box 30 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzt.

Das Erhitzen sollte gestoppt werden, bevor es zum Kochen kommt. Nachdem Sie die Schachtel drei bis fünf Minuten lang in der Mikrowelle mit dem Gel auf einem Shaker behandelt haben, wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal mit frischem Wasser. Nach den drei Wäschen mit Wasser wird CBB-Standlösung hinzugefügt, um das Gel in der Box zu bedecken, und die Box wird 10 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzt, ohne zu kochen.

Danach wird die Schachtel mit dem Gel auf einen Schüttler gestellt, um die Färbung abzuschließen. Proteinbanden können nach einer Minute und nach 15 bis 30 Minuten beobachtet werden. Die Flecken sind in der Regel stark genug.

Die Färbelösung wird abgegossen und mit 50 bis 100 Millilitern bidestilliertem Wasser versetzt. Um den hellblauen Hintergrund des Gels auf einem Shaker weiter zu fixieren, kann das Wasser für weitere Färbungen durch frisches Wasser ersetzt werden. Bei Bedarf kann das Gel nun gescannt, fotografiert oder für die Langzeitlagerung getrocknet werden.

Ein Gel, das nach diesem Verfahren gefärbt wurde, sollte so aussehen. In diesem Gel sind die Proteinbanden gut und gut sichtbar angefärbt. Während der Hintergrund vernachlässigbar ist.

Die erste Spur, die durch das Sternchen gekennzeichnet ist, enthält Molekulargewichtsmarker. Im Gegensatz dazu sieht ein Gel, das vor der Färbung nicht ausreichend gewaschen wurde, so aus: Bei diesem Gel waren die Waschschritte zu kurz, so dass die Proteinbanden nicht gut genug gefärbt waren. Beachten Sie, dass die durch das Sternchen gekennzeichnete Spur die gleichen Proteinmengen an Molekulargewichtsmarkern enthält wie ein vorheriges Gel, aber eine weniger effiziente Färbung aufweist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Proteine mit Co Massive Brilliant Blue in Polyamid-Gelen färben können, ohne dabei giftige oder brennbare organische Lösungsmittel verwenden zu müssen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu bedenken, dass die Waschschritte für die effiziente Färbung der Proteine entscheidend sind. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.