Name: DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Lernen Sie die DNA-Extraktion aus marinem Plankton auf Sterivex-Filtern mit anschließender CsCl-Dichtegradientenreinigung. Diese Methode liefert hochmolekulare DNA für mikrobielle Ökologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. JJW wurde durch Stipendien von NSERC und DAW unterstützt durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt. SL wurde von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

Hinweis: Alle Reagenzien dieses Protokoll verwendet werden vom Labor Aktien in kleinere Arbeitsgruppen Aktien-das ist sehr wichtig, um eine Kreuzkontamination der DNA-Proben und Kontamination von Labor-Bestände zu vermeiden aliquotiert. Auch beim Pipettieren, stellen Sie sicher, Pipettenspitzen für jede zusätzlich um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, ändern. Part One: Cell Lysis und Verdauung <ol><li> Beginnen Sie dieses Protokoll durch Auftauen der Sterivex Filtern, die zuvor konzentriert planktonischen Biomasse enthalten auf dem Eis. Der Einfachheit halber hier beschreiben wir das Verfahren für die Verarbeitung eines einzelnen Filters. In der Praxis empfehlen wir die Verarbeitung von 16 oder weniger Filter auf einmal. </li><li> Sobald der Filter hat aufgetaut, beginnt die erste von zwei Inkubationen: eine, um die Zellen zu lysieren und entfernen RNA, und einer zu brechen Proteine. Für die erste Inkubation mit 100 ul Lysozym (125 mg in 1000 ul TE) und 20 ml RNase A (10 pg / ml), um den Filter. Verschließen Sie die Filter mit Parafilm und lassen Sie es in der Hybridisierungsofen bei 37 ° zu drehen C für 1 Stunde. </li><li> Für die nächsten Inkubation mit 100 ul Proteinase K und 100 ul 20% SDS, um den Filter. Reseal mit Parafilm und lassen Sie es 1-2 Stunden mehr in der Hybridisierungsofen drehen, diesmal bei 55 ° C. </li><li> Mit einer Spritze 5ml, übertragen Sie die Lysat aus dem Sterivex Filter in einen 15 ml Falcon-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 1 ml Lysepuffer und fügen Sie die Spülflüssigkeit zum Lysat in Ihrem Falcon-Röhrchen mit dem 5cc Spritze. Jetzt haben Sie aufgeschlossen und verdaut Ihre Zellen, sind Sie bereit, ihre DNA zu extrahieren. </li></ol> Zweiter Teil: DNA-Extraktion <ol><li> Der nächste Schritt ist es, die Phenol-Chloroform-Methode verwenden, um die DNA aus dem Lysat zu extrahieren. Fügen Sie dem gleichen Volumen (ca. 3 ml) von Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (IAA) zum Lysat Rohr, achten Sie darauf, Pipettenspitzen für jedes zusätzlich zu ändern, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Vortex für 10 Sekunden, um gut zu mischen. </li><li> Drehen Sie das Rohr bei 2500 g für 5 Minuten, so dass Sie sicher, dass die Zentrifuge ist ausgewogen. Während des Laufs sollten die Phenol-Chloroform-Lysat Gemisch in zwei Schichten zu trennen: eine organische Schicht, die das Phenol, Chloroform und Proteine ​​aus Ihrer Probe, auf dem Boden, und eine wässrige Schicht, die aus Ihrer DNA, aus Wasser besteht, und andere mehr hydrophilen Molekülen, an der Spitze. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht (mit Ihrer DNA) in ein neues 15 ml Falcon-Röhrchen. Achten Sie darauf, die Schnittstelle mit der Pipettenspitze (immer verlassen eine kleine Menge der wässrigen Schicht hinter) berühren. </li><li> Um dieses neue Rohr, das gleiche Volumen (ca. 3 ml) von Chloroform: IAA, achten Sie darauf, Pipettenspitzen für jedes zusätzlich zu ändern, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Vortex für 10 Sekunden. Dieser Schritt hilft, um alle verbleibenden Phenol aus Ihrer DNA-Probe zu entfernen. </li><li> Spin bei 2500 g für 5 Minuten oder bis wässrige Schicht ist klar. Transfer wässrige Schicht in eine neue, etikettiert Falcon-Röhrchen und 1 ml TE bei pH 8,0, darauf achten, daß die Schnittstelle mit der Pipettenspitze (immer verlassen eine kleine Menge der wässrigen Schicht hinter) berühren. Diese wässrige Schicht enthält Ihre DNA zu extrahieren. </li></ol> Dritter Teil: DNA-Konzentration und Waschen <ol><li> Der nächste Schritt ist sich zu waschen und konzentrieren die DNA-Probe in einer 15 ml Amicon Ultra-Zentrifugenröhrchen. Die Amicon Rohre bestehen aus einem Filter, der Moleküle bleibt bei oder über einem bestimmten Molekulargewicht (Retentat) und eine Rohrleitung in den Flow-Through-catch (das Filtrat). In diesem Fall behält der Filter Ihre DNA (Retentat). Übertragen Sie Ihre DNA-Extrakt aus Schritt 2.5, um den Filter-Fach eines Amicon Ultra Tube. </li><li> Spin bei 3500 g für 10 Minuten. Vergewissern Sie sich, es ist weniger als 1 ml Flüssigkeit in der Amicon Filter zurückgehalten. Wenn mehr Retentat bleibt, füllen Sie den Filter mit TE und wieder zu drehen. Achten Sie darauf, eine frische Pipettenspitze für jedes TE zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie die Flow-Through-oder Filtrat, zum anderen Falcon-Röhrchen und speichern Sie sie im Kühlschrank bis Sie Ihr endgültiges DNA-Produkt auf einem Gel bestätigt haben (Teil IV). </li><li> 2 ml TE-Puffer auf die Amicon-Filter und Spin bei 3500 g für 6 Minuten, so dass Sie sicher, dass eine frische Pipettenspitze für jedes TE zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Pool Filtrat mit diesem Schritt 3,3 und in den Kühlschrank zu speichern. </li><li> Waschen Sie die DNA zweimal mit TE für insgesamt drei Waschungen (achten Sie darauf, immer eine frische Pipettenspitze) und speichern das Filtrat jedes Mal (nach Stufen 3,3 und 3,4). In den letzten waschen, schleudern, bis 200 bis 500 ml Retentat verbleibt in der Amicon-Filter. Notieren Sie sich die letzte Band und Übertragung der Retentat (mit Ihrer DNA), um ein markiertes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li></ol> Vierter Teil: Bestimmung der DNA-Qualität <ol><li> Überprüfen Sie die DNA-Qualität und schätzen Sie die Konzentration der DNA, indem Sie Ihre Proben auf einem Gel 0,8% Agarosegel stainiert mit 1ml Ethidiumbromid (EtBr) über Nacht. (Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Verwendung von EtBr-it ist ein bekanntes Mutagen und Verdacht, krebserzeugend zu. Stellen Sie sicher, Handschuhe zu oft ändern und vermeiden EtBr übertragen, um den Rest des Labors und die Haut.) Legen Sie die Proben neben DNA-Leitern, die als dienen Größe und Intensität Standards (siehe nächster Schritt). </li><li> In den ersten paar Gassen, laden Leitern mit Bands verschiedener Molekulargewichte und Konzentrationen. Wir empfehlen die folgenden Be-Muster: in der ersten und letzten Bahnen (äußerste Fahrstreifen), Last 10 ul der 50ng/μl von 1kb + oder 2log Leiter. In den Spuren 2,3 und 4, Last 2 ul, 5 ul, und 10 ul jeweils von 50ng/μl λHindIII Leiter. Schließlich Last 5 ul pro Bahn von DNA-Extrakt mit Farbstoff für jede Probe. </li><li> Führen Sie das Gel bei 15 Volt für etwa 16 Stunden (wir empfehlen Nacht läuft). </li><li> Am nächsten Tag, fotografieren das Gel mit einer UV-Gel-Dokumentations-System. Zur Bestimmung der Molekulargewichtsbereich der DNA und ihrer Konzentration, vergleichen Sie die Probe Bands Bands der Leitern. Gute Qualität DNA wird mit hohem Molekulargewicht (&gt; 36kb), und zeigen kaum Anzeichen für Scheren / Abbau. Siehe Abbildung 1. </li></ol> Fünfter Teil: Cäsiumchlorid Gradienten Zentrifugation <ol><li> Wenn die DNA-Qualität ist gut und die Menge ausreichend ist, können Sie fortfahren, um die DNA von der Durchführung einer Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Beachten Sie, dass diese Reinigung Schritt ist optional und ist nicht notwendig für alle Downstream-Anwendungen (zum Beispiel, wenn Sie Fosmid Bibliotheken Sie reinigen zu generieren, während, wenn Sie einfach nur PCR-Reaktionen durchzuführen, Reinigung normalerweise nicht notwendig ist wollen). Beschriften Sie zuerst ein Zentrifugenröhrchen für jede Probe. </li><li> Zu jedem Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 160 mg CsCl, 178 ul von genomischer DNA. Nach der Zugabe von CsCl und DNA, um das Rohr legen ein kleines Stück Parafilm auf dem Rohr und sanft das Röhrchen 1-20 mal, um die Komponenten zu mischen. Mischen Sie nicht durch Pipettieren, kann dazu führen, Scheren der DNA. Anschließend fügen Sie 10 ul 10 ug / ul EtBr um dieses Rohr und mischen Sie es in der gleichen Weise. (Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Verwendung von EtBr-it ist ein bekanntes Mutagen und Verdacht, krebserzeugend zu. Stellen Sie sicher, Handschuhe zu oft ändern und vermeiden EtBr übertragen, um den Rest des Labors und die Haut.) </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Gewicht aller Rohre vor dem Zentrifugieren, so dass das Gewicht Unterschiede zwischen den Röhren von weniger als 1 mg sind ausgewogen. </li><li> Die Röhrchen im Rotor mit hemostat, den Deckel schließen und Ort der Rotor im Inneren der Ultrazentrifuge. </li><li> Schließen Sie die Tür Ultrazentrifuge. Vacuum wird, sobald Sie die Tür zu schließen angewendet werden. Run über Nacht bei 100.000 rpm für 18 Stunden und 20 ° C. </li><li> Wenn Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Rohre aus dem Rotor mit hemostat und auf ein Rohr Rack. </li><li> Visualisieren Sie die DNA mit blauem Licht Transilluminator, oder wenn nicht verfügbar, verwenden Sie langwelligen UV-Licht, in einem dunklen Raum. Tragen Sie ein Paar gelbe Filtergläser der DNA-Bande zu sehen. Siehe Abbildung 2. </li><li> Mit einem sterilen 1cc Spritze und Nadel (26G 08.05), zu entfernen DNA-Bande und legen Sie sie in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Um wieder die meisten der DNA in den toten Raum in der Spritze befindliche, spülen Spritze mit 100 ul TE und fügen Sie die abgespült Lösung für das Rohr. Bereiten Sie eine Tube mit 100 ul TE-Puffer pro Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> So entfernen Sie EtBr aus der DNA, das gleiche Volumen an Wasser-Butanol auf die Tube, drehen Sie die Röhren vorsichtig 1-20 mal, Zentrifuge bei 10000 rpm für 1 Minute und entsorgen Sie die obere Schicht. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche, bis die Farbe von Butanol ist transparent, 3 bis 4 mal. </li><li> Platz 4 ml TE in einer Amicon Ultra-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie die DNA-Lösung von oben. </li><li> Zentrifugation bei 3500 g bei Raumtemperatur, bis die DNA Volumen ca. 100-500 ul (ca. 6-7 Minuten) reduziert wird, und entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Add 2ml TE zu Amicon-Filter und Zentrifuge bei 3500 g für 6 Minuten, so dass Sie sicher, dass eine frische Pipettenspitze für jedes zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Zweimal wiederholen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf ein Endvolumen von 50-100 ul durch zusätzliche Zentrifugation wie nötig und übertragen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Zugabe von 40 ul TE zum Amicon-Filter und Pipette auf und ab entlang der beiden Filtermembranen zu waschen alle verbleibenden DNA. Fügen Sie diese Lösung, um das Rohr in 5,15. </li><li> Legen Sie eine Microcon YM-30-Filter-Einheit in eine Microcon Rohr und Vorwäsche der Microcon durch Zugabe von 200 ul autoklaviert Wasser und Zentrifugieren bei 10000 rpm für 7 Minuten. </li><li> Fügen Sie die DNA-Lösung von 5.16 bis die vorgewaschen Microcon um weiter zu konzentrieren die DNA. Zentrifuge bei 5000-10000 g für 1 bis 3 Minuten. Überprüfen Sie die Menge der Flüssigkeitauf dem Filter und wiederholen Zentrifugation bis die Menge der Flüssigkeit auf dem Filter wird auf etwa 50 ul reduziert. </li><li> Platzieren Sie die Filtereinheit kopfüber in eine neue Microcon Rohr und Zentrifuge bei 1000 g für 3 Minuten. Die optimale Menge der konzentrierten Lösung beträgt 50-60 ul. </li><li> Messen und notieren die Konzentration der DNA auf einem Nanodrop und überprüfen peak Qualität (sollte 260nm werden). </li><li> Übertragen einer kleinen Teilmenge der DNA, um eine saubere Eppendorf-Röhrchen für die Arbeit Lager und frieren bei minus 20. Den Rest der DNA zu einem zweiten sauberen eppendorf und frieren bei minus 80. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird, sollten Sie ein Gelbild nach Schritt 4.4 in Bestimmung der DNA-Qualität ähnlich zu Abbildung 1 zu sehen. Actual DNA-Konzentration von Extrakten wird je nach Quelle der Probe. Nach dem Schritt 5.7 in CsCl-Gradienten-Zentrifugation sollte genomische DNA von blauem Licht beleuchtet ähnlich Abbildung 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. 0,8% Agarosegelelektrophorese Bild von hochmolekularer DNA aus vier Tiefen in der subarktischen Pazifik (in zweifacher Ausfertigung), mit dem interkalierende Mittel Ethidiumbromid (10 mg / ml) angefärbt gesammelt. Gel wurde auf 15V für ~ 16 Stunden in 1X TBE-Gel-Laufpuffer laufen. Beispiel Bands sind von guter Qualität zeigen kaum Anzeichen für mechanische Scherung (zeigt einzelne Banden oder Schlieren auf mehrere Bänder Gegensatz), obwohl der 10m-Extrakte halten einige RNA übertragen (siehe Abstrich in der 0,5 bis 2,0 Kb-Bereich). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Genomic DNA-Bande durch blaues Licht nach CsCl-Gradienten-Zentrifugation beleuchtet.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

Je nachdem, wie viele Proben verarbeitet werden sollen, kann dies eine zeitintensive Prozedur aufgrund der zwei einstündigen Inkubation Schritte, und die wiederholten Waschungen und Zentrifugationsschritte werden. Am besten ist es, zwei ganze Tage für dieses Verfahren zu planen, um genügend Zeit zu lassen. Wenn es Probleme gibt immer die endgültige Extrakt Volumen in der Amicon Rohr zu reduzieren bis zu 200-500μl während der DNA-Konzentration und Waschen, versuchen Sie zusätzliche TE Waschungen und Zentrifugationen (Wie...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>1-cc-Spritze (26G5/8-Nadel)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Spritze (26G5/8-Nadel)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Röhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>5-cc-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;#174; Ultra-4 Zentrifugalfiltergeräte</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>10.000 nominale Molekulargewichts-Grenze</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Mit Wasser gesättigt herstellen (Butanol:Wasser = 1:1)</td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor, JA5.3</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Cäsiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Äthidiumbromid (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-EDTA-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lysispuffer</td><td></td><td></td><td>0,75 M Saccharose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg in 1000 &amp;#x03BC;l TE</td></tr><tr><td>Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30 Zentrifugalfiltereinheit</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>50-bp-Ausschuss</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Safe Imager&amp;#8482; Blaulicht-Durchlichtapparat</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Natriumlaurylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>20 % SDS</td></tr><tr><td>Sterivex-Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>TE-Puffer, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor für Ultrazentrifuge, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen (7×20 mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchenhalter</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge, Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna-extraktion von 0,22 pm sterivex filter und cäsiumchlorid-dichtegradientenzentrifugation

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Diese Methode wird verwendet, um hochmolekulare genomische DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 &amp;mgr; M Sterivex Filter, die mit Lagerung / Lysepuffer behandelt worden sind und archiviert werden bei -80 ° C konzentrierten Extrakt, und diese DNA mit einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten zu reinigen. Das Protokoll beginnt mit zwei einstündigen Inkubation Schritte, um DNA aus den Zellen zu befreien und zu entfernen RNA. Als nächstes wurde eine Reihe von Phenol: sind Chloroform und Chloroform-Extraktionen durch Zentrifugation durchgeführt, gefolgt von Proteinen und Zellmembran Komponenten, Sammlung der wässrigen DNA-Extrakt, und mehrere Puffer Austausch Schritte zu waschen und zu konzentrieren, den Extrakt zu entfernen. Fünfter Teil beschreibt die optionale Reinigung über Cäsiumchlorid-Dichtegradienten. Es wird empfohlen, mit weniger als 15 Proben auf einmal arbeiten, um Verwechslungen zu vermeiden und hieb-Protokoll Zeit. Die Gesamtzeit für dieses Protokoll benötigt wird, hängt von der Anzahl der Proben extrahiert werden. Für 10-15 Proben und unter der Annahme der richtigen Zentrifugation Ausrüstung zur Verfügung steht, sollte dieses gesamte Protokoll zu 3 Tage. Vergewissern Sie sich, die Hybridisierung Öfen gesetzt, um Temperatur zu Beginn des Prozesses.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

Diese Methode wird verwendet, um hochmolekulare genomische DNA aus planktonischer Biomasse zu extrahieren, die auf 0,22 µM Sterivex-Filtern konzentriert wurde, welche ...

Hallo, ich bin Jody aus dem Labor von Steven Hallam am Fachbereich Mikrobiologie und Immunologie der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Extraktion genomischer DNA, die aus Meerwasserproben auf 0,2-Mikron-STX-Filtern angereichert und anschließend mittels Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wird. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Umwelt-DNA zu gewinnen, um so die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur, Diversität und Stoffwechselprozesse in marinen Umgebungen untersuchen zu können.Beginnen wir also. Starten Sie dieses Protokoll, indem Sie auf Eis die Probe von X-Filtern auftauen, die Sie zuvor mit planktischer Biomasse angereichert, mit Puffer lysiert und der Einfachheit halber eingefroren haben. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Verarbeitung eines einzelnen Filters.In der Praxis empfehlen wir, jeweils 15 oder weniger Filter zu verarbeiten. Sobald der Filter aufgetaut ist, beginnen Sie mit der ersten von zwei Inkubationen: eine zur Lyse der Zellen und Entfernung der RNA und eine zur Abbauung der Proteine.Fügen Sie für die erste Inkubation 100 Mikroliter Lysozym und 20 Mikroliter RNase A zum Filter hinzu. Versiegeln Sie den Filter erneut mit Parafilm und lassen Sie ihn eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius rotieren. Für die nächste Inkubation geben Sie 100 Mikroliter Proteinase K und 100 Mikroliter 20 % SDS zum Filter hinzu.Versiegeln Sie den Filter mit Perfil und lassen Sie ihn weitere ein bis zwei Stunden rotieren. Dieses Mal bei 55 Grad. Verwenden Sie eine 5-cc-Spritze, um das Lysat vom Stax-Filter in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen zu überführen.Spülen Sie den Filter mit einem Milliliter Lysepuffer und geben Sie die Spülflüssigkeit zum Lysat in Ihrem Falcon-Röhrchen. Nachdem Sie nun Ihre Zellen lysiert und verdaut haben, können Sie deren DNA extrahieren. Der nächste Schritt besteht darin, die DNA aus Ihrem Lysat mit der Phenol-Chloroform-Methode zu isolieren.Geben Sie ein äquivalentes Volumen von etwa drei Millilitern Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu dem Lysat hinzu und wirbeln Sie das Gefäß 10 Sekunden lang, um es gut zu mischen. Zentrifugieren Sie das Gefäß anschließend bei 2.500 ×g für fünf Minuten. Während der Zentrifugation sollte sich die Phenol-Chloroform-Lysat-Mischung in zwei Schichten trennen.Eine organische Schicht unten, die Phenol, Chloroform und Proteine aus Ihrer Probe enthält, sowie eine wässrige Schicht, die gewöhnlich oben liegt und aus Ihrer DNA, Wasser und anderen hydrophileren Molekülen besteht. Überführen Sie die wässrige Schicht, die Ihre DNA enthält, in ein neues 15-Milliliter-Falcon-Gefäß. Geben Sie zu diesem Gefäß ein gleiches Volumen einer Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang im Vortex. Dieser Schritt entfernt jegliches verbleibende Phenol aus Ihrer DNA-Probe. Zentrifugieren Sie sie 2.500 × g für fünf Minuten oder bis die wässrige Phase klar ist. Überführen Sie die wässrige Phase in ein neues beschriftetes Falcon-Gefäß und geben Sie ein Milliliter TE bei pH 8 hinzu.Sie haben nun Ihre DNA-Extraktion vorliegen. Der nächste Schritt besteht darin, die DNA-Probe in einem 15-Milliliter-Amazon-Ultrazentrifugenröhrchen zu waschen und zu konzentrieren. Überführen Sie Ihre DNA-Probe in die Filterkammer von einem Non.Ultra-Röhrchen bestehen aus einem Filter, der Moleküle ab einem bestimmten Molekulargewicht zurückhält, einer Abdeckung und einem Röhrchen, das den Durchlauf (Filтрат) auffängt. In diesem Fall hält der Filter Ihre DNA zurück, wenn bei 3.500 × g zentrifugiert wird, und zwar 10 Minuten lang. Überprüfen Sie, ob weniger als ein Milliliter Flüssigkeit im Amicon-Filter zurückgehalten wird.Falls noch mehr Retentat vorhanden ist, füllen Sie den Filter erneut mit TE auf und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie das Durchflussvolumen oder Filtrat in ein anderes Falcon-Gefäß und bewahren Sie es im Kühlschrank auf, bis Sie Ihr Endprodukt auf einem Gel bestätigt haben. Geben Sie zwei Milliliter TE-Puffer zum Amazon-Filter hinzu und zentrifugieren Sie bei 3.500 × g für sechs Minuten. Entfernen Sie das Filtrat wie zuvor.Waschen Sie die DNA insgesamt dreimal mit TE, wobei zwei weitere Waschschritte folgen; bewahren Sie jeweils das Filtrat für die letzte Waschdrehung auf, bis 200 bis 500 Mikroliter im Amon-Filter verbleiben. Notieren Sie das Endvolumen und überführen Sie es in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Einor-Gefäß. Stellen Sie eine 70-Mikroliter-Aliquot der gewaschenen, konzentrierten DNA als Arbeitsbestand her.Lagern Sie den Arbeitsbestand bei minus 20 Grad Celsius. Das restliche DNA-Material bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Überprüfen Sie die DNA-Konzentration und -Qualität Ihres Endprodukts, indem Sie Ihre Proben neben einer DNA-Größe auf einem Gel auftrennen.Gele mit Läufchen, die als Größen- und Intensitätsstandards dienen, werden als 0,8 % AROS-Gel mit Bromid plus Atherium hergestellt und über Nacht laufen gelassen. In den ersten paar Gelen werden Läufchen mit Banden verschiedener molekularer Massen und Konzentrationen aufgetragen; wir empfehlen folgendes Beladungsmuster: In den ersten beiden Gelen werden jeweils 10 Mikroliter eines 1-Kilobasen-Plus-Läufchens aufgetragen, in den nächsten drei Gelen jeweils 2 Mikroliter, 5 Mikroliter und 10 Mikroliter des Lambda-H3-Läufchens mit 50 Nanogramm pro Mikroliter.Zuletzt 5 µL DNA-Extraktprobe pro Linie auftragen. Das Gel etwa 16 Stunden lang bei 15 Volt laufen lassen. Das Gel mit dem UV-Gel-Dokumentationssystem fotografieren, um den Bereich des molekularen Gewichts der DNA sowie deren Konzentration zu bestimmen.Vergleichen Sie die Banden der Probe mit den Banden der Ladder. Hochwertige DNA weist ein hohes Molekulargewicht auf und zeigt kaum Anzeichen von Scherverletzungen oder Degradation. Wenn die DNA-Qualität gut und die Menge ausreichend ist, fahren Sie mit der Reinigung der DNA durch Durchführung eines Cäsiumchlorid-Gradienten fort.Zentrifugation zuerst Etikett, ein Zentrifugenröhrchen für jede Probe; zu jedem Zentrifugenröhrchen 160 Milligramm Cäsiumchlorid und 178 Mikroliter genomische DNA hinzufügen. Das Röhrchen mit einem kleinen Stück Perfil abdecken und vorsichtig 10 bis 20 Mal umdrehen, um die Komponenten zu mischen. Nicht durch Pipettieren mischen, da dies zu einer Scherung der DNA führen kann.Fügen Sie dann 10 Mikroliter AUM-Bromid zur Probe hinzu und mischen Sie erneut. Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen vor der Zentrifugation gut ausbalanciert sind und dass die Gewichtsunterschiede zwischen den Röhrchen weniger als ein Milligramm betragen. Platzieren Sie die Röhrchen mit Hilfe von Pinzettenzangen in den Ultrazentrifugenrotor.Danach schließen Sie den Rotorkopf und setzen den Rotor in die Ultrazentrifuge ein. Das Vakuum an der Ultrazentrifugentür wird aktiviert, sobald Sie die Tür schließen. Führen Sie die Zentrifugation über Nacht insgesamt 18 Stunden bei 100.000 U/min und 20 Grad Celsius durch.Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Röhrchen mit einer Pinzette aus dem Rotor und stellen Sie sie auf das Gestell. Bringen Sie die Röhrchen zum blauen Transilluminator, setzen Sie die bernsteinfarbenen Schutzbrille auf. Schalten Sie dann das blaue Licht ein und betrachten Sie Ihre DNA-Bande mit einer sterilen Ein-Kubikzentimeter-Spritze und Nadel.Entfernen Sie das DNA-Band und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen, um möglichst viel der in dem toten Volumen der Spritze eingeschlossenen DNA zurückzugewinnen. Spülen Sie die Spritze mit 100 Mikrolitern TE und geben Sie die Spüllösung zum Röhrchen hinzu. Bereiten Sie pro Probe ein separates Röhrchen mit 100 Mikrolitern TE-Puffer vor, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.Um AUM-Bromid von der DNA zu entfernen, geben Sie eine gleiche Menge butanolgesättigtes Wasser in das Röhrchen. Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um und zentrifugieren Sie 10 bis 20 Mal bei 10.000 U/min für eine Minute und entfernen Sie die obere Schicht. Wiederholen Sie die Waschung etwa drei bis vier weitere Male, bis die Farbe des Butanols transparent ist.Geben Sie vier Milliliter TE in ein Ultrazentrifugenröhrchen von Ancon und fügen Sie die DNA-Lösung aus der vorherigen Zentrifugation hinzu. Zentrifugieren Sie bei 3.500 × g bei Raumtemperatur, bis das DNA-Volumen auf etwa 100 bis 500 Mikroliter reduziert ist, und entsorgen Sie den Durchlauf. Geben Sie zwei Milliliter TE auf den Amazon-Filter und zentrifugieren Sie sechs Minuten bei 3.500 × g. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal, um dreimal mit TE zu waschen, und konzentrieren Sie die Probe durch zusätzliche Zentrifugation gegebenenfalls auf ein Endvolumen von 50 bis 100 Mikrolitern.Und überführen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter in ein neues 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen. Geben Sie 40 Mikroliter TE auf den Filter und pipettieren Sie mehrmals auf und ab entlang beider Filtermembranen, um jegliche verbleibende DNA auszuwaschen. Fügen Sie diese Lösung dem Röhrchen mit der konzentrierten DNA hinzu.Platzieren Sie eine MicroCon YM 30-Filtereinheit in ein MicroCon-Röhrchen und spülen Sie den MicroCon vor, indem Sie 200 Mikroliter autoklaviertes Wasser hinzufügen und sieben Minuten bei 10.000 U/min zentrifugieren. Geben Sie die DNA-Lösung zu dem vorgewaschenen MicroCon, um die DNA durch Zentrifugation bei 5.000 bis 10.000 × g für ein bis drei Minuten weiter zu konzentrieren. Überprüfen Sie die Flüssigkeitsmenge auf dem Filter und wiederholen Sie die Zentrifugation, bis die Flüssigkeitsmenge auf dem Filter auf etwa 50 Mikroliter reduziert ist.Stellen Sie die Filtereinheit verkehrt herum in ein neues MicroCon-Röhrchen und zentrifugieren Sie drei Minuten lang mit 1000 × g. Die ideale Menge der konzentrierten Lösung beträgt 50 bis 60 Mikroliter. Überführen Sie Ihre DNA-Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen.Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem NanoDrop und überprüfen Sie die Qualität des Peaks. Ein Absorptionsdiagramm für saubere DNA sollte einen deutlichen Peak bei 260 Nanometern aufweisen. Gefrieren Sie den Rest der DNA bei minus 80 Grad Celsius ein.Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollte ein Gelelektrophoresebild entstehen, das Abbildung eins ähnelt; die tatsächliche DNA-Konzentration der Extrakte variiert je nach Probenquelle. Bei korrekter Durchführung des Protokolls sollte ein DNA-Band deutlich in der Mitte des Röhrchens sichtbar sein. Wie in Abbildung zwei gezeigt, haben wir Ihnen soeben demonstriert, wie man genomische DNA aus Sterex-Filtern extrahiert und mittels eines Cäsiumchlorid-Dichtegradienten reinigt.Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, vor Beginn zu überprüfen, ob alle notwendigen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien vorhanden sind. Zweitens sollten Sie mindestens drei volle Tage einplanen, um ausreichend Zeit für eine sorgfältige Durchführung des Verfahrens zu haben. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

DNA stabilen Isotopen ist ein Anbau-unabhängige Methode zur Identifizierung und Charakterisierung aktiver Gemeinschaften von Mikroorganismen, die fähig werden bestimmte Substrate sind. Assimilation von Substrat in schweren Isotop angereichert führt zu Einbau von markierten Atome in mikrobielle Biomasse. Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ruft markierter DNA für nachgeschaltete molekulare Analysen.

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

Wir bieten ein verbessertes Protokoll zur Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus hypersaline mikrobielle Matten. Mikrobielle Zellen sind von der Matte Matrix vor der DNA-Extraktion und Reinigung getrennt. Dies erhöht die Konzentration, Qualität und Größe der DNA. Das Protokoll kann für andere feuerfeste Proben verwendet werden.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Dieses Video beschreibt die Technik zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus frischem oder gefrorenem Gewebe. Die isolierten extrazellulären Vesikel können für weitere Analysen verwendet werden, um ihre bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Krankheit aufzudecken.

Extraktion extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben mittels Differenzialzentrifugation

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die Isolierung, Konzentration und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus Cyanobakterienkulturen. Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kulturen auf verschiedenen Skalen, Kompromisse zwischen den Methoden und Überlegungen zur Arbeit mit Feldproben werden ebenfalls diskutiert.

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung und Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs), die aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation (DGC) angereichert wurden, identifiziert die physikalischen Eigenschaften von BEVs anhand von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration und diskutiert die potenziellen Anwendungen des DGC-Ansatzes in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung.

Isolierung und Aufreinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen 

Lernen Sie die DNA-Extraktion aus marinem Plankton auf Sterivex-Filtern mit anschließender CsCl-Dichtegradientenreinigung. Diese Methode liefert hochmolekulare DNA für mikrobielle Ökologie.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

Weitere Videos entdecken