Mausmodell für Morbus Parkinson: von 6-OH Dopamin Läsion Behavioral-Test

Hallo, ich bin Fab sva. Ich bin Absolvent des Labors für biomedizinische Wissenschaften an der Bundesuniversität von Genic. In diesem Video werde ich eine stereotaktische Operation durchführen, um den sechsseitigen Wirkstoff Dopamin-Neurotoxin zu verabreichen, um eine Hirnläsion zu induzieren und ein Mausmodell zu schaffen. Diese Technik ist entscheidend für die Erforschung der Parkinson-Krankheit.

Ich zeige außerdem, wie der Grad der motorischen Beeinträchtigung mithilfe des oberen durch Morphin induzierten Rotationsversuchs bewertet werden kann. Materialien und Instrumente: Um mit dem Verfahren zu beginnen, müssen Sie Handschuhe und geeignete Schutzkleidung tragen. Schalten Sie die Heizplatte ein und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein.

Stellen Sie sicher, dass alle Teile der stereotaktischen Apparatur sowie das erforderliche Material und die Instrumente gereinigt und sterilisiert wurden; außerdem sollten alle Gele und Lösungen, die warm gehalten werden können, wie Anästhetika und sterile Kochsalzlösung, vorbereitet sein. Produkte, die in anhydrer Form aufbewahrt werden, wie beispielsweise 6-Hydroxydopamin und Apomorphin, sollten in steriler Injektionslösung verdünnt und im laminaren Flussabsaughaubenfiltrat gereinigt werden, bevor das Tier anästhesiert und auf den chirurgischen Eingriff vorbereitet wird.

Wiegen Sie das Tier und berechnen Sie die Menge an Sedativa, die während der Sedierung per intraperitonealer Injektion verabreicht werden muss. Legen Sie das Tier auf eine Heizplatte, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, und entfernen Sie das Fell durch Rasieren. Tragen Sie ein Lokalanästhetikum wie Xylocain an den Ohrhaltern des stereotaktischen Instruments auf, um Leiden und postoperative Beschwerden zu vermeiden.

Überprüfen Sie, ob das Tier ordnungsgemäß sediert ist, indem Sie den Withdrawal-Reflex der Hinterextremität testen. Erst danach sollte das Tier vorsichtig am stereotaktischen Instrument positioniert werden. Führen Sie die oberen Schneidezähne in die Maulstückhalterung ein und befestigen Sie diese dann fest.

Setzen Sie anschließend vorsichtig die Ohrstifte ein, zentrieren Sie sie und überprüfen Sie, ob der Schädel ordnungsgemäß fixiert ist. Dazu können Sie versuchen, den Kopf nach oben und unten sowie nach beiden Seiten zu bewegen. Wenn der Schädel korrekt positioniert wurde, sollte er sich nicht bewegen.

Tragen Sie einen Tropfen Augenlösung auf die Augen auf, um zu verhindern, dass die Hornhäute austrocknen. Stereotaktische Operation: Desinfizieren Sie die Haut mit Povidon-Iod, gefolgt von 70 % Ethanol. Wiederholen Sie diesen gesamten Vorgang dreimal.

Überprüfen Sie erneut, ob das Tier ausreichend sediert ist, indem Sie den Withdrawal-Reflex testen. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 1,5 cm langen sagittalen Schnitt anzulegen, und benutzen Sie dann eine neue Klinge, um das Periost abzukratzen. Um die Nähte freizulegen, lokalisieren Sie das Lambda und das bgma.

Wenn das Tier korrekt positioniert ist, sollten diese beiden Bezugspunkte auf gleicher vertikaler Höhe liegen und rostral um 4,2 Millimeter voneinander entfernt sein. Andernfalls justieren Sie den Winkel des Nasenstücks. Danach stellen Sie die Spitze der sterilisierten Hamilton-Nadel so ein, dass sie fast die bgma berührt.

Beachten Sie die anterioren, posterioren sowie die mediale-laterale Koordinate dieser Bezugspunkte. Heben Sie die Nadel an und bewegen Sie sie an die gewünschte Position, in diesem Fall 0,5 Millimeter anterior zum Bregma und 2,0 Millimeter lateral zur linken Hemisphäre. Markieren Sie diesen Punkt am Schädel, heben Sie die Hamilton-Nadel vollständig an und beginnen Sie mit dem Bohren.

Es ist wichtig, mit einer intermittierenden Aktion zu bohren, um eine Erwärmung zu verhindern. Nachdem das Loch gebohrt wurde, verwenden Sie warme Kochsalzlösung und sterile Wattestäbchen, um die Knochenrückstände zu entfernen. Benutzen Sie einen zahnärztlichen Kürettierlöffel, um vorsichtig eventuelle Knochenpartikel zu entfernen, und reinigen Sie die Region erneut mit warmer Kochsalzlösung und Wattestäbchen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang des Abtupfens und Abstrichs nach Bedarf, um die Fläche von allen losen Partikeln zu befreien. Überprüfen Sie, ob die Hydroxydopamin-Lösung klar ist. Falls sie einen gelblich-braunen Stich aufweist, entsorgen Sie sie und bereiten Sie eine frische Lösung für eine Gesamtinjektion von 10 Mikrogramm zu.

Laden Sie die Hamilton-Spritze mit zwei Mikrolitern einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Mikroliter auf. Beachten Sie außerdem, dass Sie nach dem Befüllen der Hamilton-Spritze mit sechs Hydroxydopamin die Spritze mit Aluminiumfolie abdecken sollten, um eine Oxidation der Lösung zu verhindern. Plazieren Sie unter dem Beobachtungsmikroskop die Nadelspitze auf der Dura mater und lesen Sie den dorsoventralen Referenzwert ab.

Danach die Hamilton-Spritze langsam in das Hirngewebe einführen. Sobald die gewünschte ventrale Position von 3,0 Millimetern unterhalb der kortikalen Oberfläche erreicht ist, fünf Minuten warten, um dem Gewebe Zeit zur Anpassung an die Nadel zu geben. Vor Beginn der Injektion ist es wichtig, den sechs Hydroxydopamin-Neurotoxin äußerst langsam mit einer Rate von 0,1 Mikrolitern pro Minute zu injizieren.

Das heißt, dieser Injektionsvorgang sollte nicht weniger als 20 Minuten dauern. Sobald das gesamte Volumen von zwei Mikrolitern injiziert wurde, warten Sie fünf Minuten und ziehen Sie dann die Hamilton-Spritze vorsichtig und langsam zurück, sodass die gesamten drei Millimeter innerhalb eines Zeitraums von mindestens fünf Minuten zurückgezogen werden. Reinigen Sie die Stelle gründlich mit einem sterilen Wattestäbchen.

Ziehen Sie anschließend den stereotaktischen Arm und das Mikroskop zurück. Verschließen Sie den Einschnitt mit USP-sechs-Bindestrich-null-Nylonslitzen. In unserem Fall verwenden wir 3-2-4-U-formige Stiche.

Ein lokales Antibiotikum, das Neomycin enthält, kann als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme gegen Infektionen angewendet werden. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Instrument, indem Sie zuerst die Ohrstifte lösen. Danach lösen Sie das Maulstück und heben das Tier am Nackenfell an, um Schäden an den Zähnen des Tieres zu vermeiden.

Belassen Sie das Tier auf der Heizplatte, bis die Sedierung nachgelassen hat und die körpereigene Thermoregulation wiederhergestellt ist. Hydrieren Sie das Tier mit 500 µL warmer steriler Kochsalzlösung, die subkutan an den nächsten beiden Tagen verabreicht wird. Geben Sie nach der Operation 0,2 mL einer Ibuprofen-Suspension zu 100 mL Wasser in die Trinkflasche, um eine postoperative Analgesie zu gewährleisten.

Apomorphin-Rotationstest. Der APO-Morphin-Rotationstest wird im Allgemeinen einen Monat nach der Läsionsinduktion durchgeführt; stellen Sie sicher, dass die APO-Morphin-Lösung klar ist. Füllen Sie eine Dosis von 0,5 Milligramm pro Kilogramm in eine Insulinspritze und injizieren Sie sie subkutan im Nackenfell.

Stellen Sie das Tier in den Testbehälter und lassen Sie es fünf Minuten lang akklimatisieren, anschließend überwachen Sie sein Verhalten weitere fünf Minuten. Das Tier auf der linken Seite erhielt eine Sechs-Hydroxydopamin-Injektion, während das Tier auf der rechten Seite eine Vehikelinjektion einer 0,2%igen Lösung von Abic-Säure, verdünnt in 0,9%iger Natriumchloridlösung, erhielt. Dieses Diagramm zeigt unsere Ergebnisse verschiedener Apomorphin-induzierter Rotationsversuche, die an insgesamt 20 Schweizer Mäusen durchgeführt wurden, davon fünf Kontrolltiere und 15 läsionierte Tiere, einen Monat nach der beschriebenen stereotaktischen Operation.

Schlussfolgerung: Die Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems, doch um die Wirksamkeit verschiedener Therapien untersuchen zu können, ist es entscheidend, über ein gut etabliertes Modell zu verfügen, das den Verlust dopaminerger Neuronen im Mittelhirn reproduziert. Die durch dieses Verfahren hervorgerufenen Läsionen imitieren sehr genau die Auswirkungen der Parkinson-Krankheit, wodurch Forschende in der Lage sind, neue Therapien zu untersuchen, zu entwickeln und zu testen, um dieser verheerenden Erkrankung entgegenzuwirken. Angesichts der zuverlässigen Ergebnisse sowie des einfachen und übersichtlichen Aufbaus des Verfahrens liegt der Reiz dieser Technik auf der Hand.

Viel Erfolg und wir hoffen, dass Ihnen dieses Video bei Ihrer Forschung hilfreich war.